Análise 3D de respostas multicelulares a gradientes Quimioatrativos

As diferenças em culturas in vitro 2D simplificadas versus ambientes semelhantes a tecidos 3D aumentaram o interesse em sistemas 3D para representar a complexidade espacial e química dos tecidos vivos. O processo de fabricação não requer técnicas de instalação ou fotolitografia. No entanto, o dispositivo PDMS 3D inclui os vetores necessários para aplicações de ambiente fisiológico 3D.

Para a preparação do dispositivo mesofluido, use um programa de software de design tridimensional tridimensional para projetar a máscara do molde para o dispositivo polidimetilsiloxano ou PDMS e imprimir o molde usando equipamento de litografia estereotéreo com uma resina termoresistante. Quando o molde estiver pronto, misture aproximadamente três mililitros de solução monômero PDMS por molde com um agente de cura a uma proporção de 10 para um e use um vácuo para desgas a mistura em um desiccador de vácuo por uma hora. No final da dessecação, use um pedaço de fita adesiva para remover qualquer poeira da superfície do molde e encher cuidadosamente o molde com a solução PDMS desgasecida.

Em seguida, cure o PDMS a 80 graus Celsius por duas horas antes de permitir que o molde esfrie à temperatura ambiente. Quando o molde for resfriado ao toque, use uma lâmina para cortar o limite entre o molde e o PDMS e retire cuidadosamente o PDMS do molde. Corte o PDMS para caber um deslizamento de cobertura de 22 por 22 milímetros e faça um furo na entrada.

Usando tecidos de fiapos baixos e 70% de etanol, limpe o dispositivo e cubra o dispositivo com uma nova peça de fita adesiva para remover quaisquer partículas de poeira grandes. Em seguida, autoclave o dispositivo PDMS e cubra a 121 graus Celsius por oito minutos molhados e 15 minutos secos e trate a superfície inferior da parte PDMS e cubra com uma arma de descarga de corona por cinco minutos em uma capa de cultura de tecido antes de unir as peças. Para carregar o dispositivo, primeiro resuspenco as células de interesse em um volume adequado de crescimento médio suplementado com penicilina de 1%e estreptomicina e 1% insulina-transferrin-selênio-x.

Em seguida, misture 50 microliters da suspensão celular da glândula mamária com 425 microliters de solução de colágeno neutralizada recém-preparada e encha uma pipeta de 200 microliteres com a suspensão celular de colágeno. Injete a suspensão através da entrada no dispositivo PDMS até que toda a câmara esteja cheia e coloque o dispositivo na incubadora a 37 graus Celsius com dióxido de carbono de 5% por uma hora para induzir a gelação antes de encher os reservatórios de ambos os lados com meio de crescimento e retornar o dispositivo à incubadora até que a imagem confocal. Para imagem 3D e quantificação, instale uma câmara de cultura de imagem de células vivas em um microscópio confocal e predefina a temperatura e o dióxido de carbono a 37 graus Celsius e 5%, respectivamente.

Adicione água ao reservatório da câmara de imagem para umidificar a câmara, colocando lenços umedecidos na câmara conforme necessário e coloque o dispositivo PDMS na câmara. Adicione o fator de crescimento epidérmico a um dos reservatórios como fonte do fator na formação de gradientes deixando o outro reservatório para servir de pia para o desenvolvimento da distribuição do fator de crescimento epidérmico espacialmente classificado. Em seguida, defina o alcance da pilha Z cobrindo o volume de organoides de interesse e inicie a imagem.

Ao final do experimento, use um programa de análise de imagem adequado para medir o comprimento e o ângulo dos ramos que se estendem dos organoides ou a migração de células individuais. Tanto em testes de silico quanto in vitro revelaram a formação de um gradiente de fator de crescimento epidérmico linear estável em toda a área de cultura celular que dura aproximadamente dois dias sem reposição dos reservatórios de origem ou pia sugerindo que o fator de crescimento epidérmico, uma proteína de 6,4 quilodalton, pode formar um gradiente estável à base de difusão dentro de um gel de colágeno preparado como demonstrado em um período relativamente curto de tempo. Organoides mamários formam múltiplos ramos na presença de fator de crescimento epidérmico nanomolar espacialmente uniforme 2,5 nanomolar sem viés direcional ao longo de três dias se o fator de crescimento epidérmico for adicionado no gradiente linear para ter 0,5 nanomolar por mililitro.

No entanto, a formação do ramo apresenta um viés direcional significativo. Note-se que a adição de inibidores de junção de lacunas suprime a capacidade dos organoides de responder ao gradiente. O pH da solução de colágeno é fundamental para a gelação e viabilidade celular.

Se o colágeno não for neutralizado antes da mistura, a viabilidade da célula será baixa. Este método pode ser estendido para acomodar modelagem de tecido mais realista e poderia acomodar a formação de rede vascular a partir de células individuais dentro do gel.