Name: Amplificação de genoma pré-enriquecimento e toda célula alvo para jusante caracterização única célula (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Aprenda a isolar células raras de suspensões celulares usando fio funcionalizado para análise genética de célula única. Este método permite caracterizar células tumorais circulantes em biópsias líquidas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este estudo foi financiado pelo fundo de ciência o austríaco (FWF), projeto-não. Eu 1220-B19 (para PS) como parte do projecto ERANET em translacional Cancer Research (TRANSCAN) "Células de tumor de circulação como biomarcador para doença Residual mínima no câncer de próstata (CTC-SCAN)". Doutorando S.C. foi treinado dentro do quadro do programa de PhD Medicina Molecular da universidade médica de Graz. Os autores reconhecem com gratidão Nina Schlögl, Daniel Kummer, Gabi Wendt, Claudia Chudak, Julia Schulz e Johanna Schiller para sua assistência técnica especializada. Os autores graças Georg Peinhaupt para suporte de design gráfico.

<ol><li>Saucedo-Zeni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+in+vivo+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+peripheral+blood+of+cancer+patients+using+a+functionalized+and+structured+medical+wire%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire.</a> Int J Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).</li>
<li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+and+Molecular+Characterization+of+Tumor+Cells+in+Lung+Cancer+Patients+Using+a+Novel+In+Vivo+Device+for+Capturing+Circulating+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells.</a> Clin Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).</li>
<li>Kuske, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+detection+of+circulating+tumor+cells+in+non-metastatic+high-risk+prostate+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep-UK%22%5BJournal%5D)">Improved detection of circulating tumor cells in non-metastatic high-risk prostate cancer patients.</a> Sci Rep-UK. 6 (1), (2016).</li>
<li>van Beers, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+PCR+predictor+for+aCGH+success+of+FFPE+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">A multiplex PCR predictor for aCGH success of FFPE samples.</a> Brit J Cancer. 94 (2), 333-337 (2006).</li>
<li>El-Heliebi, A., Chen, S., Kroneis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Multiplex+PCR+for+Assessing+the+Quality+of+Whole+Genome+Amplified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using Multiplex PCR for Assessing the Quality of Whole Genome Amplified DNA.</a> Methods Mol Biol. 1347, 119-128 (2015).</li>
<li>Möhlendick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Robust+Method+to+Analyze+Copy+Number+Alterations+of+Less+than+100+kb+in+Single+Cells+Using+Oligonucleotide+Array+CGH%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Robust Method to Analyze Copy Number Alterations of Less than 100 kb in Single Cells Using Oligonucleotide Array CGH.</a> PLoS ONE. 8 (6), e67031(2013).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+and+Release%3A+rare+cell+analysis+from+a+functionalised+medical+wire%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep-UK%22%5BJournal%5D)">Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire.</a> Sci Rep-UK. 7, 43424(2017).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+and+molecular+characterization+of+circulating+tumor+cell+using+an+in+vivo+capture+system+in+squamous+cell+carcinoma+of+head+and+neck%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enumeration and molecular characterization of circulating tumor cell using an in vivo capture system in squamous cell carcinoma of head and neck.</a> Chin J Cancer Res. 29 (3), 196-203 (2017).</li>
<li>Carter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+circulating+tumor+cells+identifies+distinct+copy-number+profiles+in+patients+with+chemosensitive+and+chemorefractory+small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of circulating tumor cells identifies distinct copy-number profiles in patients with chemosensitive and chemorefractory small-cell lung cancer.</a> Nat Med. 23 (1), 114-119 (2017).</li>
<li>Luca, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+single+circulating+tumor+cells+by+next+generation+sequencing+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of single circulating tumor cells by next generation sequencing in metastatic breast cancer.</a> Oncotarget. , (2016).</li>
<li>Aravanis, A. M., Lee, M., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-Generation+Sequencing+of+Circulating+Tumor+DNA+for+Early+Cancer+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Next-Generation Sequencing of Circulating Tumor DNA for Early Cancer Detection.</a> Cell. 168 (4), 571-574 (2017).</li>
<li>Page, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+Generation+Sequencing+of+Circulating+Cell-Free+DNA+for+Evaluating+Mutations+and+Gene+Amplification+in+Metastatic+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Next Generation Sequencing of Circulating Cell-Free DNA for Evaluating Mutations and Gene Amplification in Metastatic Breast Cancer.</a> Clin Chem. 63 (2), 532-541 (2017).</li>
<li>Kalinich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-based+signature+enables+high+specificity+detection+of+circulating+tumor+cells+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">An RNA-based signature enables high specificity detection of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma.</a> P Natl Acad Sci USA. 114 (5), 1123-1128 (2017).</li>
<li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accession+of+Tumor+Heterogeneity+by+Multiplex+Transcriptome+Profiling+of+Single+Circulating+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Accession of Tumor Heterogeneity by Multiplex Transcriptome Profiling of Single Circulating Tumor Cells.</a> Clin Chem. 62 (11), 1504-1515 (2016).</li>
<li>Sinkala, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+protein+expression+in+circulating+tumour+cells+using+microfluidic+western+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Profiling protein expression in circulating tumour cells using microfluidic western blotting.</a> Nat Commun. 8, 14622(2017).</li>
<li>Morrow, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumourigenic+non-small-cell+lung+cancer+mesenchymal+circulating+tumour+cells%3A+a+clinical+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Tumourigenic non-small-cell lung cancer mesenchymal circulating tumour cells: a clinical case study.</a> Ann Oncol. 27 (6), 1155-1160 (2016).</li>
<li>Williamson, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculogenic+mimicry+in+small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Vasculogenic mimicry in small cell lung cancer.</a> Nat Commun. 7, 13322(2016).</li>
<li>Czyż, Z. T., Stoecklein, N. H., Polzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Microdissection+of+FFPE+Tissue+Areas+and+Subsequent+Whole+Genome+Amplification+by+Ampli1TM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser Microdissection of FFPE Tissue Areas and Subsequent Whole Genome Amplification by Ampli1TM.</a> Methods Mol Biol. 1347, 141-162 (2015).</li>
<li>Czyż, Z. T., Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministic+Whole-Genome+Amplification+of+Single+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Deterministic Whole-Genome Amplification of Single Cells.</a> Methods Mol Biol. 1347, 69-86 (2015).</li>
<li>Kroneis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+retrieval+of+single+microchimeric+cells+and+verification+of+identity+by+on-chip+multiplex+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Automatic retrieval of single microchimeric cells and verification of identity by on-chip multiplex PCR.</a> J Cell Mol Med. 14 (4), 954-969 (2010).</li>
<li>Kroneis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Molecular+Genetic+and+Cytogenetic+Analysis+from+Single+Cells+after+Isothermal+Whole-Genome+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Combined Molecular Genetic and Cytogenetic Analysis from Single Cells after Isothermal Whole-Genome Amplification.</a> Clin Chem. 57 (7), 1032-1041 (2011).</li>
<li>Kroneis, T., Jonasson, E., Andersson, D., Dolatabadi, S., Ståhlberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+preamplification+simplifies+targeted+mRNA+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep-UK%22%5BJournal%5D)">Global preamplification simplifies targeted mRNA quantification.</a> Sci Rep-UK. 7, 45219(2017).</li>
<li>Picelli, S., Faridani, O. R., Bjorklund, A. K., Winberg, G., Sagasser, S., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).</li>
<li>El-Heliebi, A., Heitzer, E., Kroneis, T., Chen, S., Haudum, C., Fuchs, J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-319-53661-3_12">Potential and Challenges of Liquid Biopsies.</a> Mechanisms of Molecular Carcinogenesis. 2, 233-261 (2017).</li>
<li>Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24556840">Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (3), 178-196 (2014).</li>
<li>Ferreira, M. M., Ramani, V. C., Jeffrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S157478911600017X">Circulating tumor cell technologies.</a> Mol Oncol. 10 (3), 374-394 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo descrito visa recuperar as células de um fio funcionalizado (referido como dispositivo) para ex vivo célula única análise genômica. Nós testamos três linhas de célula EpCAM-positivo (HT-29, LNCaP e CV), mas em princípio, este método pode ser aplicado a qualquer linha de células expressando EpCAM. Nas células-alvo EpCAM positivo podem ser apresentadas para o dispositivo como suspensão de células puro (ver 2.1) ou misturadas em um excesso de células de fundo (EG. periférica sangue, ver 2.2.). Considerando que, especialmente este último pode ser usado para testar as capacidades de isolamento em condições raras células, ajuste fino do número de células anexado ao fio pode ser feito usando o baixo volume descrito abordagem (ver ponto 2.3.). Como as diferenças entre as linhas de célula são esperadas, densidades de celular adequada para carregar o fio, rotação velocidade, bem como o tempo de incubação precisam ser testadas empiricamente, avaliando o número de células anexados usando um microscópio de imunofluorescência.
Para aplicações a jusante genômicas a nível de célula única WGA, é necessária. O método WGA de escolha pode diferir entre laboratórios e, em princípio, nosso método é aberto a todos os métodos que pode manipular as amostras obtidas de micromanipulação ou laser microdissection. Neste protocolo, usamos um método baseado em DNA enzimaticamente fragmentado devido a um melhor desempenho em comparação com um calor-fragmentação baseada WGA7. Células opcionais, única podem ser encaminhadas para WGA isotérmico permitindo subsequente DNA profiling20,21.
O protocolo descrito visa recuperar células intactas depois de ser anexado a uma nova geração de fios funcionalizados para análise genômica de célula única. A primeira geração de fios funcionalizados, que também representam os dispositivos de enriquecimento apenas CE-aprovado na vivo no mercado até agora, foram usada para enumerar CTC em pacientes com câncer metastático. Publicações anteriores e nossos próprios dados sugerem que a técnica de isolamento na vivo para ser mais sensível em comparação com a tecnologia atual padrão-ouro2. Assim, equipar esta técnica de isolamento na vivo com um recurso de recuperação como perceberam no dispositivo permite combinar alta recuperação do CTC com caracterização a nível de célula única.
No entanto, o dispositivo não está liberado para o uso em pacientes, portanto, não estão disponíveis dados clínicos. Ex vivo aplicações (ou seja, isolando o CTC do sangue periférico após a amostragem) não são recomendados porque a tecnologia é adaptada para as configurações presentes no cubital vaidoso, por exemplo, baixo diâmetro do vaidoso (aumentando a probabilidade de contato entre CTC e anticorpos de capturando direto) e tempo de retenção longa (30 min, permitindo que 2-3 L de sangue para passar o fio). No entanto, conforme descrito na seção 2.2. nas células-alvo também podem ser isoladas de amostras misturadas7.
Uma limitação atual do método é a recuperação ineficiente de células não fixadas após o desprendimento de fios. Isso, no entanto, pode ser melhorado por uma etapa de fixação de célula antes do tratamento de desprendimento.
Em resumo, este protocolo é um primeiro passo para o uso combinado de uma técnica de isolamento na vivo com recuperação de células para caracterizar geneticamente células únicas. Os esforços no sentido necessidade de abordar a otimização da recuperação celular e liberação para a sua aplicação em pacientes1,2. No entanto, a medicina personalizada para decisões de terapia e acompanhamento do tratamento é além da enumeração do CTC. Assim, esse método é um primeiro passo para a caracterização genômica de CTC no nível da célula única.
Aplicações para análise do transcriptoma de célula única parecem viáveis como são colhidas células intactas. No entanto, ela continua a ser avaliado se o processo de recuperação tem um impacto na integridade do RNA (por exemplo, células únicas recuperadas para lise direta, seguido por RT-qPCR22de encaminhamento). Se for bem-sucedido, caracterização de células únicas (por exemplo, CTC) pode ser deslocada para o nível de transcriptoma, permitindo análises mais detalhadas. A este respeito, RNA-seq usar Smart-seq2 fornece uma ferramenta valiosa para análise a jusante de RNA de células únicas como o cDNA pré-amplificado (obtido durante a preparação do RNA-seq biblioteca) pode ser submetido a PCR quantitativo. Isto irá permitir uma análise baseada em triagem de células únicas recuperado22,23e destino combinado.
Os fios funcionalizados atuais são baseados em anticorpos anti-EpCAM que é um marcador epitelial amplamente utilizado para a seleção positiva de CTC24. Como vários CTC pode downregulate marcadores epiteliais como citoqueratinas ou EpCAM25, adição de anticorpos como HER2/new aumentaria a chance de isolamento do CTC. Vários anticorpos baseado enriquecimento estratégias foram desenvolvidas e revistas por Ferreira et al. em 2016,26. Uma mistura de anticorpos imobilizados em um fio poderia ser uma futura melhoria da tecnologia levando para o isolamento de um número maior e subtipos adicionais do CTC.
É obrigatório para todas as etapas envolvendo o fio para manter a parte funcional do fio submergido na solução a fim de manter a sua funcionalidade de manipulação. Recomendamos colocar o fio no 1X PBS durante a avaliação (microscópio; ex. 3.1 os passos. -3.3.) e armazenamento. Para evitar coloração inadequada, recomendamos usando recém preparada solução coloração em etapas 1.2.1. e 1.2.2. Células fracamente coradas dificultam a célula contando com o fio e podem originar a subestimação das células anexadas.
É necessário evitar entupimento da pipeta Pasteur com a tampa de borracha ao inserir o fio na pipeta Pasteur para carregamento subsequente da suspensão celular (passo 2.3.4.). A tampa de borracha é usada para prender o fio no lugar para que a parte funcional situa-se dentro a ponta da pipeta Pasteur. Se a tampa está ligada também firmemente para a retaguarda da pipeta Pasteur, carregamento de suspensão de célula não é possível. Nesse caso, facilitar a tampa tal que o ar que é deslocado pela suspensão celular carregado pode deixar a pipeta.
Dobrar o fio é crucial para sua orientação durante a célula contando em etapas 3.2. e 3.3. Monte os fios usando a fita adesiva de tal forma que a extremidade não-funcional do fio vem mentir para um lado. Após a digitalização de todo o comprimento da parte funcional, o fio é rolado 180°, então a outra metade do fio funcional pode ser digitalizada. Este passo é importante para os primeiros experimentos avaliar o número de células no fio. Uma vez que o número de células para uma determinada linha celular e procedimento é avaliado, o procedimento pode ser repetido sem contagem de células (ex. apenas verificar a presença de células ou omitir esta etapa). Pipetagem cuidadosa é fundamental para evitar a perda de células quando a redução do volume do líquido sobrenadante na etapa 4.8. Certifique-se de pipetagem é feito suavemente, sem causar turbulências para a pelota.

