Name: O uso de células tumorais do rato mamário em um ensaio de invasão in vitro como medida de comportamento de células oncogênicas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Aprenda a realizar ensaios de invasão in vitro com células tumorais mamárias de rato para estudar migração celular e metástase do câncer. Este método permite quantificar a capacidade invasiva e identificar genes relacionados à progressão tumoral.

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Este trabalho foi apoiado pela concessão R15CA169978 dos institutos nacionais de saúde. O financiamento adicional veio da Universidade de Villanova.

Todos os experimentos e métodos foram realizados como autorizados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais da Universidade Villanova (IACUC).
1. expressão gênica em células tumorais cultivadas de camundongo mamária
<ol><li>Primeiro, prepare as linhas de célula a serem testadas.</li>
	<li>
Use uma colônia de reprodutores de camundongos BALB/cV. Esses camundongos carregam a cepa Balb/CV do vírus do tumor mamário do camundongo, transmitida aos filhotes no leite6,7. 50 por cento de fêmeas de melhoramento desenvolvem tumores mamária por 10 meses da idade.
	<ol>
<li>Para estabelecer uma linha celular do tumor, Sacrifique uma represa do tumor-rolamento usando um protocolo IACUC-aprovado. Mergulhe a pele abdominal em 70% EtOH e retire o tumor condições estéreis em uma capa de fluxo laminar. Os tumores são subcutaneous, assim que tome o cuidado para evitar perfurar o peritoneum.</li>
		<li>Coloc fragmentos do tumor das áreas não-Necrotic em um prato de Petri com uma pequena quantidade de Hanks estéril solução salina equilibrada (HBSS) e mince muito finamente com uma lâmina de navalha estéril.</li>
		<li>Transfira os aglomerados de células dispersas para um balão de cultura de células T25 contendo 5 mL de meio de águia modificada de Dulbecco ou DMEM (4,5 g/L de glicose, vermelho fenol e L-glutamina) suplementados com 50% de soro bovino fetal ou FBS e 1% de antibiótico/solução antimicótica. Cresça pilhas em frascos tratados da cultura de pilha em uma incubadora com 5% CO2 e 100% umidade em 37 ° c.</li>
		<li>Lave as células não aderentes após 24-48 h e substitua o DMEM por 50% de FBS e 1% de antibiótico/solução antimicótica. Devolva as células para a incubadora.</li>
		<li>Substitua a mídia de cultura líquida a cada 3 dias.</li>
		<li>Dividir ou passar as células quando eles são 90% confluente. Remover meios de cultura e lavar as células aderentes com HBSS (sem cálcio ou magnésio). Incubar células com solução de 0,25% de Trypsin-EDTA por 1-5 min a 37 ° c até que as células sejam arredondadas e separadas. Diluir as células 1:10 em meios de cultura frescos e adicionar a um novo balão. Um balão da cultura da pilha T-25 exige 5-8 meios de cultura do mL, 5 mL de HBSS para lavar, e 1 mL do trypsin-EDTA à passagem. Devolva o balão para a incubadora.</li>
		<li>Reduza a concentração de FBS a 40% após a primeira passagem, então 30% após a segunda passagem, então 20% após a terceira passagem, e finalmente 10% para todas as passagens subseqüentes. O processo de estabelecimento de crescimento no meio DMEM padrão com 10% FBS requer quatro passagens e 2-8 meses.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Uma vez que as linhas celulares são estabelecidas, altere a expressão de suspeita de oncogenes por transfecção de shRNA visando mRNA ou CRISPR para genes não essenciais.
	<ol>
<li>Estabeleça linhas celulares estáveis resistentes a antibióticos com clones individuais que são verificados por Western blot e/ou RT-qPCR para resultados consistentes, no entanto, Transfections transitórios podem funcionar bem, uma vez que o ensaio requer apenas 22 h. controlar linhas de células com sequências de destino não específicas também são necessárias.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ensaio de invasão in vitro
<ol><li>Cresça as pilhas de tumor mamária aderentes do rato em um frasco T25 até 70-90% confluente para o dia 1 do experimento. Nota: Outras linhas celulares ou condições experimentais podem exigir meios de cultura de células diferentes. Por exemplo, se as células de câncer de mama responsivo a hormônio estão sendo testadas, soro filtrado de carvão pode ser necessário para remover compostos que ativam estrogênio ou outros receptores hormonais.</li>
	<li>Prepare as inserções da câmara de Boyden aquecendo-as à temperatura ambiente (do armazenamento de-20 ° c) por aproximadamente 20 minutos em uma capa da cultura de pilha. Evite ciclos de congelamento para inserções não utilizadas. Use três inserções (replicações) para gerar dados estatisticamente válidos para cada linha de célula para cada experimento.
