Amplificação de genoma pré-enriquecimento e toda célula alvo para jusante caracterização única célula

O objetivo geral deste procedimento é isolar as células da suspensão celular para disponibilizá-las para análise a jusante de célula única. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no contexto de biópsias líquidas e heterogeneidade celular. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o isolamento baseado em anticorpos de células individuais e sua recuperação para posterior análise genética molecular no nível de célula única.

Uma vez liberada para seu uso em pacientes, essa técnica permitirá a caracterização de células tumorais circulantes de pacientes com câncer. Como esse método pode fornecer informações sobre a heterogeneidade entre células individuais, ele pode ser aplicado a todos os tipos de suspensões celulares contendo subpopulações, como amostras de sangue, amostras de culturas de células ou tecidos e órgãos dissociados. Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez quando usamos um dispositivo de enriquecimento in vivo não capaz de liberar células para fins de análise a jusante.

A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas para a coleta de células individuais usando microdissecção ou micromanipulação a laser são difíceis de executar com sucesso porque o processo de coleta de células únicas é propenso à perda de células e requer um alto nível de especialização. Em um mililitro de meio de cultura de células pré-aquecido, ressuspenda as células marcadas com HT-29 CFSE e deixe-as regenerar a 37 graus Celsius por 30 minutos. Para colher as células, centrifugue a 300 g por três minutos.

Em seguida, ressuspenda o pellet celular em um mililitro de solução de coloração de DNA Hoechst 33342 pronta para uso a 37 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, centrifugue a suspensão celular a 300 g por três minutos. Em seguida, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em quatro mililitros de solução salina tamponada com fosfato 1X.

Em seguida, conte o número de células usando um hemocitômetro e verifique a marcação de fluorescência com microscópio de fluorescência. Em seguida, centrifugar as células a 300 g durante três minutos, rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento a cerca de 500 000 células por mililitro e colocar as células no gelo. Em cinco mililitros de sangue periférico, adicione cerca de 500 a 500.000 células e depois misture invertendo o tubo.

Depois de remover o fio do compartimento de armazenamento, remova a tampa de borracha que prende o fio e lave o fio em solução salina tamponada com fosfato 1X e monte-o na tampa do tubo. Em seguida, incube o tubo em um misturador de rolos inclinado a cinco rotações por minuto por 30 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, enxágue o fio em solução salina tamponada com fosfato 1X três vezes.

Em seguida, armazene o fio em um tubo de 15 mililitros contendo solução salina tamponada com fosfato 1X no escuro. Desenhe uma área retangular em uma lâmina de vidro usando uma caneta de graxa e, em seguida, adicione 500 microlitros de solução salina tamponada com fosfato 1X. Para imergir a parte funcional do fio em solução salina tamponada com fosfato 1X, dobre a parte não funcional do fio e coloque-a na lâmina de vidro.

Para contar o número de células capturadas, inspecione visualmente os dois lados do fio. Após a inspeção, transfira o fio de volta no tubo de 15 mililitros com solução salina tamponada com fosfato 1X e mantenha no escuro. Em um mililitro de solução salina tamponada com fosfato 1X, dissolva quatro miligramas do componente tampão de liberação e, em seguida, filtre a solução através de um filtro estéril de 0,2 micrômetro para obter o tampão pronto para uso.

Em seguida, aqueça o tampão de liberação a 37 graus Celsius por cinco minutos. Depois de aquecido, transfira 1,6 mililitros de tampão de liberação para encher completamente um tubo de reação de 1,5 mililitro. Em seguida, incube a parte funcional do fio no tampão de liberação a 37 graus Celsius em banho-maria por 20 minutos.

Após a incubação, coloque o fio em um agitador a 500 rotações por minuto por 15 minutos. Em seguida, centrifugue o fio a 300 g por 10 minutos. Terminada a centrifugação, desloque o fio do tubo, feche a tampa e centrifugue novamente o tubo a 300 g por 10 minutos.