Recentemente, CellCollector DC01, um médico fio acrescido com anticorpos anti-EpCAM para isolar o CTC de sangue periférico de pacientes com câncer, foi adicionado ao espectro metódico de CTC enumeração1,2,3 . Em um estudo atualmente em curso no câncer de próstata não-metastático, este fio funcionalizado relata quase duas vezes mais pacientes para ser positivo de CTC e maior CTC conta em pacientes de CTC-positivos em comparação com o CellSearch, o padrão-ouro na enumeração CTC3 . Devido a esse desempenho animador, isolamento de células de um fio funcionalizado médica para análise de célula única seria desejável, mas tratamento enzimático com soluções de desprendimento de células (por exemplo, a tripsina), nem do laser microdissection permite a recuperação de células intactas (dados não mostrados).
Para permitir o desprendimento de células capturadas, uma nova geração de fios funcionalizados foi equipada com um polímero específico. Este polímero, que liga os anticorpos de captura para o fio, é suscetível a um tratamento de tampão de lançamento permitindo o desprendimento de células intactas (CellCollector DC03 referido como dispositivo). O novo dispositivo funcionalizado, permite o isolamento das células-alvo de diferentes concentrações de célula linha as células cancerosas cravadas em albumina de soro bovino (BSA) / tampão fosfato salino (PBS) e sangue periférico, respectivamente.
Para facilitar a detecção visual de células no dispositivo e após a recuperação, as células cancerosas do alvo são rotuladas com carboxyfluorescein succinimidil éster (CFSE) e uma mancha de DNA antes do tratamento de recuperação (i. e. carregamento e desanexação). Efeitos do tratamento sobre a qualidade do DNA de células únicas anteriormente foram avaliados após o WGA por meio de um controle de qualidade do PCR4,5, matriz-CGH6,7 e alvo de sequenciamento7 não mostrando nenhuma diferença em comparação com células não-tratados micromanipulated de célula suspensões7. A vantagem deste método reside na combinação de pre-enriquecimento raro-célula-alvo e a recuperação de células para análise a jusante de célula única (Figura 1). O dispositivo de recolha com rótulo CE na vivo atual é usado geralmente para enumeração de CTC, ao invés de caracterização molecular de célula única2,8. No entanto, uma análise mais abrangente para investigar a heterogeneidade entre CTC tempo para análise a nível de célula individual (ou seja, alvejado de sequenciamento no nível de célula única). Outros métodos baseados em células baseiam-se na Fima isolamento do CTC EpCAM-positivo e manipulação de célula única baseada em Dieletroforese para posterior análise genética molecular9,10. Caracterização molecular do CTC é um requisito importante para a sua aplicação útil em um ambiente clínico e é igualmente importante na investigação de base da cascata metastática. Paralelamente à CTC, DNA de tumor circulantes (ctDNA) tornou-se de grande importância pois permite a análise de DNA dos encargos tumor com procedimentos de isolamento técnico mínimo11,12. As abordagens de célula com base podem servir como uma contribuição complementar pois permite RNA13,14 e proteína15 análise da expressão e também para CTC derivado da célula culturas ou xenografts16, 17. embora obstáculos como célula baixa recuperação e autorização para o uso em pacientes ainda precisam ser superados, o método de captura e libertação leva um importante passo na próxima para caracterização das células-alvo rara.

<table><tbody><tr><td>Tampão de Liberação Gilupi</td><td>Gilupi</td><td>GIL083</td><td>Usado para separar células do fio</td></tr><tr><td>McCoy's 5A Medium (1x) suppl. com L-Glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16600-082</td><td>Meio de cultura usado para células HT-29, adapte o meio de cultura à linha celular usada para os experimentos</td></tr><tr><td>Solução Tampão HEPES (1 M)</td><td>PAA</td><td>S11-001</td><td>Suplemento para McCoy's 5A Medium</td></tr><tr><td>Suplemento de Soro Bovino Fetal Gold</td><td>PAA</td><td>A15-151</td><td>para McCoy's 5a Modificado</td></tr><tr><td>Médio Penicilina-Estreptomicina (100x)</td><td>Biowest</td><td>L0018-100</td><td>Suplemento para McCoy's 5a Modificado</td></tr><tr><td>Meio Fosfato Tampolado Salino (1x PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Biowest</td><td>L0950-100</td><td>Solução de descolamento celular (cultura de células)</td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>GFL</td><td>Tipo 1003</td><td>Utilizado para soluções de pré-aquecimento</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Utilizado para incubar células (cultura de células)</td></tr><tr><td>Tubos de reação de 50 mL</td><td>VWR</td><td>525-0403</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de rolos</td><td>Stuart Scientific</td><td>SRT6D</td><td>Utilizado para fixar células ao fio, evitando a sedimentação das células</td></tr><tr><td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34554</td><td>Usado para marcar células vivas (marcador citoplasmático)</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>H3570</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Usado para colorir DNA (contracoloração nucleica)</td></tr><tr><td>Centrífuga (equipada para segurar tubos de reação de 15 mL e 50 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Heraeus Megafuge 40R</td><td>Usado para peletizar células</td></tr><tr><td>Observer Z1 (microscópio de microdissecção a laser/fluorescência)</td><td>Carl Zeiss Microimaging</td><td></td><td>Microscópio invertido (imunofluorescência) capaz de microdissecção a laser; Os microscópios de fluorescência devem ser capazes de detectar Hoechst 33342 (filtro DAPI) e CFSE (filtro FITC)</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td>Usado para revestir superfícies de vidro/plástico</td></tr><tr><td>MS1 Minishaker</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z404039</td><td>Usado para vórtice</td></tr><tr><td>Tubos Vacutainer EDTA (ou Na-heparina)</td><td>BD</td><td>366450 (ou 366480)</td><td>Usado como tubo de reação para captura ex vivo de células-alvo</td></tr><tr><td>Detektor CANCER03 DC03</td><td>Gilupi</td><td>GIL003</td><td>Fio funcionalizado capaz de isolar e separar células positivas para EpCAM (também conhecido como catch& lançamento, C& R)</td></tr> <tr><td>Agulhas de seringa (G20)</td> <td>VWR</td><td>613-0554</td><td>Usado para perfurar tampas de borracha para permitir que a parte não funcional do C & R para conduzir através dele</td></tr><tr><td>Câmara de Neubauer</td><td>Roth</td><td>T729.1</td><td>Usado para contar células</td></tr><tr><td>Pipetas de Pasteur 150 mm</td><td>Volac</td><td>D810</td><td>Usado para a aplicação de baixo volume de células ao C& </td></tr><tr><td>R Caneta de graxa</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td>Usada em lâminas de vidro para manter a suspensão da célula no lugar</td></tr><tr><td>Filtro de seringa estéril (0.2 &micro; m)</td> <td>Corning</td><td>431219</td><td>Para filtrar Gilupi Release Buffer</td></tr><tr><td>Delfia PlateShaker</td><td>Perkin Elmer</td><td>1296-003</td><td>Usado para agitação durante o desprendimento celular</td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30,125,150</td><td></td></tr><tr><td>Ampli1 WGA Kit</td><td>Silicon Biosystems</td><td></td><td>A ser encomendado via Silicon Biosystems</td></tr><tr><td>Axiovert M200 equipado com Mikromanipulator MMJ e CellTram vario</td><td>Zeiss/Eppendorf</td><td></td><td>Use micromanipulação à mão</td></tr><tr><td>Microcapilares (25 &micro; m de diâmetro), CustomTip Tipo I</td><td>Eppendorf</td><td>930001201</td><td>Usado para micromanipular células</td></tr><tr><td>Tubos de PCR de 0,2 mL</td><td>Biozym</td><td>710920</td><td></td></tr><tr><td>Citocentrífuga e equipamento</td><td>Hettich</td><td>Universal 32</td><td>Use citocentrífuga à mão</td></tr><tr><td>Termocicladora</td><td>Bio-Rad</td><td>DNA Engine Díade</td><td>Cada termocicladora com tampa aquecida pode ser usada</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Roth</td><td>CX73.1</td><td>Use centrífuga de mesa à mão</td></tr><tr><td>MembraneSlide 1.0 PET</td><td>Zeiss</td><td>415101-4401-050</td><td>Lâminas de vidro revestidas com membrana usadas para microdissecção</td></tr><tr><td>a laser UV Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td>400072</td><td>Use reticulador de DNA à mão</td></tr><tr><td>Reagentes</td><td></td><td></td><td></td>PCR padrão</tr><tr><td>6x Carregamento de DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0611</td><td>Use gel carregando corante à mão</td></tr><tr><td>Escada de DNA</td><td>BioLabs</td><td>N0551G</td><td>Use escada de 100 bp à mão</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>Estação de eletromorfose em gel</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Use sistema de eletroforese à mão</td></tr><tr><td>Gel Red Nucleic Acid Stain</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>Corante intercalante para visualização de DNA Em géis de agarose</td></tr></tbody></table>

