Name: Análise 3D de respostas multicelulares a gradientes Quimioatrativos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Aprenda a construir dispositivos PDMS para cultivo 3D e análise de respostas celulares a gradientes quimioatrativos. Este método permite estudar organoides com maior sensibilidade a sinais fracos em ambientes que simulam tecidos vivos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado por subsídios à AJE (NSF PD-11-7246, Fundação de pesquisa em câncer de mama (BCRF-17-048) e NCI U54 CA210173) e AL (U54CA209992).

Todo o trabalho animal foi conduzido de acordo com protocolos revisados e aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais da Universidade Johns Hopkins, faculdade de medicina.
1. fabricação do dispositivo mesofluídico
<ol><li>Projete a máscara do molde para o dispositivo de PDMS usando um software do CAD 3D.</li>
	<li>Imprima o molde usando o equipamento do estereolitografia com uma resina resistente térmica. Nota: os procedimentos aqui descritos foram realizados por um serviço de impressão 3D comercial.</li>
	<li>Misture completamente uma solução do monômero de PDMS com o agente de cura em uma relação 10:1. 3 mL de mistura PDMS foi necessária para a fabricação do dispositivo. O volume total depende do número de moldes a serem fabricados.</li>
	<li>Degas a mistura aplicando um vácuo com o uso de um vácuo ou de uma bomba de vácuo da em-casa em um exsicador do vácuo por 1 hora.</li>
	<li>DAB a superfície do molde com uma fita adesiva para remover a poeira, e despeje então a mistura de PDMS ao molde. Se forem introduzidas bolhas no processo, repita a desgaseificação no vácuo. Bolhas presas entre os pilares do molde pode ser removido por picando-los com uma agulha afiada. Nota: o processo de desgaseificação à temperatura ambiente deve ser feito dentro de 1 hora ou menos.</li>
	<li>Cure o PDMS por aquecimento a 80 ° c por 2 horas. Deixe o molde arrefecer à temperatura ambiente.</li>
	<li>Corte o limite entre o molde e o PDMS com uma lâmina e descasque então fora PDMS do molde com cuidado.</li>
	<li>Aparar a peça PDMS para caber o 22 mm x 22 mm lamela e perfurar um furo na entrada. Observação: o protocolo pode ser pausado aqui.</li>
	<li>Limpe a peça PDMS e a lamínula de 22 mm x 22 mm limpando as superfícies com tecidos de baixo-Lint e 70% de etanol. Em seguida, remova partículas de poeira grandes por dabbing com uma fita adesiva.</li>
	<li>Esterilizar a peça de PDMS e a lamínula por autoclavagem (121 ° c por 8 minutos molhados, 15 minutos secos) ou exposição à luz UV por 1 hora.</li>
	<li>Trate a superfície inferior da peça do PDMS e deslize a tampa com o injetor da descarga da Corona por 5 minutos na capa da cultura do tecido e lig-os então junto. Cuidado: Coloque qualquer material não condutor, como espuma de poliestireno na parte inferior e remova todos os materiais condutores durante este processo. Injete o colagénio no dispositivo imediatamente, dentro de 5 minutos, após o tratamento para aumentar a ligação entre o gel do colagénio e o COVERSLIP de vidro.</li>
</ol>2. preparação da pilha: isolação organoid mamária preliminar
Nota: os detalhes da isolação organoid mamária podem ser encontrados em um trabalho precedente11. Qualquer tipo de célula única ou organóide pode ser preparado de acordo com seus próprios protocolos de isolamento/destacamento.
<ol><li>Mince o tecido da glândula mamária dos camundongos com um bisturi até que o tecido relaxe e agite por 30 min a 37 ° c em 50 mL de solução de colagenase/tripsina (10 mL por rato) em DEME/F12 suplementado com 0,1 g de tripsina, 0,1 g de colagenase , 5 mL de FBS, 250 μL de 1 μg/mL de insulina e 50 μL de 50 μg/mL de gentamicina.</li>
	<li>Centrifugue a solução de colagenase/tripsina a 1.250 x g durante 10 min. Retire o sobrenadante por aspiração. Dispersar células em 10 mL de DMEM/F12, e centrifugar a 1.250 x g por 10 min. Após a remoção de DMEM/F12 por aspiração, resuspenda as células em 4 mL de DMEM/F12 suplementados com 40 μL de DNase (2 unidades/μL).</li>
	<li>Agitar a solução DNase à mão por 2-5 min e, em seguida, centrifugar a 1.250 x g por 10 min.</li>
	<li>Separe organóides de células simples através de quatro centrífugas diferenciais (pulso para 1.250 x g e parar a centrífuga 3-4 s depois que atinge a velocidade pretendida). Entre cada pulso, aspirar o sobrenadante e suspender a pelota em 10 mL de DMEM/F12.</li>
	<li>Resuspender a pelota final na quantidade desejada de meio de crescimento de DMEM/F12 com 1% de penicilina/estreptomicina e 1% de insulina-transferrina-Selenium-X para preparação de colágeno.</li>
</ol>3. preparação e injeção de colágeno
Nota: outros tipos de géis ECM podem ser preparados de acordo com seus próprios protocolos de gelação.
<ol><li>Prepare a solução do tipo I do colagénio (3,78 mg/mL), 10x DMEM, 1 solução de NaOH do N, meio normal do crescimento no gelo. Nota: Mantenha no gelo até que o procedimento esteja terminado.</li>
	<li>Adicione 6 μL de solução de 1 N NaOH, 200 μL de meio de crescimento e 50 μL de 10x DMEM em um tubo de microcentrífuga pré-resfriado e misture a solução completamente.</li>
	<li>Adicione 425 μL de colágeno na solução pré-misturada e misture cuidadosamente com pipetagem.</li>
	<li>Centrifugue a mistura de colágeno brevemente (menos de 5 segundos) para separar e remover bolhas da mistura.</li>
	<li>Mantenha a solução de colágeno neutralizada no gelo por 1 hora para induzir a formação de fibras.</li>
	<li>Adicione 50 μL de suspensão celular na mistura de colágeno e misture completamente. Nota: a concentração final de colágeno é de 2 mg/mL.</li>
	<li>Injete a solução usando 200 μL de Pipet através da entrada do dispositivo PDMS até que toda a câmara seja preenchida. Se a mistura de colágeno transborda através das lacunas de pilares, cortar o excesso de colágeno gel com lâmina cirúrgica afiada após a geladura.</li>
	<li>Mantenha o dispositivo na incubadora a 37 ° c com 5% de CO2 por 1 hora para induzir a geladura.</li>
	<li>Encha os reservatórios de ambos os lados com meio de crescimento e mantenha o dispositivo na incubadora a 37 ° c com 5% de CO2 até que a imagem confocal seja realizada.</li>
</ol>4. imagem latente 3D e quantificação
<ol><li>Instale uma câmara da cultura da imagem latente da vivo-pilha a um microscópio confocal e pré-ajuste a temperatura e o CO2 a 37 ° c e a 5%, respectivamente. Para obter umidade, adicione água no reservatório da câmara e coloque lenços umedecidos na câmara, se necessário.</li>
	<li>Coloque o dispositivo PDMS na câmara e adicione EGF a um dos reservatórios como uma "fonte" do FEG na formação de gradiente. O outro reservatório servirá uma "pia" necessária para o desenvolvimento da distribuição EGF espacialmente graduada. 2,5 nM de EGF foi adicionado na pia para fazer o gradiente de 0,5 nM/mm neste estudo.</li>
	<li>Defina o intervalo de Z-Stack cobrindo o volume de organóides de interesse e iniciar a imagem. Cuidado: para evitar a fototoxicidade, tente uma intensidade mais baixa do laser na imagem latente Confocal ou use técnicas da imagem latente do multi-fotão.</li>
	<li>Reconstruir uma imagem 3D a partir de pilhas de imagens 2D usando um software comercial ou um programa feito medida. Meça o comprimento e o ângulo das filiais que estendem dos organóides ou da migração de pilhas individuais. Aqui, realize a quantificação desenhando um contorno à mão livre ao redor do corpo organoide usando o ImageJ.</li>
</ol>

