Citometria de fluxo phospho com Barcoding fluorescente de célula para célula única sinalização análise e descoberta de Biomarker
October 4th, 2018
Aqui, apresenta-se um protocolo para análise de médio - a elevado-produção de eventos de fosforilação de proteínas no nível celular. Phospho citometria de fluxo é uma poderosa abordagem para caracterizar as aberrações de sinalização, identificar e validar biomarcadores e avaliar farmacodinâmica.
Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave nos campos da biologia celular e da imunologia, como como sinalizar caminhos afetados por diferentes estímulos ou drogas? A principal vantagem desta técnica é que ela permite realizar análises de sinalização de célula única na moda de médio a alto rendimento. Depois de suspender as células em meio RPMI 16/40 suplementado, transfira a quantidade necessária de suspensão celular para os poços de uma placa de fundo V de 96 poços.
Transfira a placa para um banho de água pré-aquecido de 37 graus Celsius e deixe descansar lá por 10 minutos. Em seguida, adicione 60 microliters de buffer fixo um para cada poço de uma nova placa de 96 poços para configurar a placa de fixação. Coloque esta placa no banho de água Celsius de 37 graus.
Transfira uma amostra de controle de 50 microliter para a placa e misture por pipetação para cima e para baixo. Opcionalmente, adicione 10 microliters por mililitro anti-IgM às células para iniciar o curso de tempo de simulação e misturar por pipetação para cima e para baixo. Transfira uma amostra de 50 microliteres para a placa de fixação em cada ponto de tempo, misturando cada amostra à medida que for adicionada.
Após a última amostra ser adicionada, deixe a placa fixa no banho de água por 10 minutos. Primeiro, lave as células três vezes com PBS. Centrifugar a placa a 500 vezes G por cinco minutos e descartar o supernatante.
Em seguida, prepare uma placa fresca de fundo V de 96 poços com reagentes de barcobração, pipetando cinco microliters de cada reagente de barcobra em cada poço preenchendo o número de poços necessários para manchar cada uma das amostras. Na placa celular fixa, resuspenque as células em cada poço com 190 microliters de PBS. Em seguida, transfira cada poço de células para o poço correspondente na placa de codificação, misturando cada poço completamente.
Deixe o prato descansar em temperatura ambiente por 20 minutos no escuro. Centrifugar a placa a 500 vezes G por cinco minutos e descartar o supernatante. Depois disso, lave as células em cada poço duas vezes com a lavagem de fluxo.
Em seguida, adicione 190 microliters de lavagem de fluxo a cada poço de células. Combine todas as amostras de código de barras em um tubo de 15 mililitros e transfira cada controle de compensação para um tubo separado de 1,7 mililitro. Centrifugar a 500 vezes G por cinco minutos e descartar o supernatante.
Para começar, transfira dois mililitros de tampão perm três para um tubo de 15 mililitros. Armazene a menos 20 graus Celsius para que fique gelado quando usado. Quando estiver pronto, adicione 1,5 mililitros de tampão de gelo frio perm ao tubo de 15 mililitros contendo a população celular com código de barras em sentido de gota enquanto o vórtice para evitar a aglomeração celular.
Adicione 100 microliters de tampão de perm frio gelado a cada um dos controles de compensação da mesma maneira. Transfira imediatamente as células para um congelador a menos 80 graus Celsius por um mínimo de 30 minutos. Quando estiver pronto para começar a coloração de antígeno, remova as células do congelador e transfira-as para uma caixa de gelo.
Lave as células três vezes com um excesso de lavagem de fluxo. Centrifugar as células a 500 vezes G e 4 graus Celsius por cinco minutos. Descarte o supernascer e suspenda a população de células de código de barras em um volume de lavagem de fluxo, tal é que há 25 microliters de suspensão celular por mancha de fosfo-anticorpo.
Suspenda des suspenda os controles de compensação em 200 microliters de lavagem de fluxo. Para começar a preparar anticorpos para coloração, adicione 10 microliters de anticorpos específicos do fosfo, diluídos na lavagem de fluxo, a cada poço de uma placa fresca de fundo em V de 96. Adicione 15 microliters de marcador de superfície, diluídos em lavagem de fluxo e 25 microliters de suspensão celular a cada poço para um volume final de 50 microliters por poço.
Deixe as células descansarem por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. Depois disso, lave as células manchadas duas vezes com lavagem de fluxo. Centrifugar a 500 vezes G por cinco minutos.
Descarte o supernascer e suspenda as células em 150 microliters de lavagem de fluxo. Em seguida, realize a análise de citometria de fluxo conforme descrito no protocolo de texto. No protocolo apresentado, a codificação tridimensional é realizada combinando três corantes de codificação de barras.
As amostras individuais são então desconvoluídas por gating subsequente em cada reagente de codificação de barras versus área de dispersão lateral. Os níveis de fosforilação basal e estimulação induzidos de 20 moléculas de sinalização a jusante do receptor de células B são então caracterizados em células B de pacientes com LLC e controles normais em várias condições. A fosforina 705 é vista como significativamente regulada.
As células são estimuladas com anti-IgM por até 30 minutos, a fim de identificar aberrações de sinalização induzidas através da via receptora de células B. Enquanto as células LLC de pacientes com IGVH nãomutados apresentam maior sensibilidade para a estimulação anti-IgM, é apenas estatisticamente significante para a serina de fósforo AKT 473. As células são então expostas ao inibidor delta PI 3-quinase idelalisib para testar se o aberrante sinal AKT pS473 pode ser revertido.