amplificação de genoma pré-enriquecimento e toda célula alvo para jusante caracterização única célula

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Nas células-alvo rara podem ser isoladas de um fundo elevado de células não-alvo, usando anticorpos específicos para proteínas de superfície das células alvo. Um método recentemente desenvolvido utiliza um fio médico acrescido com células antiadesão epiteliais molécula (EpCAM) anticorpos específicos na vivo isolamento circulantes de tumor de células (CTC)1. Uma coorte de paciente-combinadas em câncer de próstata metastático-não mostrou que a técnica de isolamento na vivo resultou em uma maior percentagem de pacientes positivos para CTC, bem como a maior contagem de CTC, em comparação com o atual padrão-ouro na enumeração de CTC. Como células não podem ser recuperadas de dispositivos médicos atuais, um novo fio funcionalizado (referido como dispositivo) foi fabricado que permite a captura e subsequente desprendimento de células por tratamento enzimático. As células são permitidas para anexar ao dispositivo, visualizada em um microscópio e desanexado usando tratamento enzimático. Células recuperadas são citocentrifugados em slides membrana revestida e colhidas individualmente por meio do laser microdissection ou micromanipulação. Monocelulares amostras são então submetidas a amplificação do genoma inteiro de célula única permitindo análise múltipla a jusante, incluindo abordagens de triagem e destino-específicos. O procedimento de isolamento e recuperação produz alta qualidade DNA de células únicas e não afecte a amplificação do genoma inteiro subsequente (WGA). DNA amplificado de uma única célula pode ser encaminhado para triagem e/ou alvo de análise tais como hibridação de matriz comparativa do genoma (matriz-CGH) ou arranjar em sequência. O dispositivo permite ex vivo isolamento de amostras de células raras artificial (ou seja, 500 células alvo cravadas em 5 mL de sangue periférico). Considerando que taxas de desprendimento de células são aceitável (50-90%), a taxa de recuperação de células destacadas em slides abrange uma ampla gama de dependente da linhagem celular usada (< 10 - > 50%) e precisa de mais atenção. Este dispositivo não é liberado para o uso em pacientes.

