Usando a tomografia de coerência óptica e resposta Optokinetic como estrutural e funcional sistema Visual leituras em camundongos e ratos
January 10th, 2019
Um protocolo detalhado para a avaliação de leituras visuais e estruturais em roedores por coerência óptica tomografia computadorizada e optocinético resposta é apresentado. Os resultados fornecem informações valiosas para investigação oftalmológica, bem como neurológica.
Esses métodos podem ajudar a responder perguntas-chave no campo da neurologia e oftalmologia, e ajudar a avaliar uma grande variedade de retinopatias e manifestações de retina em vários modelos de roedores. A principal vantagem dessas técnicas é que investigações longitudinais não invasivas podem ser realizadas, reduzindo a variabilidade e reduzindo o número de animais necessários para os experimentos. Esses métodos permitem a investigação quantitativa in vivo de estrutura e função que pode ser usada para investigar as condições patológicas, ou para avaliar a utilidade potencial da nova terapêutica.
No entanto, especialmente a aplicação da tecnologia de tomografia de coerência óptica em modelos de roedores ainda é desafiadora, principalmente por causa do pequeno tamanho dos olhos. Demonstrando os procedimentos estará Michael Dietrich, um estudante de doutorado do nosso laboratório. Após anestesiar o roedor, aplique uma gota de Phenylephrine Tropicamide em cada olho para dilatação pupilar.
Limpe qualquer gota de olho molhada após um minuto. E lubrificar os olhos com gel oftálmico à base de metilcelulose para evitar secar o olho e criar uma córnea turva. Em seguida, use fórceps para colocar uma lente de contato personalizada no olho.
Pressione o botão Iniciar no canto direito do display do painel de controle para iniciar o modo de aquisição. Em seguida, para a imagem do olho esquerdo, posicione o suporte para garantir que a lâmpada do olho esquerdo do roedor fique de frente para a câmera. Defina o nível do filtro para R, e selecione BR e OCT para reflexões azuis fundus imaging e B-scan aquisição no software.
Em seguida, defina a distância de foco para aproximadamente 38 dicóteos, usando o botão de foco na parte de trás da câmera. E dê zoom na retina, até que a varredura de OCT seja visível na tela. Em seguida, para garantir um caminho de feixe através do meio da pupila, com um ângulo ortogonal da retina em todos os planos, posicione o disco óptico no meio do campo iluminado.
E ajuste a linha B horizontal e vertical para um nível horizontal girando o suporte. Na tela do software selecione o modo de varredura de volume e defina-o para 25 B-scans em modo de alta resolução a 50 rastreamento automático em tempo real. Centralize o meio da grade de varredura de volume no disco óptico e inicie a aquisição pressionando o botão de sensibilidade preta e, em seguida, adquira no painel de controle.
Após a conclusão da aquisição, defina o nível do filtro para a A.Select Blue Autofluorescence no painel de controle. E ajuste o brilho da imagem com o botão de sensibilidade. Pressione o botão de sensibilidade e, em seguida, adquira para imagem células fluorescentes ou depósitos autofluorescentes.
Para análise das varreduras de volume, use a segmentação automatizada do software do dispositivo OCT clicando com o botão direito do mouse na digitalização. E selecione Segmentação, em seguida, Todas as Camadas. Execute a correção manual das camadas clicando duas vezes na digitalização desejada.
Selecione O perfil de espessura. E clique em Editar segmentações de camadas. Selecione uma camada de cada vez.
E se necessário corrigir a linha verde movendo os pontos vermelhos arrastando e caindo para a posição correta. Em seguida, selecione o mapa de espessura da guia. Escolha a grade ETDRS de 1, 2, 3 milímetros.
Centralizar o círculo interno no disco óptico. Por fim, calcule a espessura das camadas de retina a partir dos valores de espessura fornecidos pelo software para os diferentes setores de retina de interesse. Para calcular os principais valores de espessura dos volumes, use toda a grade ETDRS de 1, 2, 3 milímetros que cobre um ângulo de aproximadamente 25 graus, excluindo o círculo interno de um milímetro que contém o disco óptico.
Comece selecionando uma plataforma para medir os roedores. Abra a janela Presettings clicando duas vezes no software. Selecione Novo Grupo e escolha o nome do grupo, o número de sujeitos, a espécie e as cepas.
Selecione um estímulo variável, frequência espesso, sensibilidade ao contraste, velocidade ou orientação no menu suspenso e pressione Criar novo grupo. Concentre-se na plataforma manipulando o anel de foco da câmera em cima da câmara. E calibrar o sistema alinhando o círculo vermelho ao redor do círculo negro na plataforma.
Em seguida, coloque o roedor na plataforma e deixe que ele se adapte ao ambiente por cerca de cinco minutos. Em seguida, inicie a medição selecionando a seta esquerda para sim ou para o quadrado para não, se o animal rastreia ou não, respectivamente. Selecione manualmente o tamanho do passo do estímulo clicando nas setas para cima e para baixo ao lado do estímulo variável.
Por fim, selecione a guia Resumo e clique na tabela de arquivo, tabela de exportação ou gráfico para exportar o conjunto de dados desejado. Os resultados indicam que a degeneração das camadas internas da retina é reduzida. E uma pontuação clínica de EAE é atenuada durante o curso EAE quando a substância 1 foi administrada.
Além disso, a OKR revela uma melhor acuidade visual dos animais tratados com substância 1 em comparação com camundongos MOG EAE não tratados medidos por testes de limiar de frequência espacial durante um período de 120 dias. Ao realizar medições de OCT, um passo crítico é a orientação ortogonal do raio laser em todos os planos em relação à retina para garantir a qualidade e a reprodutibilidade dos valores de espessura. Para a técnica OKR, distinguir entre rastreamento e movimentos comportamentais normais do animal, requer algum treinamento do investigador.
É importante ficar cego para o grupo experimental. Após essas investigações de danos estruturais e funcionais ocorridos no contexto da Encefalomielite Autoimune experimental, o procedimento também pode ser útil em outros modelos envolvendo o sistema visual, incluindo, mas não se limitando aos modelos de retinopatias, ou lesão do nervo óptico. Essas técnicas abrem caminho para pesquisas in vivo nas áreas de neurologia e oftalmologia e são facilmente transferíveis para ensaios clínicos.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo abrangente para avaliar leituras estruturais e visuais em modelos de roedores usando tomografia de coerência óptica (OCT) e resposta optocinética (OKR). Essas técnicas não invasivas fornecem insights aplicáveis tanto à pesquisa oftalmológica quanto neurológica, permitindo estudos longitudinais com menor variabilidade e menos animais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Oftalmologia
- Modelos de Roedores
Fundo
- O estudo se concentra na avaliação de retinopatias e manifestações retinianas em roedores.
- Destaca os desafios associados à aplicação da OCT devido ao tamanho pequeno dos olhos dos roedores.
- OCT e OKR facilitam a investigação in vivo quantitativa da estrutura e função da retina.
- Esses métodos fornecem dados valiosos para avaliar potenciais terapêuticos e entender condições patológicas.
Propósito do Estudo
- Desenvolver e demonstrar um protocolo para usar OCT e OKR na pesquisa com roedores.
- Investigar danos estruturais e funcionais no contexto da encefalomielite autoimune experimental (EAE).
- Avaliar a eficácia de novas substâncias de tratamento em modelos pré-clínicos.
Métodos Utilizados
- Os roedores foram anestesiados para conforto durante os procedimentos de OCT e OKR.
- A imagem OCT foi realizada usando uma lente de contato personalizada e configurações específicas de software para varreduras de alta resolução.
- A plataforma OKR envolveu a apresentação de vários estímulos para avaliar as capacidades de rastreamento visual.