Como mostrado aqui, os níveis aberrantes são significativamente reduzidos após o tratamento de forma dependente da concentração, demonstrando que os inibidores da quinase podem ser aplicados para normalizar a sinalização aberrante em células llc. Antes de tentar este procedimento é importante lembrar de titular reagentes e anticorpos de codificação de barras, e verificar se marcadores de superfície selecionados são compatíveis com reagentes de fixação e permeabilização. As células precisam estar em suspensão para análise de fósforo, ainda assim o protocolo pode ser adaptado a células aberrantes ou tecidos após procedimentos para obter suspensão celular única, como a tripzinação total.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para análise de média a alta produtividade de eventos de fosforilação de proteínas em nível celular usando citometria de fluxo fosfo. Este método é eficaz para caracterizar aberrações de sinalização, identificar e validar biomarcadores e avaliar farmacodinâmica.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Imunologia
- Transdução de Sinal
Fundamentos
- A citometria de fluxo fosfo permite a análise de sinalização em células únicas.
- Esta técnica pode abordar como as vias de sinalização são influenciadas por vários estímulos ou medicamentos.
- É adequada para análise de média a alta produtividade.
- O método melhora a capacidade de estudar respostas celulares em um nível detalhado.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo confiável para analisar a fosforilação de proteínas.
- Facilitar a identificação de biomarcadores na sinalização celular.
- Avaliar a farmacodinâmica de diferentes tratamentos.
Métodos Utilizados
- As células são ressuspendidas em meio RPMI 16/40 suplementado.
- Uma quantidade específica de suspensão celular é transferida para uma placa de fundo em V de 96 poços.
- A placa é incubada em um banho de água pré-aquecido a 37 graus Celsius.
- O tampão fixador é adicionado para preparar a placa para análise.
Principais Resultados
- O método permite uma análise eficiente das vias de sinalização.
- Fornece insights sobre os efeitos dos medicamentos na sinalização celular.
- A resolução de células únicas melhora a compreensão das respostas celulares.
- Os resultados podem levar à identificação de potenciais alvos terapêuticos.
Conclusões
- A citometria de fluxo fosfo é uma ferramenta valiosa para estudar a fosforilação de proteínas.
- O protocolo permite a análise de alta produtividade, tornando-o acessível para várias aplicações de pesquisa.
- Estudos futuros podem se basear neste método para explorar redes de sinalização complexas.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Phospho flow cytometry with fluorescent cell barcoding enables medium- to high-throughput single-cell analysis of protein phosphorylation, supporting target validation and biomarker discovery in oncology and immunology. By quantifying drug-induced signaling changes at single-cell resolution, the method enhances predictive confidence in preclinical models and informs go/no-go decisions in therapeutic development. Its compatibility with standard cytometer hardware allows scalable integration into discovery workflows for pathway interrogation and pharmacodynamic assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring phosphorylation dynamics of signaling proteins downstream of receptors such as B cell receptor in disease-relevant cells.
- Operational Value: Enables functional target validation through multiplexed detection of 20 signaling molecules in primary patient-derived cells under stimulated and inhibited conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying aberrant nodes like AKT pS473 and STAT3 pY705 that correlate with drug sensitivity and resistance mechanisms.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Fluorescent cell barcoding allows pooling of multiple samples and conditions into a single tube, increasing throughput and reducing run-to-run variability on standard flow cytometers.
- Quantitative Output: Generates single-cell resolution data on phosphorylation levels, enabling dose-response analysis of kinase inhibitors such as idelalisib in CLL models.
- Platform Reuse: Standardized fixation, permeabilization, and antibody staining steps support adaptation across immune cell types and stimulation paradigms for longitudinal screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses primary CLL patient cells to model signaling aberrations, providing a clinically relevant system for evaluating targeted therapies.
- Translational Continuity: Links ex vivo drug response to biomarker discovery by correlating pS473 reduction with IGVH mutation status, supporting patient stratification strategies.
- Mechanistic De-risking: Demonstrates reversal of aberrant signaling by PI3Kδ inhibition, validating target engagement and mechanism of action for kinase inhibitors in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through lead optimization to preclinical efficacy testing, particularly in immunology and oncology programs focused on signal transduction modulators.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying stimulus-induced phosphorylation changes in primary human B cells, clarifying pathway activation states under basal and drug-treated conditions.
- Screening: Enables reproducible, multiplexed assessment of compound effects on signaling networks, with barcoding facilitating side-by-side comparison of doses, time points, and genetic backgrounds.
- Analytics: Delivers quantitative, single-cell phosphorylation readouts that allow statistical comparison of signaling states across conditions, supporting biomarker threshold setting and response classification.
- Translational Research: Connects in vitro drug response to ex vivo biomarker validation using primary CLL specimens, aligning with preclinical-to-clinical transition criteria.
- Enterprise Reuse: Standardized reagent panel and barcoding strategy allow reuse across projects studying cytokine signaling, antigen receptor activation, or drug mechanism in immune and malignant cell populations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking receptor stimulation to downstream effector phosphorylation at single-cell resolution in heterogeneous primary cell samples.
- Operational Value: Standardized workflow with barcoding increases sample throughput, minimizes technical variance, and maximizes instrument utilization on existing flow cytometry platforms.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early evidence of target modulation and pathway inhibition, reducing investment in compounds with insufficient biological activity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads based on target engagement and signaling normalization in disease-relevant human cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, antibody titration, and phospho-specific reagent validation to ensure signal specificity and minimize background.
- Dependent on access to flow cytometers with sufficient laser and detector configuration for multiplexed phospho- and surface marker panels.
- Necessitates standardization of fixation, permeabilization, and washing steps across users and sites to maintain reproducibility of phosphorylation signals.
- Requires optimization of barcoding reagent concentrations to avoid spectral overlap and ensure accurate sample deconvolution during analysis.
- Limited to cells in suspension; adherence-dependent or tissue samples require prior dissociation to single-cell suspension using validated enzymatic or mechanical methods.
