Adaptação da tecnologia de matriz de microeletrodos para o estudo de neurotoxicidade induzida por anestesia no cérebro intacto Leitão

Este estudo explora o uso inovador da tecnologia de matriz (MEA) enzimáticos microeletrodos para monitorar a atividade em vivo do neurotransmissor em leitões. A hipótese foi que essa desregulação glutamato contribui para o mecanismo de neurotoxicidade anestésica. Aqui, apresentamos um protocolo para adaptar a tecnologia MEA para estudar o mecanismo de neurotoxicidade induzida por anestesia.

O objetivo geral deste procedimento experimental é utilizar uma nova aplicação da tecnologia de arranjo de microeletrodos baseada em enzimas para medir neurotransmissores em leitões neonatais. Neste exemplo, a atividade do glutamato in vivo é examinada para estudar a neurotoxicidade induzida pela anestesia. A principal vantagem desta técnica é que ela pode medir in vivo a atividade de neurotransmissores com resolução espacial e temporal excepcional em um modelo animal clinicamente relevante de neurotoxicidade induzida por anestesia.

Embora esse método possa fornecer informações sobre os mecanismos de neurotoxicidade induzida pela anestesia, ele também pode ser aplicado a outros estados patológicos, como trauma cerebral pediátrico, epilepsia e acidente vascular cerebral. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque o uso do modelo de leitão requer experiência e prática na implementação. Além disso, o uso de matrizes de microeletrodos requer um conjunto de habilidades especializadas.

A demonstração visual desse método é fundamental, pois as etapas cirúrgicas e de colocação de microeletrodos são difíceis de aprender, devido à sua natureza delicada. Para este experimento, use leitões durante o pico do crescimento do cérebro, quando eles têm de três a cinco dias de idade. Deixe-os aclimatar por pelo menos 24 horas antes do experimento.

Uma equipe treinada deve cuidar dos leitões. Eles devem ter acesso improvisado a nutrição, cobertores e alguns brinquedos para estímulos. Pelo menos três horas antes da anestesia, remova o substituto do leite da gaiola para garantir que o estômago do leitão esteja vazio.

Siga as diretrizes do ARRIVE para eliminar possíveis fatores de confusão baseados no sexo. Posteriormente, em uma estação de anestesia equipada com ventilador pediátrico e dispositivos de monitoramento apropriados, intubar e ventilar mecanicamente o leitão. Em seguida, administre anestesia com sevoflurano a 1 CAM por 3,5 horas de anestesia.

Agora, use uma pinça no dedo do pé para confirmar uma profundidade adequada de anestesia e, em seguida, prenda o leitão a uma estrutura estereotáxica específica para leitões que tenha acolchoamento adequado. Posicione os dentes da maxila sobre a barra do dente. Em seguida, fixe e aperte as duas barras auriculares penetrantes com o leitão centralizado na linha média.

Insira as barras auriculares com firmeza suficiente para ouvir as membranas timpânicas estourarem. Inicie uma dose de ataque de rocurônio e uma infusão para evitar movimentos enquanto o leitão estiver preso na estrutura. É vital que o leitão permaneça aquecido e que seus sinais vitais sejam monitorados.

Use uma lâmpada de calor e/ou um cobertor para manter a termia normal. Certifique-se de que a lâmpada de calor não esteja tão perto que queime. Se a sobrevivência dos leitões for desejada, tome preparações adicionais para manter o campo cirúrgico estéril.

Agora, prossiga com a implantação do conjunto de microeletrodos. Para começar, crie uma incisão na linha média de quatro a seis centímetros ao longo do crânio, tomando cuidado para evitar marcar o crânio com o bisturi. Uma vez feita a incisão, use retração suave e dissecção romba para elevar o couro cabeludo do crânio.

Em seguida, esfregue suavemente o crânio com uma gaze para remover qualquer tecido conjuntivo e expor as linhas de sutura. Em seguida, determine o local pretendido para a craniotomia. Se a área de interesse permanecer obscurecida, reflita ainda mais o couro cabeludo.

Agora, use uma broca cirúrgica para criar uma janela de craniotomia com cerca de 0,25 centímetros quadrados sobreposta à estrutura de interesse. Tenha cuidado para não ferir a dura-máter ou o cérebro subjacente. Conforme necessário, use ferramentas cirúrgicas finas para extirpar a dura-máter que cobre o tecido cerebral.

Tenha extremo cuidado para evitar danos ao cérebro. Este experimento utiliza uma matriz de microeletrodos baseada em enzima descrita anteriormente, pré-revestida com glutamato oxidase e galvanizada com mPD. As matrizes de microeletrodos possuem uma haste rígida de 40 milímetros, personalizada para uso com leitões.

Prenda o braço de metal ao micromanipulador e, em seguida, posicione o conjunto de microeletrodos o mais verticalmente possível sobre o bregma. Em seguida, abaixe cuidadosamente a matriz o mais baixo possível sem tocar na superfície do crânio, observando as coordenadas de bregma. Agora use um atlas do cérebro de leitões para determinar as coordenadas estereotáxicas exatas da estrutura de interesse e, em seguida, reposicione o microeletrodo de acordo.

Em seguida, coloque o eletrodo de pseudo-referência sob o couro cabeludo, garantindo o contato com o animal. Agora, abaixe lentamente a matriz de microeletrodos no cérebro até quase a profundidade apropriada. Para os dois milímetros finais de curso, use um micro-drive hidráulico para abaixar suavemente a matriz na estrutura de interesse com o mínimo de trauma tecidual.

Depois que o feixe de microeletrodos estiver posicionado, aguarde 30 minutos para permitir que os eletrodos atinjam a linha de base. Em seguida, faça medições por cerca de três horas. Se o leitão sobreviver ao experimento, feche a incisão após a coleta de dados.

Medições in vivo de glutamato em tempo real foram realizadas no hipocampo de leitões de três a quatro dias de idade sob anestesia com sevoflurano, conforme descrito. As sessões de gravação ultrapassaram três horas. As medições de amperometria foram registradas a 4 hertz e convertidas em concentração usando uma regressão linear baseada em parâmetros de calibração.

Para cada ponto de tempo, os sinais dos dois locais sensíveis ao glutamato foram calculados antes de subtrair o sinal sentinela médio, para produzir um sinal de glutamato corrigido. A concentração basal média de glutamato foi de aproximadamente 4,6 micromoles e permaneceu relativamente estável ao longo da exposição ao anestésico. A atividade glutamatérgica transitória foi identificada pela análise de picos no sinal que não estavam correlacionados com o sinal sentinela e tinham uma relação sinal-ruído maior que três.

Um total de 116 picos transitórios foram detectados durante o período experimental. A amplitude dos picos transitórios resultantes foi geralmente observada dentro da faixa de 1 micromole. Para quantificar a duração de cada transiente, o tempo necessário para cada valor máximo de pico decair 80% foi obtido e encontrado em cerca de 4 a 5,5 segundos.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro horas, se metodicamente e cuidadosamente executada. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de minimizar qualquer dano tecidual não intencional que possa confundir os dados experimentais. Após este procedimento, outros métodos, como a medição de outros analitos eletroquímicos, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais.