Citometria de fluxo phospho com Barcoding fluorescente de célula para célula única sinalização análise e descoberta de Biomarker

Aqui, apresenta-se um protocolo para análise de médio - a elevado-produção de eventos de fosforilação de proteínas no nível celular. Phospho citometria de fluxo é uma poderosa abordagem para caracterizar as aberrações de sinalização, identificar e validar biomarcadores e avaliar farmacodinâmica.

Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave nos campos da biologia celular e da imunologia, como como sinalizar caminhos afetados por diferentes estímulos ou drogas? A principal vantagem desta técnica é que ela permite realizar análises de sinalização de célula única na moda de médio a alto rendimento. Depois de suspender as células em meio RPMI 16/40 suplementado, transfira a quantidade necessária de suspensão celular para os poços de uma placa de fundo V de 96 poços.

Transfira a placa para um banho de água pré-aquecido de 37 graus Celsius e deixe descansar lá por 10 minutos. Em seguida, adicione 60 microliters de buffer fixo um para cada poço de uma nova placa de 96 poços para configurar a placa de fixação. Coloque esta placa no banho de água Celsius de 37 graus.

Transfira uma amostra de controle de 50 microliter para a placa e misture por pipetação para cima e para baixo. Opcionalmente, adicione 10 microliters por mililitro anti-IgM às células para iniciar o curso de tempo de simulação e misturar por pipetação para cima e para baixo. Transfira uma amostra de 50 microliteres para a placa de fixação em cada ponto de tempo, misturando cada amostra à medida que for adicionada.

Após a última amostra ser adicionada, deixe a placa fixa no banho de água por 10 minutos. Primeiro, lave as células três vezes com PBS. Centrifugar a placa a 500 vezes G por cinco minutos e descartar o supernatante.

Em seguida, prepare uma placa fresca de fundo V de 96 poços com reagentes de barcobração, pipetando cinco microliters de cada reagente de barcobra em cada poço preenchendo o número de poços necessários para manchar cada uma das amostras. Na placa celular fixa, resuspenque as células em cada poço com 190 microliters de PBS. Em seguida, transfira cada poço de células para o poço correspondente na placa de codificação, misturando cada poço completamente.

Deixe o prato descansar em temperatura ambiente por 20 minutos no escuro. Centrifugar a placa a 500 vezes G por cinco minutos e descartar o supernatante. Depois disso, lave as células em cada poço duas vezes com a lavagem de fluxo.

Em seguida, adicione 190 microliters de lavagem de fluxo a cada poço de células. Combine todas as amostras de código de barras em um tubo de 15 mililitros e transfira cada controle de compensação para um tubo separado de 1,7 mililitro. Centrifugar a 500 vezes G por cinco minutos e descartar o supernatante.

Para começar, transfira dois mililitros de tampão perm três para um tubo de 15 mililitros. Armazene a menos 20 graus Celsius para que fique gelado quando usado. Quando estiver pronto, adicione 1,5 mililitros de tampão de gelo frio perm ao tubo de 15 mililitros contendo a população celular com código de barras em sentido de gota enquanto o vórtice para evitar a aglomeração celular.

Adicione 100 microliters de tampão de perm frio gelado a cada um dos controles de compensação da mesma maneira. Transfira imediatamente as células para um congelador a menos 80 graus Celsius por um mínimo de 30 minutos. Quando estiver pronto para começar a coloração de antígeno, remova as células do congelador e transfira-as para uma caixa de gelo.

Lave as células três vezes com um excesso de lavagem de fluxo. Centrifugar as células a 500 vezes G e 4 graus Celsius por cinco minutos. Descarte o supernascer e suspenda a população de células de código de barras em um volume de lavagem de fluxo, tal é que há 25 microliters de suspensão celular por mancha de fosfo-anticorpo.

Suspenda des suspenda os controles de compensação em 200 microliters de lavagem de fluxo. Para começar a preparar anticorpos para coloração, adicione 10 microliters de anticorpos específicos do fosfo, diluídos na lavagem de fluxo, a cada poço de uma placa fresca de fundo em V de 96. Adicione 15 microliters de marcador de superfície, diluídos em lavagem de fluxo e 25 microliters de suspensão celular a cada poço para um volume final de 50 microliters por poço.

Deixe as células descansarem por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. Depois disso, lave as células manchadas duas vezes com lavagem de fluxo. Centrifugar a 500 vezes G por cinco minutos.

Descarte o supernascer e suspenda as células em 150 microliters de lavagem de fluxo. Em seguida, realize a análise de citometria de fluxo conforme descrito no protocolo de texto. No protocolo apresentado, a codificação tridimensional é realizada combinando três corantes de codificação de barras.

As amostras individuais são então desconvoluídas por gating subsequente em cada reagente de codificação de barras versus área de dispersão lateral. Os níveis de fosforilação basal e estimulação induzidos de 20 moléculas de sinalização a jusante do receptor de células B são então caracterizados em células B de pacientes com LLC e controles normais em várias condições. A fosforina 705 é vista como significativamente regulada.

As células são estimuladas com anti-IgM por até 30 minutos, a fim de identificar aberrações de sinalização induzidas através da via receptora de células B. Enquanto as células LLC de pacientes com IGVH nãomutados apresentam maior sensibilidade para a estimulação anti-IgM, é apenas estatisticamente significante para a serina de fósforo AKT 473. As células são então expostas ao inibidor delta PI 3-quinase idelalisib para testar se o aberrante sinal AKT pS473 pode ser revertido.

Como mostrado aqui, os níveis aberrantes são significativamente reduzidos após o tratamento de forma dependente da concentração, demonstrando que os inibidores da quinase podem ser aplicados para normalizar a sinalização aberrante em células llc. Antes de tentar este procedimento é importante lembrar de titular reagentes e anticorpos de codificação de barras, e verificar se marcadores de superfície selecionados são compatíveis com reagentes de fixação e permeabilização. As células precisam estar em suspensão para análise de fósforo, ainda assim o protocolo pode ser adaptado a células aberrantes ou tecidos após procedimentos para obter suspensão celular única, como a tripzinação total.