Citometria de fluxo phospho com Barcoding fluorescente de célula para célula única sinalização análise e descoberta de Biomarker
4 de outubro de 2018
Aqui, apresenta-se um protocolo para análise de médio - a elevado-produção de eventos de fosforilação de proteínas no nível celular. Phospho citometria de fluxo é uma poderosa abordagem para caracterizar as aberrações de sinalização, identificar e validar biomarcadores e avaliar farmacodinâmica.
Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave nos campos da biologia celular e da imunologia, como como sinalizar caminhos afetados por diferentes estímulos ou drogas? A principal vantagem desta técnica é que ela permite realizar análises de sinalização de célula única na moda de médio a alto rendimento. Depois de suspender as células em meio RPMI 16/40 suplementado, transfira a quantidade necessária de suspensão celular para os poços de uma placa de fundo V de 96 poços.
Transfira a placa para um banho de água pré-aquecido de 37 graus Celsius e deixe descansar lá por 10 minutos. Em seguida, adicione 60 microliters de buffer fixo um para cada poço de uma nova placa de 96 poços para configurar a placa de fixação. Coloque esta placa no banho de água Celsius de 37 graus.
Transfira uma amostra de controle de 50 microliter para a placa e misture por pipetação para cima e para baixo. Opcionalmente, adicione 10 microliters por mililitro anti-IgM às células para iniciar o curso de tempo de simulação e misturar por pipetação para cima e para baixo. Transfira uma amostra de 50 microliteres para a placa de fixação em cada ponto de tempo, misturando cada amostra à medida que for adicionada.
Após a última amostra ser adicionada, deixe a placa fixa no banho de água por 10 minutos. Primeiro, lave as células três vezes com PBS. Centrifugar a placa a 500 vezes G por cinco minutos e descartar o supernatante.
Em seguida, prepare uma placa fresca de fundo V de 96 poços com reagentes de barcobração, pipetando cinco microliters de cada reagente de barcobra em cada poço preenchendo o número de poços necessários para manchar cada uma das amostras. Na placa celular fixa, resuspenque as células em cada poço com 190 microliters de PBS. Em seguida, transfira cada poço de células para o poço correspondente na placa de codificação, misturando cada poço completamente.
Deixe o prato descansar em temperatura ambiente por 20 minutos no escuro. Centrifugar a placa a 500 vezes G por cinco minutos e descartar o supernatante. Depois disso, lave as células em cada poço duas vezes com a lavagem de fluxo.
Em seguida, adicione 190 microliters de lavagem de fluxo a cada poço de células. Combine todas as amostras de código de barras em um tubo de 15 mililitros e transfira cada controle de compensação para um tubo separado de 1,7 mililitro. Centrifugar a 500 vezes G por cinco minutos e descartar o supernatante.
Para começar, transfira dois mililitros de tampão perm três para um tubo de 15 mililitros. Armazene a menos 20 graus Celsius para que fique gelado quando usado. Quando estiver pronto, adicione 1,5 mililitros de tampão de gelo frio perm ao tubo de 15 mililitros contendo a população celular com código de barras em sentido de gota enquanto o vórtice para evitar a aglomeração celular.
Adicione 100 microliters de tampão de perm frio gelado a cada um dos controles de compensação da mesma maneira. Transfira imediatamente as células para um congelador a menos 80 graus Celsius por um mínimo de 30 minutos. Quando estiver pronto para começar a coloração de antígeno, remova as células do congelador e transfira-as para uma caixa de gelo.
Lave as células três vezes com um excesso de lavagem de fluxo. Centrifugar as células a 500 vezes G e 4 graus Celsius por cinco minutos. Descarte o supernascer e suspenda a população de células de código de barras em um volume de lavagem de fluxo, tal é que há 25 microliters de suspensão celular por mancha de fosfo-anticorpo.
Suspenda des suspenda os controles de compensação em 200 microliters de lavagem de fluxo. Para começar a preparar anticorpos para coloração, adicione 10 microliters de anticorpos específicos do fosfo, diluídos na lavagem de fluxo, a cada poço de uma placa fresca de fundo em V de 96. Adicione 15 microliters de marcador de superfície, diluídos em lavagem de fluxo e 25 microliters de suspensão celular a cada poço para um volume final de 50 microliters por poço.
Deixe as células descansarem por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. Depois disso, lave as células manchadas duas vezes com lavagem de fluxo. Centrifugar a 500 vezes G por cinco minutos.
Descarte o supernascer e suspenda as células em 150 microliters de lavagem de fluxo. Em seguida, realize a análise de citometria de fluxo conforme descrito no protocolo de texto. No protocolo apresentado, a codificação tridimensional é realizada combinando três corantes de codificação de barras.
As amostras individuais são então desconvoluídas por gating subsequente em cada reagente de codificação de barras versus área de dispersão lateral. Os níveis de fosforilação basal e estimulação induzidos de 20 moléculas de sinalização a jusante do receptor de células B são então caracterizados em células B de pacientes com LLC e controles normais em várias condições. A fosforina 705 é vista como significativamente regulada.
As células são estimuladas com anti-IgM por até 30 minutos, a fim de identificar aberrações de sinalização induzidas através da via receptora de células B. Enquanto as células LLC de pacientes com IGVH nãomutados apresentam maior sensibilidade para a estimulação anti-IgM, é apenas estatisticamente significante para a serina de fósforo AKT 473. As células são então expostas ao inibidor delta PI 3-quinase idelalisib para testar se o aberrante sinal AKT pS473 pode ser revertido.
Como mostrado aqui, os níveis aberrantes são significativamente reduzidos após o tratamento de forma dependente da concentração, demonstrando que os inibidores da quinase podem ser aplicados para normalizar a sinalização aberrante em células llc. Antes de tentar este procedimento é importante lembrar de titular reagentes e anticorpos de codificação de barras, e verificar se marcadores de superfície selecionados são compatíveis com reagentes de fixação e permeabilização. As células precisam estar em suspensão para análise de fósforo, ainda assim o protocolo pode ser adaptado a células aberrantes ou tecidos após procedimentos para obter suspensão celular única, como a tripzinação total.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para análise de média a alta produtividade de eventos de fosforilação proteica no nível celular utilizando citometria de fluxo com detecção de fosfoproteínas. Este método é eficaz para caracterizar alterações de sinalização, identificar e validar biomarcadores e avaliar farmacodinâmica.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Imunologia
- Transdução de Sinal
Antecedentes
- A citometria de fluxo com detecção de fosfoproteínas permite a análise de sinalização em nível de célula única.
- Essa técnica pode esclarecer como as vias de sinalização são influenciadas por diversos estímulos ou fármacos.
- É adequada para análises de média a alta produtividade.
- O método amplia a capacidade de estudar respostas celulares em um nível detalhado.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo confiável para analisar a fosforilação de proteínas.
- Facilitar a identificação de biomarcadores na sinalização celular.
- Avaliar a farmacodinâmica de diferentes tratamentos.
Métodos Utilizados
- As células são re-suspensas em meio RPMI 16/40 suplementado.
- Uma quantidade especificada de suspensão celular é transferida para uma placa de fundo em V de 96 poços.
- A placa é incubada em banho-maria pré-aquecido a 37 graus Celsius.
- É adicionado tampão fixador para preparar a placa fixada para análise.
Resultados Principais
- O método permite uma análise eficiente de vias de sinalização.
- Ele fornece informações sobre os efeitos de fármacos na sinalização celular.
- A resolução em nível de célula única aprimora a compreensão das respostas celulares.
- Os resultados podem levar à identificação de alvos terapêuticos potenciais.
Conclusões
- A citometria de fluxo com detecção de fosforilação é uma ferramenta valiosa para o estudo da fosforilação proteica.
- O protocolo permite análise em alto rendimento, tornando-o acessível para diversas aplicações de pesquisa.