Células após CFSE e coloração ácidos nucleicos podem ser avaliadas usando um microscópio de imunofluorescência equipado com filtros para DAPI e FITC. Núcleos apresentam-se com um corante de contraste brilhante no canal DAPI enquanto citoplasma das células mostrar rotulagem uniforme com CFSE com intensidade de inter celular heterogênea (Figura 2A e 2E). Forma semelhante e as intensidades de coloração são esperadas de células anexadas ao fio (Figura 2B e 2F), bem como retirados o fio e recuperados em um slide (Figura 2D e 2h).
Densidades de pilha elevada (por exemplo, &gt; 1 000 000 células/mL) pode resultar em uma cobertura total do fio com células quando os fios de carga. No entanto, baixa densidade celular, mudanças na velocidade de rotação durante a incubação e o uso de linhas celulares diferentes afetam a eficiência do isolamento e precisam ser testados separadamente. Quando os fios foram incubados com 5 mL de células HT-29 no 100 000 células / mL como descrito na secção 2.1., média de 254 ± 103 células (n = 5) foram capturados nos fios. Com a mesma experiência usando células LNCaP, média de 440 ± 319 células (n = 5) por fio foi obtido.
Apresentar as células HT-29 500, 5 000 e 50 000 em um plano de 5 mL de sangue periférico para fios (de acordo com o protocolo secção 2.2.) resultou na captura de 75 ± 18 células, 25 ± 9 células e 47 ± 57 células (n = 3, cada), respectivamente. Se o fio é acusado de 15 µ l de suspensão de células (1 000 000 células/mL), de acordo com o protocolo na seção 2.3., até a 1 000 (HT-29), as células podem anexar a um fio.
Celular eficiências de desprendimento variou de 81% nas células HT-29 (range 54,9 93,2% e n = 5) para 81% (escala 63.51 92.87%, n = 6) e 91% (faixa de 84,7% - 95,3%, n = 6) em LNCaP e capnografia células, respectivamente. Da mesma forma, a recuperação de células desanexadas difere entre linhagens celulares: uma média de 28% de desanexado células HT-29 foram recuperadas por citocentrifugação. Considerando que a taxa de recuperação para LNCaP foi inferior a 10%, a taxa de recuperação média para células CV foi 55%.
Aproximadamente 75% de células únicas submetidas a produtos WGA WGA rendimento da alta qualidade: Este é o 1) esfregaço de produtos WGA, variando de 0,1 a &gt; 1 kb (Figura 4, painel superior) e 2) três ou quatro bandas na qualidade 4plex controlam PCR (Figura 4, painel de fundo) . Produtos WGA podem ser usados para 1) matriz-CGH perfis que correspondem aos critérios de qualidade de célula única matriz-CGH perfis 6,7 e 2) alvo NGS após re-amplificação WGA 7.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig1.jpg"> Figura 1: fluxo de trabalho para isolar e recuperar as células alvo para análise de célula única. (A) as células são cultivadas a confluência de 90%, e (B) colhidas para obter uma suspensão de célula única. Depois da coloração com CFSE e ácidos nucleico mancha, (C) o fio funcionalizado é incubado na presença de células em um volume de 5 mL, utilizando tubos de reação ou em um volume baixo usando a ponta da pipeta Pasteur. Este último permite aplicação de volumes de suspensão celular tão baixo quanto 15 µ l. (D) células precisam ser destacado dentro de 4 h após o carregamento. Portanto, o fio é colocado em um tubo de reação de 1,5 mL cheio com liberação buffer. Após a incubação de 15 min em uma cadeira de balanço e centrifugação 10 min, o fio é removido e a suspensão celular é centrifugada para as células de Pelotas. (E) Recovered células são ou transferidas para uma lâmina de vidro para micromanipulação de célula única (topo) ou citocentrifugados numa lâmina de membrana revestida e encaminhadas para laser microdissection (parte inferior). (F) finalmente, colhidas células únicas são amplificadas por meio de amplificação do genoma inteiro (WGA). WGA produtos são compatíveis com a matriz-CGH e análise a jusante de alvo NGS. Epítopo EpCAM: círculo verde na superfície da célula. Acrescida de fio: dispositivo, cinzas fios triplo-helicoidal. Polímero: linhas roxas. Anticorpos anti-EpCAM: laranja. Liberar a atividade de tampão: seta vermelha. Marcador de gordura para manter a suspensão de células no local: elipse azul escuro. Suspensão de células se recuperou: azul claro. Capilar para micromanipulação: preto de linha. Ampliação: célula recuperada colhida por micromanipulação, cytospin na membrana-coberto slide contendo células recuperadas (elipse preenchida cinza). Ampliação: célula recuperada sendo laser microdissected (cinza linha circular: membrana de slide de membrana, servindo como espinha dorsal para o laser microdissection), objetiva com raio laser (linha azul aproximando-se o slide de membrana de baixo). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig2.jpg"> Figura 2: visualização de células rotuladas. (A, E) As células antes de carregar: as células são marcadas com CFSE e counterstained com um DNA intercalante tintura mostrando uma intensidade de sinal do intervalo de CFSE (verde). (B,F) Células rotuladas capturadas no fio. (C,G) Fio após procedimento de célula-destacamento. (D,H) Células desanexado do fio e recuperaram por citocentrifugação numa lâmina. CFSE: Canal FITC (verde). Mancha de DNA: canal DAPI (azul). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig3.jpg"> Figura 3: compartimento do fio e armazenamento. (A) compartimentos do fio. (B) detalhe da parte funcionalizada. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig4.jpg"> Figura 4: controle de qualidade dos produtos WGA obtidos de células única micromanipulated. Painel superior: produtos WGA obtidos de células únicas normalmente resultam em DNA manchas variando de 0,2 kb a &gt; 1,0 kb com o pico de intensidade em cerca de 0,5 kb. Número de amostras 1, 7 e 13 (indicados com asteriscos) Mostrar qualidade inferior ou sem DNA manchas. Painel inferior: WGA produtos são de qualidade suficiente, se a 4plex PCR produz três ou quatro de quatro produtos PCR (em 100, 200, 300 e 400 bp). Amostras de 1, 7, 10 e 13 mostram menos de três bandas e seriam excluídas uma análise mais aprofundada. Lane M contém uma escada bp 100 e asteriscos indicam as amostras insuficiente WGA da qualidade do produto. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Sequência da primeira demão</td>
			<td>NOTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-gtt cca ata tga ttc cac cc-3 '</td>
			<td>cartilha de frente 100 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-ctc ctg gaa gat ggt gat gg-3 '</td>
			<td>primeira demão reversa de 100 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-agg tgg agc amordaçar agc de gct-3 '</td>
			<td>cartilha de frente 200 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-ttt tgc ggt gga aat gtc ct-3 '</td>
			<td>primeira demão reversa de 200 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-agg tga gac att ctt gct gg-3 '</td>
			<td>primeira demão para a frente de 300 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-tcc ato aac cag tca gcg tc-3 '</td>
			<td>primeira demão reversa de 300 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-aca gtc gato gcc atc ato gc-3 '</td>
			<td>primeira demão para a frente de 400 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-gct tga caa agt ggt cgt tg-3 '</td>
			<td>primeira demão reversa de 400 bp</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Sequências de Primer para controle de qualidade 4plex PCR

Este protocolo é para recuperar e preparar células alvo rara de uma mistura com células de fundo não-alvo molecular caracterização genética a nível de célula única. Qualidade do DNA é igual a não-tratados de células únicas e permite a aplicação de célula única (ambos triagem com base e direcionados a análise).

Amplificação de genoma pré-enriquecimento e toda célula alvo para jusante caracterização única célula

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar as células da suspensão celular para disponibilizá-las para análise a jusante de célula única. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no contexto de biópsias líquidas e heterogeneidade celular. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o isolamento baseado em anticorpos de células individuais e sua recuperação para posterior análise genética molecular no nível de célula única.Uma vez liberada para seu uso em pacientes, essa técnica permitirá a caracterização de células tumorais circulantes de pacientes com câncer. Como esse método pode fornecer informações sobre a heterogeneidade entre células individuais, ele pode ser aplicado a todos os tipos de suspensões celulares contendo subpopulações, como amostras de sangue, amostras de culturas de células ou tecidos e órgãos dissociados. Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez quando usamos um dispositivo de enriquecimento in vivo não capaz de liberar células para fins de análise a jusante.A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas para a coleta de células individuais usando microdissecção ou micromanipulação a laser são difíceis de executar com sucesso porque o processo de coleta de células únicas é propenso à perda de células e requer um alto nível de especialização. Em um mililitro de meio de cultura de células pré-aquecido, ressuspenda as células marcadas com HT-29 CFSE e deixe-as regenerar a 37 graus Celsius por 30 minutos. Para colher as células, centrifugue a 300 g por três minutos.Em seguida, ressuspenda o pellet celular em um mililitro de solução de coloração de DNA Hoechst 33342 pronta para uso a 37 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, centrifugue a suspensão celular a 300 g por três minutos. Em seguida, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em quatro mililitros de solução salina tamponada com fosfato 1X.Em seguida, conte o número de células usando um hemocitômetro e verifique a marcação de fluorescência com microscópio de fluorescência. Em seguida, centrifugar as células a 300 g durante três minutos, rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento a cerca de 500 000 células por mililitro e colocar as células no gelo. Em cinco mililitros de sangue periférico, adicione cerca de 500 a 500.000 células e depois misture invertendo o tubo.Depois de remover o fio do compartimento de armazenamento, remova a tampa de borracha que prende o fio e lave o fio em solução salina tamponada com fosfato 1X e monte-o na tampa do tubo. Em seguida, incube o tubo em um misturador de rolos inclinado a cinco rotações por minuto por 30 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, enxágue o fio em solução salina tamponada com fosfato 1X três vezes.Em seguida, armazene o fio em um tubo de 15 mililitros contendo solução salina tamponada com fosfato 1X no escuro. Desenhe uma área retangular em uma lâmina de vidro usando uma caneta de graxa e, em seguida, adicione 500 microlitros de solução salina tamponada com fosfato 1X. Para imergir a parte funcional do fio em solução salina tamponada com fosfato 1X, dobre a parte não funcional do fio e coloque-a na lâmina de vidro.Para contar o número de células capturadas, inspecione visualmente os dois lados do fio. Após a inspeção, transfira o fio de volta no tubo de 15 mililitros com solução salina tamponada com fosfato 1X e mantenha no escuro. Em um mililitro de solução salina tamponada com fosfato 1X, dissolva quatro miligramas do componente tampão de liberação e, em seguida, filtre a solução através de um filtro estéril de 0,2 micrômetro para obter o tampão pronto para uso.Em seguida, aqueça o tampão de liberação a 37 graus Celsius por cinco minutos. Depois de aquecido, transfira 1,6 mililitros de tampão de liberação para encher completamente um tubo de reação de 1,5 mililitro. Em seguida, incube a parte funcional do fio no tampão de liberação a 37 graus Celsius em banho-maria por 20 minutos.Após a incubação, coloque o fio em um agitador a 500 rotações por minuto por 15 minutos. Em seguida, centrifugue o fio a 300 g por 10 minutos. Terminada a centrifugação, desloque o fio do tubo, feche a tampa e centrifugue novamente o tubo a 300 g por 10 minutos.Para diminuir o volume da suspensão celular, descarte todos, exceto 100 microlitros de sobrenadante para micromanipulação ou 300 microlitros para citocentrifugação subsequente e microdissecção a laser. Em seguida, prossiga rapidamente para a amostragem de célula única. Para micromanipulação, transfira todos os 100 microlitros de suspensão celular para uma lâmina de vidro.Em seguida, coloque a lâmina de vidro em um microscópio equipado com um micromanipulador e deixe as células assentarem por cinco minutos. Em seguida, em tubos de PCR de 0,2 mililitro, pipete dois microlitros de mistura mestre de lise celular e transfira para o gelo. Use o micromanipulador para coletar uma única célula em um microlitro de solução salina tamponada com fosfato 1X.Em seguida, transfira a célula diretamente para dois microlitros de mistura master de lise celular. Use uma microcentrífuga de mesa para girar rapidamente as amostras a 2.000 g por três segundos para coletar o líquido no fundo do tubo. Em seguida, transfira a amostra no gelo e prossiga para a amplificação do genoma completo baseada no adaptador-ligante.Aspire apenas uma célula usando um microlitro de tampão no máximo. Ao transferir a célula para a solução de lise, certifique-se de ver bolhas surgindo da solução, indicando que todo o volume aspirado foi transferido. Para microdissecção a laser, citocentrifugue todos os 300 microlitros de suspensão celular em uma lâmina revestida de membrana a 300 g por cinco minutos.Em seguida, coloque a lâmina revestida de membrana em um microscópio capaz de microdissecção a laser. Em seguida, pipete 4,5 microlitros de mistura mestre de lise celular na tampa do tubo de PCR de 0,2 mililitro. Coloque a tampa acima da amostra e colha uma única célula por microdissecção a laser.Logo em seguida, verifique se há células isoladas na tampa de PCR, remova o tubo de PCR do microscópio de microdissecção a laser e feche o tubo. Colete todo o líquido no fundo do tubo com uma rotação curta. Transfira a amostra no gelo e prossiga para a amplificação do genoma completo baseada no adaptador-ligante.Certifique-se de recuperar a célula microdissecada a laser. Portanto, é importante cobrir toda a tampa do tubo com a solução de lise. Após a microdissecção, verifique a presença da célula na tampa do tubo.Para mostrar as células que estão coradas com CFSE e Hoechst 33342, a imagem de imunofluorescência foi feita antes de carregar o fio, durante as células sendo conectadas ao fio, depois separadas do fio e, finalmente, na lâmina. As imagens de imunofluorescência das células antes do carregamento mostram coloração nucleica brilhante em azul, enquanto o citoplasma das células mostra coloração verde CFSE com intensidade intercelular heterogênea. Padrão de coloração semelhante também é observado para células que são anexadas e subsequentemente separadas do fio.Para verificar a qualidade de todos os produtos de amplificação do genoma, um gel de 1% de agarose foi executado. O gel de agarose mostra um esfregaço de DNA variando de 0,2 a mais de 1 quilobase para os produtos de PCR de amplificação do genoma completo. Os produtos de PCR de controle de qualidade 4plex obtidos a partir de uma única célula produzem produtos de 100, 200, 300 e 400 pares de bases.Os produtos que apresentam menos de três faixas são excluídos da análise posterior. Uma vez dominada, essa técnica permite o isolamento de células únicas de suspensões celulares em quatro horas, se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter as células submersas no tampão, especialmente durante o tempo em que as células estão presas ao fio para evitar danos às células.Seguindo este procedimento, métodos de análise como hibridização genômica comparativa de área, sequenciamento de próxima geração e PCR específico do alvo podem ser realizados para caracterizar células únicas com base em variações e mutações no número de cópias. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar e recuperar células de suspensões celulares usando um fio funcionalizado e como amostrar células únicas para várias análises genéticas moleculares a jusante. Não se esqueça de que trabalhar com sangue humano apresenta a possibilidade de infecção, portanto, o uso de luvas e jaleco é obrigatório durante a realização deste procedimento.