- As etapas principais incluíram cuidadosos procedimentos de calibração e aquisição para garantir resultados confiáveis de imagem e rastreamento.
Principais Resultados
- Os resultados indicaram diminuição da degeneração das camadas internas da retina em roedores tratados.
- Acuidade visual melhorada foi observada em animais tratados em comparação com controles não tratados.
- Os dados sugerem que essas técnicas podem medir de forma confiável as mudanças retinianas e a função visual ao longo do tempo.
Conclusões
- Este estudo demonstra a viabilidade da OCT e OKR como ferramentas poderosas para pesquisa in vivo em neurologia e oftalmologia.
- Os resultados permitem uma exploração adicional da patologia retiniana e a avaliação de novas intervenções terapêuticas.
- As metodologias apresentadas podem contribuir significativamente para o design de ensaios clínicos e a compreensão de distúrbios do sistema visual.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Combining structural and functional visual system readouts enables longitudinal, quantitative assessment of retinal integrity and visual function in rodent models, supporting mechanistic de-risking in preclinical neurology and ophthalmology programs. This dual-modality approach reduces experimental variability and animal use while providing translatable endpoints for evaluating neuroprotective or disease-modifying therapeutics. The methodology enhances predictive confidence in target validation by correlating retinal structural changes with functional visual outcomes across disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying retinal layer thickness as a structural biomarker of neurodegeneration or neuroprotection.
- Operational Value: Provides reproducible, noninvasive structural readouts that support functional target validation in visual pathway modulation.
- Predictive Value: Correlates OCT-derived retinal structural changes with OKR-measured visual acuity to strengthen target engagement and pathway modulation confidence.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes standardized OCT and OKR procedures for quantitative in vivo imaging and behavioral tracking, enabling reliable compound screening.
- Reproducibility: Facilitates longitudinal tracking of retinal structure and function, reducing inter-animal variability and improving assay precision.
- Scalability: Supports high-throughput adaptation through customizable stimulus parameters and automated segmentation for consistent data output across studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Demonstrates applicability in autoimmune encephalomyelitis (EAE) models, linking retinal structural preservation to functional visual improvement and clinical symptom attenuation.
- Translational Continuity: Provides a bridge from discovery to preclinical validation by measuring both retinal neurodegeneration and visual function recovery over extended periods.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by demonstrating substance-induced reduction in inner retinal layer degeneration and improved spatial frequency thresholds over 120 days.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, offering structural and functional endpoints that inform biological activity and therapeutic potential.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling quantitative in vivo investigation of retinal structure and function in neurodegeneration and neuroprotection models.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible structural thickness maps and functional tracking metrics for reliable compound evaluation in visual system assays.
- Analytics: Generates layer-specific thickness profiles and spatial frequency thresholds that enable cross-condition comparison and dose-response analysis.
- Translational Research: Connects structural retinal preservation with functional visual acuity recovery, supporting biomarker alignment and preclinical continuity in neurologic disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for longitudinal visual system assessment across multiple disease indications and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through correlated structural and functional visual system readouts.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via calibrated imaging protocols and blinded behavioral tracking procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early, translatable biomarkers of retinal and visual function change, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates demonstrating both retinal structural preservation and visual functional improvement in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent handling, ophthalmic preparation, and OCT/OKR system operation for reliable data acquisition.
- Depends on customized holders, contact lenses, and calibrated imaging systems to accommodate small rodent eye size and ensure beam alignment.
- Necessitates cross-team standardization of anesthesia, dilation, lubrication, and imaging protocols to maintain consistency across sites or studies.
- Involves adaptation considerations for varying stimulus parameters (spatiotemporal frequency, contrast, speed) in OKR assays across species and strain models.
- Includes practical limitations such as the need for investigator training to distinguish true optokinetic tracking from normal behavioral movements and ensure blinding during assessment.