<ol><li>Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+and+extracellular+matrix+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).</li>
<li>Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins%3A+emerging+paradigms+of+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrins: emerging paradigms of signal transduction.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).</li>
<li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Stem+Cell+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Engineering Stem Cell Organoids.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).</li>
<li>Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+3D+matrix+microenvironment+regulates+cell+migration+through+spatiotemporal+dynamics+of+contractility-dependent+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions.</a> Nature Communications. 6, 8720(2015).</li>
<li>Meyvantsson, I., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+models+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry+%28Palo+Alto%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Cell culture models in microfluidic systems.</a> Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).</li>
<li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
<li>Zervantonakis, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+microfluidic+model+for+tumor+cell+intravasation+and+endothelial+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).</li>
<li>Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluidic+device+to+study+directional+angiogenesis+in+complex+tissue+and+organ+culture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models.</a> Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).</li>
<li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+lapse+investigation+of+antibiotic+susceptibility+using+a+microfluidic+linear+gradient+3D+culture+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device.</a> Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).</li>
<li>Ellison, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+communication+enhances+the+capacity+of+cell+ensembles+to+sense+shallow+gradients+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).</li>
<li>Nguyen-Ngoc, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+culture+assays+of+murine+mammary+branching+morphogenesis+and+epithelial+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A fabricação de moldes PDMS foi realizada utilizando um serviço de impressão 3D comercial, mas também pode ser realizada por uma impressora 3D de alta-final em casa. Entre os vários métodos da fabricação 3D, o estereolitografia é recomendado para a geração de molde de alta resolução. Como a cura do PDMS ocorre em uma temperatura alta (80 ° c), os materiais devem ser suficientemente resistentes a termicamente, o que deve ser explicitamente especificado, se a impressão for terceirizada. Uma pós-cura térmica pode ser discut...

No ambiente fisiológico, as células são incorporadas em uma matriz extracelular (ECM) e expostas a uma infinidade de biomoléculas. As interações entre as células e o microambiente circundante regulam processos intracelulares controlando diversos fenótipos, incluindo migração, crescimento, diferenciação e sobrevida1,2. Muito tem sido aprendido sobre os comportamentos celulares em uma cultura de células 2D convencional. Entretanto, com o advento da imagem latente e da experimentação intravital com as pilhas encaixadas em hydrogels 3D, as diferenças importantes em comportamentos da pilha foram reconhecidas nas culturas 2D in vitro simplificadas contra o tecido 3D-como ambientes. Enquanto as células interagem com as fibras de ECM e sentem suas propriedades mecânicas dentro da matriz 3D, a rigidez do material do gel não é uma variável totalmente independente em um sistema in vitro 2D. A dimensionalidade altera a formação de adesão focal, resultando em diferentes morfologia e comportamento celular. Além disso, as células em uma superfície 2D são expostas a menos sinais de sinalização do que as células abertas a todas as direções em 3D.
Essas limitações aumentaram os interesses dos sistemas 3D que representam a complexidade espacial e química dos tecidos vivos e melhor prever as funções in vivo do tecido. Eles foram desenvolvidos em muitas formas de organóides como microestruturas celulares de automontagem para células aleatoriamente intercaladas em ECM3,4. Os recentes avanços nas tecnologias de microfabricação facilitaram o advento de vários tipos de sistemas de cultura 3D5,6,7, 8,9 para o estudo de alterações fenotípicas e respostas celulares a sinais solúveis; no entanto, as barreiras tecnológicas limitam o uso generalizado em laboratórios de pesquisa. Em muitos casos, os processos de fabricação requerem técnicas de fotolitografia e conhecimentos de fundo para litografia suave. Além disso, vários fatores devem ser controlados para construir com sucesso um dispositivo e para conseguir uma função óptima do dispositivo durante um longo período de tempo.
Nosso método descreve como construir um dispositivo 3D PDMS para incorporar células e organóides multicelulares em um microambiente 3D com gradientes quimioatrativos definidos e, em seguida, analisar respostas epiteliais ao EGF10. Nossos dados revelam que a capacidade de organóides para responder a gradientes de EGF superficial surge do acoplamento químico intercelular através de junções de Gap. Sugere o potencial de organóides para a deteção mais precisa de entradas espacially graduadas fracas e ruidosas. O processo da fabricação não exige uma facilidade da sala de limpeza nem técnicas do photolithography. No entanto, o dispositivo 3D PDMS inclui os fatores necessários do ambiente fisiológico 3D. Este método será útil para estudar os comportamentos celulares 3D e tem grande potencial de pesquisa com diferentes tipos de células, quimioattractantes e combinações de ECM.