Para diminuir o volume da suspensão celular, descarte todos, exceto 100 microlitros de sobrenadante para micromanipulação ou 300 microlitros para citocentrifugação subsequente e microdissecção a laser. Em seguida, prossiga rapidamente para a amostragem de célula única. Para micromanipulação, transfira todos os 100 microlitros de suspensão celular para uma lâmina de vidro.

Em seguida, coloque a lâmina de vidro em um microscópio equipado com um micromanipulador e deixe as células assentarem por cinco minutos. Em seguida, em tubos de PCR de 0,2 mililitro, pipete dois microlitros de mistura mestre de lise celular e transfira para o gelo. Use o micromanipulador para coletar uma única célula em um microlitro de solução salina tamponada com fosfato 1X.

Em seguida, transfira a célula diretamente para dois microlitros de mistura master de lise celular. Use uma microcentrífuga de mesa para girar rapidamente as amostras a 2.000 g por três segundos para coletar o líquido no fundo do tubo. Em seguida, transfira a amostra no gelo e prossiga para a amplificação do genoma completo baseada no adaptador-ligante.

Aspire apenas uma célula usando um microlitro de tampão no máximo. Ao transferir a célula para a solução de lise, certifique-se de ver bolhas surgindo da solução, indicando que todo o volume aspirado foi transferido. Para microdissecção a laser, citocentrifugue todos os 300 microlitros de suspensão celular em uma lâmina revestida de membrana a 300 g por cinco minutos.

Em seguida, coloque a lâmina revestida de membrana em um microscópio capaz de microdissecção a laser. Em seguida, pipete 4,5 microlitros de mistura mestre de lise celular na tampa do tubo de PCR de 0,2 mililitro. Coloque a tampa acima da amostra e colha uma única célula por microdissecção a laser.

Logo em seguida, verifique se há células isoladas na tampa de PCR, remova o tubo de PCR do microscópio de microdissecção a laser e feche o tubo. Colete todo o líquido no fundo do tubo com uma rotação curta. Transfira a amostra no gelo e prossiga para a amplificação do genoma completo baseada no adaptador-ligante.

Certifique-se de recuperar a célula microdissecada a laser. Portanto, é importante cobrir toda a tampa do tubo com a solução de lise. Após a microdissecção, verifique a presença da célula na tampa do tubo.

Para mostrar as células que estão coradas com CFSE e Hoechst 33342, a imagem de imunofluorescência foi feita antes de carregar o fio, durante as células sendo conectadas ao fio, depois separadas do fio e, finalmente, na lâmina. As imagens de imunofluorescência das células antes do carregamento mostram coloração nucleica brilhante em azul, enquanto o citoplasma das células mostra coloração verde CFSE com intensidade intercelular heterogênea. Padrão de coloração semelhante também é observado para células que são anexadas e subsequentemente separadas do fio.

Para verificar a qualidade de todos os produtos de amplificação do genoma, um gel de 1% de agarose foi executado. O gel de agarose mostra um esfregaço de DNA variando de 0,2 a mais de 1 quilobase para os produtos de PCR de amplificação do genoma completo. Os produtos de PCR de controle de qualidade 4plex obtidos a partir de uma única célula produzem produtos de 100, 200, 300 e 400 pares de bases.

Os produtos que apresentam menos de três faixas são excluídos da análise posterior. Uma vez dominada, essa técnica permite o isolamento de células únicas de suspensões celulares em quatro horas, se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter as células submersas no tampão, especialmente durante o tempo em que as células estão presas ao fio para evitar danos às células.

Seguindo este procedimento, métodos de análise como hibridização genômica comparativa de área, sequenciamento de próxima geração e PCR específico do alvo podem ser realizados para caracterizar células únicas com base em variações e mutações no número de cópias. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar e recuperar células de suspensões celulares usando um fio funcionalizado e como amostrar células únicas para várias análises genéticas moleculares a jusante. Não se esqueça de que trabalhar com sangue humano apresenta a possibilidade de infecção, portanto, o uso de luvas e jaleco é obrigatório durante a realização deste procedimento.