	<ol>
<li>Adicionar pré-aquecido 37 ° c soro-livre DMEM mídia para o poço e, em seguida, a inserção. Para inserções projetadas para 24 pratos bem, adicione 500 μL de DMEM sérico-livre ao poço e então 500 μL de DMEM soro-livre à inserção assim que a membrana e o gel porosos são hidratados em ambos os lados. Nota: Para inserções maiores projetadas para um prato de 6 poços, use 2 mL de DMEM sem soro em ambos os lados.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloc o prato com inserções em uma incubadora da cultura de pilha de 37 ° c com 5% CO2 e 100% de umidade para pelo menos 2 h para hidratar e ACCLIMATE completamente.</li>
	<li>Prepare as células removendo a mídia de crescimento e enxaguando as células com 5 mL de HBSS.
	<ol>
<li>Retire o HBSS e adicione 1 mL 0,25% de solução de tripsina-EDTA por 1-5 min a 37 ° c ou até que as células apareçam arredondadas ou mostrem sinais de descolamento do balão.</li>
		<li>Bata suavemente no balão para separar todas as células. Suspender as células em 5 mL de DMEM + 10% FBS e transferir para um tubo de centrífuga estéril de 15 mL.</li>
		<li>Centrifugue as pilhas em 1.000 x g por 5 minutos para pellet suavemente as células. Retire a mídia e substitua por 5 mL de DMEM sem soro para ressuscite as células.</li>
		<li>Repita a centrifugação e a suspensão em meios soro-livres duas vezes mais para um total de 3 lavas.</li>
		<li>Completamente Ressuspender as células no final 5 mL de soro-livre DMEM e garantir que não há aglomerados de células.</li>
	</ol></li>
	<li>Determine a concentração da pilha usando um Hemocytometer. Conte apenas células viáveis. Diluir a suspensão da célula para 5 x 104 células/ml em 5 ml de DMEM sem soro. Nota: Esta concentração rende 2.500 células por pastilha em um prato de 24 poços. Este número de células é suficiente para células cancerosas agressivas com altas taxas de migração e invasão. Linhas celulares menos agressivas podem exigir mais células, até 10.000 células por inserção para células invasoras observáveis. Se a invasão celular reduzida for esperada, considere maximizar as células invasoras aumentando o número da célula. Se o aumento da invasão celular for esperado, comece com menos células.</li>
	<li>Retire o prato de cultura celular da incubadora e aspirar suavemente a mídia a partir da inserção. Levante a pastilha e aspirar a mídia do poço. Trabalhando rapidamente, adicione o chemoattractant à câmara mais baixa. Para um prato de 24 poços, adicione 750 μL de DMEM com 5% de FBS.
	<ol>
<li>Coloque a pastilha no poço e adicione as células à pastilha. Para um prato de 24 poços, use 500 μL de suspensão celular. Para uma pastilha de prato de 6 poços, use 2,5 mL de quimioatração e 2 mL de células. Certifique-se de que não há bolhas de ar presentes em ambos os lados da membrana.</li>
		<li>Devolva o prato para a incubadora da cultura celular por 22 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Após 22 h, fixar e manchar as células. Prepare uma solução de 1% paraformaldeído em 1x fosfato tampão salina (PBS) para fixação.