<table><tbody><tr><td>Lamínula de 22mm x 22mm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno I, Rato</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40236</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>COMSOL Multiphysics 4.2</td><td>COMSOL Inc</td><td></td><td>Usado para simular dinâmica de difusão</td></tr><tr><td>10x DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2429</td><td></td></tr><tr><td>DEME/F12</td><td>Thermo</td><td>Fisher 11330032</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4623</td><td></td></tr><tr><td>EGF Proteína Recombinante de Camundongo</td><td>Thermo Fisher</td><td>PMG8041</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Fiji-ImageJ</td><td></td><td></td><td>Usado para medir o comprimento e os ângulos de ramificação</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>GIBCO&nbsp;</td><td>5750-060</td><td></td></tr><tr><td>IMARIS</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19278</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferrina-Selênio-X</td><td>GIBCO&nbsp;</td><td>51500</td><td></td></tr><tr><td>Tecido de baixa formação em fiapos</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>Kimtech wipe</td><td></td></tr><tr><td>Material do molde</td><td>Proto labs</td><td>Accura SL5530&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento de impressão de moldes</td><td>Proto labs</td><td>Stereolithogrphy</td><td>Dimensão máxima: 127 mm x 127 mm x 63,5 mm, Espessura da camada: 0,0254 mm</td></tr><tr><td>Serviço de impressão de moldes</td><td>Proto labs</td><td>Custom</td><td>https://www.protolabs.com/</td></tr> <tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>VWR</td><td>16777-164P</td><td></td></tr><tr><td>Disco giratório confocal microscópio</td><td>Solamere Technology Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>184 SIL ELAST KIT&nbsp;</td><td>Kit PDMS</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9935</td><td></td></tr></tbody></table>

análise 3d de respostas multicelulares a gradientes quimioatrativos

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Várias limitações de sistemas de cultura de células 2D têm despertou interesse em plataformas de análise e cultura de células 3D, o que seria melhor imitar a complexidade espacial e química dos tecidos vivos e imitar as funções de tecido in vivo. Os recentes avanços nas tecnologias de microfabricação facilitaram o desenvolvimento de ambientes in vitro em 3D em que as células podem ser integradas em uma matriz extracelular bem definida (ECM) e um conjunto definido de biomoléculas solúveis ou matriciais associadas. No entanto, as barreiras tecnológicas limitaram seu uso generalizado em laboratórios de pesquisa. Aqui, descrevemos um método para construir dispositivos simples para a cultura 3D e experimentação com células e organóides multicelulares em microambientes 3D com um gradiente quimioatractivo definido. Nós ilustramos o uso desta plataforma para a análise da resposta de pilhas epithelial e de organóides aos gradientes de fatores de crescimento, tais como o fator de crescimento epidérmico (EGF). Os gradientes de EGF eram estáveis nos dispositivos por diversos dias que conduzem à formação dirigida da filial em organoids da mama. Essa análise permitiu concluir que a detecção coletiva de gradiente por grupos de células é mais sensível versus células individuais. Nós igualmente descrevemos o método da fabricação, que não exige facilidades do photolithography nem técnicas macias avançadas da litografia. Este método será útil para estudar os comportamentos celulares 3D no contexto da análise do desenvolvimento e dos Estados patológicos, incluindo o câncer.

EGF é um regulador essencial da morfogênese ramificando em glândulas mamárias e um quimioatractivo crítico orientando a migração de células epiteliais do peito no crescimento do cancro invasivo. Utilizamos os dispositivos fluílicos mesoscópicos descritos acima para estudar a resposta das células aos gradientes de EGF definidos (Figura 1a, B)10. O dispositivo produz uma área de cultura de 5 mm de largura, 10 mm de compr...

Nós descrevemos um método para construir dispositivos para a cultura 3D e a experimentação com pilhas e os organoids multicelular. Este dispositivo permite a análise de respostas celulares a sinais solúveis em microambientes 3D com gradientes quimioatrativos definidos. Os organóides são melhores do que as células únicas na detecção de entradas barulhentas fracas.