target-cell-pre-enrichment-whole-genome-amplification-for-single-cell

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Neste artigo descrevemos um método simples para a colheita de células isoladas de ratos culturas primárias neuronais e análise de transcriptoma subsequentes usando a amplificação ARNA. Esta abordagem é generalizável a qualquer tipo de célula.

Análise do transcriptoma de uma única célula

Este vídeo descreve a técnica para isolar células individuais de um conjunto de células-alvo para realizar análises downstream. Neste método, um micromanipulador instalado em um microscópio é usado para isolamento de alta precisão de uma única célula-alvo.

Amostragem de células únicas usando micromanipulação: uma técnica para isolar células individuais da suspensão de células cancerígenas

Este vídeo descreve a técnica para obter uma única célula de uma população de células heterogêneas usando microdissecção por captura a laser. A única célula isolada pode ser usada para estudos genômicos adicionais ou pesquisas sobre o câncer.

Amostragem de célula única usando microdissecção por captura a laser: uma técnica para colher células-alvo de uma população de células heterogêneas

Este protocolo descreve a forma de avaliar a expressão de uma grande variedade de genes ao nível clonal. De uma única célula RT-qPCR produz resultados altamente confiáveis, com uma forte sensibilidade para centenas de amostras e genes.

Expressão Gênica de uma única célula Usando Multiplex RT-qPCR Caracterizar Heterogeneidade de rara populações linfóides

sequenciamento de uma única célula é uma ferramenta cada vez mais popular e acessível para lidar com alterações genômicas em alta resolução. Nós fornecemos um protocolo que utiliza a sequenciação de célula única para identificar alterações no número de cópias em células individuais.

Detecção de Copy Number Alterações Usando Sequencing única célula

Um método simples, mas eficaz, que emprega nanopartículas magnéticas para detectar e enriquecer as células B antígeno-reativa para análise funcional e fenotípica é descrito.

Detecção e enriquecimento da Rare células B antígeno-específica para a análise do fenótipo e função

Granel gene expressão medições nuvem célula individual diferenças nas populações de células heterogêneas. Aqui, descrevemos um protocolo para análise de expressão do gene como unicelular e índice classificação por Florescence ativado celular classificação (FACS) pode ser combinado para delinear a heterogeneidade e immunophenotypically caracterizam populações de células molecularmente distinta.

Uma combinatória célula única abordagem para caracterizar o Molecular e imunofenotípica heterogeneidade de tronco humano e populações de Progenitor

Aqui, apresentamos um protocolo de dissociação de célula para isolar eficientemente células presentes em baixa abundância dentro do sistema visual de Drosophila através de célula de fluorescência ativada classificação (FACS).

Purificação de células Low-abundante no sistema Visual da drosófila

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho integrado para identificar características fenotípicas e moleculares que caracterizam células tumorais circulantes (CTCs). Combinamos imunocoloração ao vivo e micromanipulação robótica de CTCs simples e clusterizadas com técnicas baseadas em células únicas para análise a jusante e avaliação da capacidade de propagação de metástases.

Micromanipulação de células tumorais circulantes para análise molecular a jusante e avaliação do potencial metastático

O presente protocolo descreve um método de célula única para análises epigenômicas iterativas usando uma única célula reutilizável. A célula única reutilizável permite a análise de múltiplas marcas epigenéticas em uma mesma célula e a validação estatística dos resultados.

Célula única reutilizável para análises epigenômicas iterativas

As células tumorais circulantes (CTCs) são críticas para o estudo da progressão e metástase do câncer. Este artigo apresenta um protocolo integrado de alto rendimento para enriquecimento de CTC e sequenciamento de CTC única, melhorando a eficiência de captura e a pureza da CTC, reduzindo os custos de contaminação e sequenciamento, avançando assim na pesquisa de oncologia de precisão e aplicações clínicas.

Tecnologia de Classificação de Células Tumorais Circulantes de Alto Rendimento e Tecnologia de Sequenciamento de Célula Única Baseada em Microfluídica

Aprenda a isolar células raras de suspensões celulares usando fio funcionalizado para análise genética de célula única. Este método permite caracterizar células tumorais circulantes em biópsias líquidas.

Amplificação de genoma pré-enriquecimento e toda célula alvo para jusante caracterização única célula

Explorar mais vídeos