- Estudos futuros podem se basear neste método para explorar redes de sinalização complexas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A citometria de fluxo com fosfoproteínas combinada à codificação fluorescente de células permite a análise de média a alta produtividade em nível de célula única da fosforilação proteica, auxiliando na validação de alvos e na descoberta de biomarcadores em oncologia e imunologia. Ao quantificar alterações no sinal induzidas por fármacos com resolução em nível de célula única, o método aumenta a confiança preditiva em modelos pré-clínicos e orienta decisões de avanço ou interrupção no desenvolvimento terapêutico. A compatibilidade com equipamentos padrão de citometria permite sua integração escalável em fluxos de trabalho de descoberta para investigação de vias e avaliação farmacodinâmica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas mediante a medição da dinâmica de fosforilação de proteínas sinalizadoras downstream de receptores como o receptor de células B em células relevantes para a doença.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio da detecção multiplexada de 20 moléculas sinalizadoras em células primárias derivadas de pacientes sob condições estimuladas e inibidas.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao identificar nós anômalos como AKT pS473 e STAT3 pY705 que se correlacionam com mecanismos de sensibilidade e resistência a fármacos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do Ensaio: A codificação celular fluorescente permite o agrupamento de múltiplas amostras e condições em um único tubo, aumentando a produtividade e reduzindo a variabilidade entre ensaios em citômetros de fluxo padrão.
- Saída Quantitativa: Gera dados com resolução em nível de célula única sobre níveis de fosforilação, permitindo análise de resposta à dose de inibidores de quinases, como o idelalisib, em modelos de LLC.
- Reutilização da Plataforma: Etapas padronizadas de fixação, permeabilização e marcação com anticorpos permitem adaptação entre diferentes tipos de células imunes e paradigmas de estímulo para campanhas de triagem longitudinais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Utiliza células primárias de pacientes com LLC para modelar alterações de sinalização, fornecendo um sistema clinicamente relevante para avaliar terapias direcionadas.
- Continuidade Translacional: Relaciona a resposta ao fármaco ex vivo à descoberta de biomarcadores, correlacionando a redução de pS473 com o status de mutação de IGVH, apoiando estratégias de estratificação de pacientes.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Demonstra a reversão da sinalização aberrante pela inibição da PI3Kδ, validando o engajamento do alvo e o mecanismo de ação de inibidores de quinases em modelos pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a otimização do composto líder e os testes de eficácia pré-clínica, especialmente em programas de imunologia e oncologia voltados para moduladores da transdução de sinal.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a quantificação de alterações na fosforilação induzidas por estímulos em linfócitos B humanos primários, esclarecendo os estados de ativação de vias sob condições basais e tratadas com fármacos.
- Triagem: Permite avaliação reprodutível e multiplexada dos efeitos de compostos sobre redes de sinalização, com codificação por marcadores que facilita a comparação paralela de doses, pontos temporais e fundos genéticos.
- Análise: Fornece leituras quantitativas de fosforilação em nível de célula única que permitem comparação estatística dos estados de sinalização entre diferentes condições, apoiando o estabelecimento de limiares de biomarcadores e a classificação de respostas.
- Pesquisa Translacional: Conecta a resposta a fármacos in vitro à validação de biomarcadores ex vivo utilizando espécimes primários de LLC, alinhando-se aos critérios de transição pré-clínica para clínica.
- Reutilização Corporativa: O painel padronizado de reagentes e a estratégia de codificação permitem reutilização em diversos projetos que estudam sinalização por citocinas, ativação do receptor de antígeno ou mecanismo de ação de fármacos em populações de células imunes e malignas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao vincular a estimulação do receptor à fosforilação do efetor downstream com resolução em nível de célula única em amostras primárias heterogêneas.
- Valor Operacional: Fluxo de trabalho padronizado com codificação por barras aumenta a capacidade de processamento de amostras, minimiza a variância técnica e maximiza a utilização do equipamento em plataformas de citometria de fluxo existentes.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar ou interromper projetos ao fornecer evidências precoces de modulação do alvo e inibição da via, reduzindo investimentos em compostos com atividade biológica insuficiente.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos com base no engajamento do alvo e na normalização da sinalização em células humanas relevantes para a doença.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em citometria de fluxo, titulação de anticorpos e validação de reagentes específicos para fosfo para garantir a especificidade do sinal e minimizar o fundo.
- Depende do acesso a citômetros de fluxo com configuração adequada de laser e detectores para painéis multiplexados de marcadores fosfo e de superfície.
- Necessita padronização das etapas de fixação, permeabilização e lavagem entre usuários e locais para manter a reprodutibilidade dos sinais de fosforilação.
- Requer otimização das concentrações dos reagentes de codificação para evitar sobreposição espectral e garantir a desconvolução precisa das amostras durante a análise.
- Limitado a células em suspensão; amostras aderentes ou de tecido requerem dissociação prévia para suspensão unicelular utilizando métodos enzimáticos ou mecânicos validados.
