Análise de Imagem de Código de Barras Multiplexado para Caracterização de Imunoprofiling e Mapeamento Espacial na Análise Unicelular de Amostras de Parafina

O alto volume de informações biológicas obtidas a partir da análise de imagens de código de barras multiplex permite que os cientistas entendam melhor o microambiente tumoral e a distribuição especial dentro das células tumorais. A principal vantagem deste método é que ele nos dá informações muito mais detalhadas da mesma amostra de tecido com a possibilidade de fazer fenotipagem mais profunda de células individuais. Este método permitiu que painéis personalizáveis estudassem o microambiente tumoral para potencialmente descobrir biomarcadores preditivos em tecido canceroso para usar como novo tratamento alvo.

Para iniciar a coloração de anticorpos conjugados com oligonucleotídeos, mergulhe as lamínulas da tampa em solução de Poli-L-Lisina a 0,1% por 24 horas, à temperatura ambiente para prepará-las para a colocação e aderência do tecido. Depois de drenar a solução de Poli-L-lisina, lave as lamínulas da tampa com água ultrapura por 30 segundos. Após a lavagem, retire as folhas de cobertura da água ultrapura e coloque-as em uma toalha sem fiapos para secar durante a noite.

Coloque seções de 5 mícrons de espessura do tecido de interesse no centro de uma tampa carregada de poli-L-lisina e deixe-as secar durante a noite. Pré-aqueça um suporte de tampa em um forno a 60 graus Celsius, durante a noite. Coloque a folha de cobertura contendo secções de tecido no suporte pré-aquecido.

Depois de assar a 60 graus Celsius por 30 minutos, verifique se a parafina derreteu longe do tecido. Coloque rapidamente o suporte de tampa que contém a amostra sequencialmente, em uma série de soluções. Finalmente, coloque o suporte de deslizamento da tampa em água ultrapura tratada com DEPC por duas rodadas de cinco minutos cada.

Prepare uma câmara de umidade colocando uma toalha de papel embebida em água no fundo de uma caixa de ponta de pipeta vazia. Encha uma panela de pressão com água, o suficiente para cobrir metade da altura de um copo de 50 mililitros. Coloque 5 mililitros de metanol por amostra num copo a 4 graus Celsius.

Diluir o volume necessário de tampão AR9 para 1X com pirocarbonato de dietila ou água ultrapura tratada com DEPC. Em seguida, encha um copo de vidro de 50 mililitros com aproximadamente 40 mililitros do tampão AR9 diluído. Submergir a amostra no suporte de deslizamento da tampa no copo e cobrir completamente o copo com papel alumínio.

Coloque o copo coberto com papel alumínio na panela de pressão cheia de água e cozinhe a cerca de 15 PSI por 20 minutos. Em seguida, retire o copo e desembrulhe cuidadosamente o papel alumínio. Deixe o copo esfriar em temperatura ambiente por cerca de 10 minutos.

Remova o suporte de deslizamento da tampa do buffer AR9 1X. Incubá-lo duas vezes em água ultrapura tratada com DEPC por dois minutos. Enquanto isso, recupere o tampão de hidratação, o diluente de anticorpos e as soluções de bloqueio N, G, J e S do kit de coloração de imagem multiplexada.

Coloque a amostra de tampa em 5 mililitros do tampão de hidratação duas vezes, por dois minutos cada. Em seguida, coloque a amostra de lamínula em 5 mililitros do bloco diluente de anticorpos multiplexado e incube por 20 a 30 minutos à temperatura ambiente. Durante a incubação, prepare o coquetel de anticorpos.

Após a incubação, coloque a tampa na câmara de umidade previamente preparada. Pipetar 190 microlitros do coquetel de anticorpos na amostra de tampa e incubar à temperatura ambiente por três horas. Em seguida, lave a amostra duas vezes, cada uma com 5 mililitros do bloco diluente de anticorpos multiplexado por imagem por dois minutos.

Para fixar os anticorpos ligados ao tecido, incubar as lamínulas de cobertura por 10 minutos em formaldeído a 16% diluído a 1,6% com solução de armazenamento e lavá-las três vezes com PBS. Depois de incubar a tampa escorrega por cinco minutos em metanol, pré-resfriar a 4 graus Celsius. Após a lavagem, incubar novamente as lamínulas por 20 minutos, em 5 mililitros do reagente fixador diluído com PBS, e lavá-las três vezes com PBS antes de armazenar.

Prepare o master mix de repórteres seguindo a composição mencionada no texto. Encher um poço em uma placa de 96 poços com 245 microlitros de uma solução contendo a mistura mestre do repórter e os fluoróforos com código de barras específicos para esse ciclo experimental. A figura mostra uma configuração de placa repórter usada aqui para um painel de carcinoma.

Para proteger os fluoróforos com código de barras, cole uma tampa de placa de folha sobre a placa de repórter de 96 poços e coloque a placa dentro do instrumento de imagem multiplexado. Calibre o foco da imagem usando o canal DAPI colocando uma tampa de amostra no estágio do microscópio e pipetando manualmente 700 microlitros de uma titulação 1:1500 de uma solução de coloração nuclear no tecido. Para preparar o instrumento de imagem multiplexado, dilua o buffer de imagem multiplexado de 10X para 1X usando água ultrapura tratada com DEPC e encha garrafas de reagentes com soluções ou solventes apropriados.

Defina todos os parâmetros do microscópio e selecione as regiões de interesse na folha de cobertura da amostra a ser fotografada. Insira o desenho experimental no software gerenciador de instrumentos. Clique no botão Experimentar no software de controle e, na janela Configuração e Gerenciamento de Experimentos, clique no botão Novo Modelo.

Digite o nome do projeto no espaço ao lado do botão Projeto e insira o número total de ciclos. Clique no botão Atribuição de canal, digite as informações de cada ciclo nas colunas, como o ciclo correto, números de poços, locais de pilha Z, nome do marcador, classe e tempo de exposição para cada ciclo. Em seguida, inicie o experimento clicando em Iniciar Experimento e salve o experimento.

Clique no ícone QuPath no computador e abra o software. Arraste o arquivo qptiff para a janela do visualizador. Clique no botão de brilho e contraste para abrir a janela Contraste de brilho.

Marque ou desmarque o marcador na coluna selecionada para mostrar ou ocultar o sinal do marcador. Clique no botão de zoom para ajustar para ampliar ou reduzir a área de interesse. Quando visualizadas por um software de análise de imagens, as imagens compostas mostraram todos os marcadores ou marcadores selecionados conforme desejado.

A intensidade do sinal, a faixa dinâmica e a distribuição espacial de todos os marcadores foram reveladas. Esta técnica permitiu a análise de todos os 26 marcadores em nível subcelular em um único corte de tecido. Seguindo o processo de análise de imagens multiplex, por meio de abordagens informáticas é possível processar e analisar os dados de célula única de alta dimensão para inferir insights biológicos e clínicos.

A análise de imagem de código de barras multiplexada é uma metodologia poderosa que permite aos cientistas traçar o perfil do tecido tumoral e responder à sua pergunta de pesquisa de acordo com os marcadores nos painéis.