Análise 3D de respostas multicelulares a gradientes Quimioatrativos

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

As diferenças em culturas in vitro 2D simplificadas versus ambientes semelhantes a tecidos 3D aumentaram o interesse em sistemas 3D para representar a complexidade espacial e química dos tecidos vivos. O processo de fabricação não requer técnicas de instalação ou fotolitografia. No entanto, o dispositivo PDMS 3D inclui os vetores necessários para aplicações de ambiente fisiológico 3D.Para a preparação do dispositivo mesofluido, use um programa de software de design tridimensional tridimensional para projetar a máscara do molde para o dispositivo polidimetilsiloxano ou PDMS e imprimir o molde usando equipamento de litografia estereotéreo com uma resina termoresistante. Quando o molde estiver pronto, misture aproximadamente três mililitros de solução monômero PDMS por molde com um agente de cura a uma proporção de 10 para um e use um vácuo para desgas a mistura em um desiccador de vácuo por uma hora. No final da dessecação, use um pedaço de fita adesiva para remover qualquer poeira da superfície do molde e encher cuidadosamente o molde com a solução PDMS desgasecida.Em seguida, cure o PDMS a 80 graus Celsius por duas horas antes de permitir que o molde esfrie à temperatura ambiente. Quando o molde for resfriado ao toque, use uma lâmina para cortar o limite entre o molde e o PDMS e retire cuidadosamente o PDMS do molde. Corte o PDMS para caber um deslizamento de cobertura de 22 por 22 milímetros e faça um furo na entrada.Usando tecidos de fiapos baixos e 70% de etanol, limpe o dispositivo e cubra o dispositivo com uma nova peça de fita adesiva para remover quaisquer partículas de poeira grandes. Em seguida, autoclave o dispositivo PDMS e cubra a 121 graus Celsius por oito minutos molhados e 15 minutos secos e trate a superfície inferior da parte PDMS e cubra com uma arma de descarga de corona por cinco minutos em uma capa de cultura de tecido antes de unir as peças. Para carregar o dispositivo, primeiro resuspenco as células de interesse em um volume adequado de crescimento médio suplementado com penicilina de 1%e estreptomicina e 1% insulina-transferrin-selênio-x.Em seguida, misture 50 microliters da suspensão celular da glândula mamária com 425 microliters de solução de colágeno neutralizada recém-preparada e encha uma pipeta de 200 microliteres com a suspensão celular de colágeno. Injete a suspensão através da entrada no dispositivo PDMS até que toda a câmara esteja cheia e coloque o dispositivo na incubadora a 37 graus Celsius com dióxido de carbono de 5% por uma hora para induzir a gelação antes de encher os reservatórios de ambos os lados com meio de crescimento e retornar o dispositivo à incubadora até que a imagem confocal. Para imagem 3D e quantificação, instale uma câmara de cultura de imagem de células vivas em um microscópio confocal e predefina a temperatura e o dióxido de carbono a 37 graus Celsius e 5%, respectivamente.Adicione água ao reservatório da câmara de imagem para umidificar a câmara, colocando lenços umedecidos na câmara conforme necessário e coloque o dispositivo PDMS na câmara. Adicione o fator de crescimento epidérmico a um dos reservatórios como fonte do fator na formação de gradientes deixando o outro reservatório para servir de pia para o desenvolvimento da distribuição do fator de crescimento epidérmico espacialmente classificado. Em seguida, defina o alcance da pilha Z cobrindo o volume de organoides de interesse e inicie a imagem.Ao final do experimento, use um programa de análise de imagem adequado para medir o comprimento e o ângulo dos ramos que se estendem dos organoides ou a migração de células individuais. Tanto em testes de silico quanto in vitro revelaram a formação de um gradiente de fator de crescimento epidérmico linear estável em toda a área de cultura celular que dura aproximadamente dois dias sem reposição dos reservatórios de origem ou pia sugerindo que o fator de crescimento epidérmico, uma proteína de 6,4 quilodalton, pode formar um gradiente estável à base de difusão dentro de um gel de colágeno preparado como demonstrado em um período relativamente curto de tempo. Organoides mamários formam múltiplos ramos na presença de fator de crescimento epidérmico nanomolar espacialmente uniforme 2,5 nanomolar sem viés direcional ao longo de três dias se o fator de crescimento epidérmico for adicionado no gradiente linear para ter 0,5 nanomolar por mililitro.No entanto, a formação do ramo apresenta um viés direcional significativo. Note-se que a adição de inibidores de junção de lacunas suprime a capacidade dos organoides de responder ao gradiente. O pH da solução de colágeno é fundamental para a gelação e viabilidade celular.Se o colágeno não for neutralizado antes da mistura, a viabilidade da célula será baixa. Este método pode ser estendido para acomodar modelagem de tecido mais realista e poderia acomodar a formação de rede vascular a partir de células individuais dentro do gel.