	<ol>
<li>Em um prato limpo da cultura da pilha 24-well, adicione 1 mL do fixador aos poços individuais assim que há um poço para cada inserção.</li>
		<li>Prepare a solução de coloração (recém-feita) de 0,1% cristal violeta (w/v) em uma solução de PBS com 10% de etanol (v/v). Da mesma forma, adicione 1 mL de solução de coloração a um poço limpo em um prato de cultura de 24 poços para cada pastilha.</li>
		<li>Retire cada pastilha um de cada vez com fórceps e coloque um cotonete estéril dentro da pastilha e esfregue o lado superior da membrana para remover as células não migradas.</li>
		<li>Repita com um segundo cotonete de algodão. A membrana é bastante forte, pressão tão suave enquanto limpando não compromete a integridade da membrana.</li>
		<li>Remova qualquer mídia restante do interior da pastilha e adicione 750 μL de PBS para lavar as células separadas.</li>
		<li>Retire o PBS e repita a lavagem. Coloque a pastilha em um fixador bem contendo para fixar as células migradas na parte inferior da membrana. Repita para todas as inserções.</li>
		<li>Fixar as pastilhas durante 15 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Após a fixação, retire a pastilha. Lave novamente a pastilha com 750 μL de PBS.</li>
		<li>Coloque a pastilha no poço com a solução de coloração para manchar todas as células migradas e fixas. Manchar as células por 15 min à temperatura ambiente. Nota: Para pastilhas de prato de 6 poços, use 2 mL de solução fixativa, 2 ml de solução de coloração e 2 mL de lavagem PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Use um copo com água destilada para senhor as inserções. Retire as pastilhas e mergulhe na água destilada até que a água que corre fora da pastilha seja clara.
	<ol>
<li>Retire as gotas de água em excesso e coloque as pastilhas sobre um papel de filtro lateralmente para secar ao ar (geralmente durante a noite).</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare a membrana para a imagem etiquetando uma corrediça de vidro limpa do microscópio para cada inserção e coloc uma gota pequena do óleo da imersão do microscópio no centro da corrediça.
	<ol>
<li>Retire a membrana da pastilha usando um bisturi para cortar em torno do perímetro da membrana no interior da pastilha plástica.</li>
		<li>Retire a membrana usando fórceps e coloque na parte superior da gota de óleo na corrediça para segurá-la no lugar. Nota: As membranas são muito finas e muito leves, para que possam ser facilmente perdidas pelo fluxo de ar suave.</li>
	</ol></li>
</ol>3. imagem e análise
<ol><li>Desde as membranas porosas são claras e manchas de células com cristal violeta dar-lhes contraste, use um microscópio de luz composto para ver as células. Use uma câmera e/ou software para quantificar para muitas amostras, mas não é necessário. Exibir células em ampliação de 5x, 10x ou 20x. Para quantificação, use múltiplas imagens não sobrepostas a uma ampliação de 10x. Alternativamente, conte todas as células migradas na membrana a uma ampliação de 10x.</li>
	<li>Determine o número total de células ou células invasoras por área para todas as amostras. Para cada experimento, realize cada condição no ensaio com três inserções replicantes e repita várias vezes para resultados estatisticamente úteis.</li>
	<li>Ao comparar diferentes linhas celulares com diferentes taxas de crescimento e taxas de migração, faça um experimento paralelo para comparar as células que invadem através de uma matriz proteica e comparar com um conjunto de câmara Boyden sem matriz proteica (somente células migradas). Calcule a invasão por cento para cada linha celular (número de células invadidas/número de células migradas x 100%). Nota: Essa abordagem pode ajudar a comparar a taxa de invasão às taxas de migração. Se a comparação de diferentes condições aplicadas à mesma linha celular, calculando a invasão sozinho é cálculos mais relevantes. A borda externa da membrana, por vezes, tem um maior número de células do que as áreas centrais e é, portanto, menos precisos. Se isso ocorrer, exclua essas células da quantificação e assegure-se de que todas as células sejam removidas por um cotonete em um experimento repetido.</li>
</ol>

<ol><li>He, X., Lee, B., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-ECM+Interactions+in+Tumor+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-ECM Interactions in Tumor Invasion.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 936, 73-91 (2016).</li>
<li>Albini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+in+vitro+assay+for+quantitating+the+invasive+potential+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells.</a> Cancer Research. 47 (12), 3239-3245 (1987).</li>
<li>Simon, N., Noel, A., Foidart, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+in+vitro+reconstituted+basement+membrane+assay+to+assess+the+invasiveness+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invasion+and+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of in vitro reconstituted basement membrane assay to assess the invasiveness of tumor cells.</a> Invasion and Metastasis. 12 (3-4), 156-167 (1992).</li>
<li>Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+from+discovery+and+ECM+mimicry+to+assays+and+models+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 3-18 (2014).</li>
<li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+basement+membrane+matrix+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).</li>
<li>Kang, J. J., Schwegel, T., Knepper, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+similarity+between+the+long+terminal+repeat+coding+regions+of+mammary-tumorigenic+BALB%2FcV+and+renal-tumorigenic+C3H-K+strains+of+mouse+mammary+tumor+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Sequence similarity between the long terminal repeat coding regions of mammary-tumorigenic BALB/cV and renal-tumorigenic C3H-K strains of mouse mammary tumor virus.</a> Virology. 196 (1), 303-308 (1993).</li>
<li>Slagle, B. L., Lanford, R. E., Medina, D., Butel, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+mammary+tumor+virus+proteins+in+preneoplastic+outgrowth+lines+and+mammary+tumors+of+BALB%2FcV+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of mammary tumor virus proteins in preneoplastic outgrowth lines and mammary tumors of BALB/cV mice.</a> Cancer Research. 44 (5), 2155-2162 (1984).</li>
<li>Schmidt, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+oncogenic+phenotype+by+the+nuclear+body+protein+ZC3H8%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Regulation of the oncogenic phenotype by the nuclear body protein ZC3H8.</a> BMC Cancer. 18 (1), 759(2018).</li>
<li>Neophytou, C., Boutsikos, P., Papageorgis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+and+Emerging+Therapeutic+Targets+of+Triple-Negative+Breast+Cancer+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms and Emerging Therapeutic Targets of Triple-Negative Breast Cancer Metastasis.</a> Frontiers in Oncology. 8, 31(2018).</li>
<li>Al-Alwan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fascin+is+a+key+regulator+of+breast+cancer+invasion+that+acts+via+the+modification+of+metastasis-associated+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Fascin is a key regulator of breast cancer invasion that acts via the modification of metastasis-associated molecules.</a> PloS One. 6 (11), e27339(2011).</li>
<li>Wang, M. J., Zhang, H., Li, J., Zhao, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA-98+inhibits+the+proliferation%2C+invasion%2C+migration+and+promotes+apoptosis+of+breast+cancer+cells+by+binding+to+HMGA2%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">microRNA-98 inhibits the proliferation, invasion, migration and promotes apoptosis of breast cancer cells by binding to HMGA2.</a> Bioscience Reports. 38 (5), pii: BSR20180571 (2018).</li>
<li>Zheng, Y. F., Luo, J., Gan, G. L., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+microRNA-98+inhibits+cell+proliferation+and+promotes+cell+apoptosis+via+claudin-1+in+human+colorectal+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Overexpression of microRNA-98 inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis via claudin-1 in human colorectal carcinoma.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 6090-6105 (2019).</li>
<li>Yan, W., Cao, Q. J., Arenas, R. B., Bentley, B., Shao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA3+inhibits+breast+cancer+metastasis+through+the+reversal+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">GATA3 inhibits breast cancer metastasis through the reversal of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 14042-14051 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O ensaio de invasão in vitro é um método barato, rápido, quantitativo e direto para estudar os fatores que promovem a invasão de células cancerosas. O câncer de mama é o câncer mais comumente diagnosticado entre as mulheres. Dos três principais subtipos de câncer de mama, triplo negativo, (ou ER-, PR-, HER2/Neu-), é o mais agressivo, mais provável de metástase, e mais mortal9. Portanto, compreender os genes e a expressão que resultam em metástases pode ajudar a encontrar novos alvos terap...

O ensaio in vitro da invasão pode ser uma ferramenta útil ao medir a habilidade de uma pilha de migrar através de uma membrana proteína-revestida, análoga aos primeiros passos na metástase. Uma característica chave de células cancerosas malignas é a sua capacidade de migrar através e invadir tecidos próximos. O cancro que se espalhou ou metástase levanta mais desafios do tratamento e tem umas mais baixas taxas de sobrevivência a longo prazo, quando os tumores localizados forem mais fáceis de tratar e tiverem umas taxas mais elevadas da sobrevivência a longo prazo. Para metástase, as células cancerosas devem deixar o tumor primário e migrar para o sistema circulatório ou linfático, um processo que requer a passagem através da matriz extracelular e da membrana basal1. No processo chamado a transição mesenquimais epithelial (EMT), as pilhas do tumor devem quebrar contatos da pilha-pilha, migrar direccionalmente, e invadir vasos próximos do sangue ou da linfa. As etapas iniciais desta cascata da metástase são do grande interesse desde que estas etapas são o que pode fazer o cancro deadlier. Os fatores genéticos e epigenéticos envolvidos nos primeiros passos da metástase são o foco de uma grande quantidade de pesquisa, mas são necessárias ferramentas experimentais precisas e confiáveis para testar esses primeiros passos tanto in vivo como in vitro.