3d-analysis-of-multi-cellular-responses-to-chemoattractant-gradients

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este protocolo descreve o desenvolvimento de um dispositivo micro para investigar quimiotaxia bacteriana em gradientes de concentração estável de chemoeffectors.

Um dispositivo micro para Quantificar Quimiotaxia bacteriana em gradientes de concentração estável

Uma abordagem para analisar a migração de células explantadas (células tronco da crista neural) é descrita. Este método é barato, suave, e é capaz de distinguir a quimiotaxia tanto de quimiocinese e outras influências sobre a polaridade migratórias tais como aqueles derivados de interacções célula-célula dentro da cultura de células primária tronco da crista neural.

Análise de Tronco de Migração da crista neural celular usando uma modificação Zigmond Ensaio Câmara

Este vídeo demonstra o ensaio de quimiotaxia de neutrófilos usando um método all-on-chip. O método permite o isolamento direto de neutrófilos do sangue total por seleção imunomagnética negativa seguida de ensaio de quimiotaxia em um chip microfluídico.

Um método baseado em chip microfluídico para análise rápida de quimiotaxia de neutrófilos usando sangue total

Um método para a montagem de gradientes de adesivo e solúvel em uma câmara de microscopia para estudos de migração de células vivas é descrito. O ambiente artificial combina superfícies antivegetativas e faixas adesivas com gradientes de solução e, portanto, permite que se determine a importância relativa das pistas de orientação.

Criando Gradientes adesivas e solúvel para a migração celular Imaging com Microscopia de Fluorescência

O dispositivo de câmara de fluxo tridimensional é a...

Um dispositivo de câmara de fluxo tridimensional Novel para estudar Chemokine dirigido extravasamento de células circulantes fisiológicos sob condições de fluxo

A migração celular é uma parte importante do desenvolvimento e da vida humana. A fim de entender os mecanismos que podem alterar a migração celular, apresentamos um sistema de difusão de gradiente planar para investigar a quimiotaxia em uma matriz de colágeno 3D, o que permite superar as limitações modernas da câmara de difusão dos ensaios existentes.

Gradiente planar do sistema de difusão para investigar Quimiotaxia numa Matriz de Colagénio 3D

ensaios de quimiotaxia visuais são essenciais para um melhor entendimento de como as células eucarióticas controlar a migração celular mediada por direccional quimioatractor. Aqui, descrevemos métodos detalhados para: 1) em tempo real, monitoramento de alta resolução de vários ensaios de quimiotaxia, e 2) visualizando simultaneamente o gradiente quimioatrativo ea dinâmica espaço-temporais de eventos de sinalização em células HL60 neutrófilos-like.

Imagiologia G protein-coupled receptor mediada por quimiotaxia e seus eventos de sinalização em células de HL60 de Neutrófilos-like

Este artigo fornece o método detalhado de realização de um teste rápido de quimiotaxis de neutrófilos integrando o isolamento de neutrófilos no chip do sangue total e o teste de quimiotaxia em um único microfluídico.

Um método All-on-chip para análise rápida de quimiotaxis de neutrófilos diretamente de uma gota de sangue

Aqui descrevemos os métodos para avaliar a resposta celular à estimulação mecânica aguda. No ensaio baseado em microscopia, examinamos a localização de biosensores fluorescente-etiquetadas após estimulação breve com fluxo de cisalhamento. Também testamos a ativação de várias proteínas de interesse em resposta à estimulação mecânica aguda bioquimicamente.

Avaliação de Dictyostelium discoideum resposta à estimulação mecânica aguda

Migração de células coletivas em desenvolvimento, cicatrização de feridas e metástase oncológica é muitas vezes guiada pelos gradientes de fatores de crescimento ou moléculas de sinalização. Descrito aqui é um sistema experimental que combina microscopia de tração com um sistema microfluídico e uma demonstração de como quantificar a mecânica da migração coletiva gradiente bioquímico.

Microscopia de tração integrada com Microfluidics para migração coletiva Chemotactic

Aprenda a construir dispositivos PDMS para cultivo 3D e análise de respostas celulares a gradientes quimioatrativos. Este método permite estudar organoides com maior sensibilidade a sinais fracos em ambientes que simulam tecidos vivos.

Análise 3D de respostas multicelulares a gradientes Quimioatrativos

Explorar mais vídeos