As ferramentas para medir as alterações na migração celular, como ensaios de cicatrização de feridas (Scratch) ou crescimento em ambientes 3D, como ensaios de agar suave, podem abordar parcialmente a necessidade de métodos experimentais de medir os primeiros passos de metástase, mas um ensaio para medir a invasão é mais desafiador desde que o processo ocorre no corpo dentro de um microambiente complexo do tumor. Para fins de triagem de drogas ou alterações genéticas para determinar fatores importantes na invasão e metástase, um sistema que pode ser usado in vitro com células cultivadas e imitar os desafios enfrentados pelas células metastáticas in vivo é o ensaio de invasão2, a 3. O câncer de mama é o tipo de câncer mais comumente diagnosticado em mulheres e a segunda causa principal de morte por câncer em mulheres, portanto, a compreensão dos genes responsáveis pela invasão de células de câncer de mama e metástase é extremamente importante para a saúde pública. Além disso, as células do rato são um sistema de modelo útil para estudar o cancro da mama e sua progressão.
O ensaio in vitro da invasão é baseado no conjunto da câmara de Boyden onde duas câmaras de meios do crescimento são separadas por uma membrana porosa3. Para imitar o microambiente do tumor, um gel proteína-rico é incluído igualmente para separar pilhas em uma câmara de um chemoattractant no outro e actuar como uma barreira da membrana do porão. A fim migrar para o chemoattractant, as pilhas devem primeiramente passar através da barreira proteína-rica a seguir passam através da membrana porosa-um processo análogo a como as pilhas metastáticas migram através do estroma. O gel rico em proteínas pode ser alterado com base nas necessidades do experimento, mas geralmente consiste em colágeno, ou extrato de membrana basal (por exemplo, Matrigel)4. É uma mistura complexa de proteínas, proteoglicanos e fatores de crescimento, mas consiste principalmente de lamininas e colágeno IV 4,5. As pilhas devem então passar através de uma membrana porosa feita tipicamente do policarbonato, do poliéster, ou do politetrafluoretileno (PTFE). As membranas podem ser compradas comercialmente com ou sem um gel da proteína (tipicamente collagens), ou o gel pode ser comprado separada e adicionado. O tamanho do poro pode ser ajustado com base no tamanho da célula. Quando os tamanhos do pore estiverem disponíveis de 0,4-8,0 μm, somente os poros de 3,0-8,0 μm são grandes bastante para a migração da pilha. O ensaio de invasão tem sido usado para determinar a eficácia dos inibidores sobre a capacidade das células de migrar e invadir. Ao faltar o microambiente exato do tumor que está atual in vivo, o ensaio in vitro da invasão é benéfico em selecionar muitas circunstâncias em um curto período de tempo ao minimizar a necessidade para modelos animais. O objetivo desses experimentos é comparar a expressão gênica de suspeita de oncogenes e determinar os efeitos sobre o comportamento das células cancerosas e a agressividade da doença usando o ensaio de invasão in vitro e outros testes. Globalmente, o ensaio de invasão fornece resultados consistentes, quantitativos e rápidos para determinar o potencial metastático, sendo também um método relativamente barato, direto e adaptável.

<table><tbody><tr><td>Placas de 24 poços</td><td>Corning</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>camundongos</td><td></td><td></td><td></td>BALB/c</tr><tr><td>Incubadora</td><td></td><td></td><td></td>de Cultura</tr> de <tr><td>Células Frascos</td><td></td><td></td><td></td>Tratados com Cultura</tr><tr><td>de Células Cenrífugo</td><td></td><td></td><td></td>clínico</tr><tr><td>Cotonete de algodão</td><td>Puritano</td><td>25-806</td><td></td></tr><tr><td>Cristal Violeta</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr>Água <td></td><td></td><td></td><td>destilada</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>10566-016</td><td>glicose alta, GlutaMAX</td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>FBS Sigma Aldrich</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Forcepts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de Vidro</td><td>VWR</td><td>16004-422</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher</td><td>14025076</td><td>sem cálcio, sem magnésio</td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmaras de Invasão de Óleo</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>Imersão (24 poços)</td><td>Corning</td><td>354480</td><td>Cat. #354481 para</td></tr><tr><td>microscópio</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de luz de 6 poçosBisturi do PBS de Sigma Aldrich P6148 PBS do reagente da transfecção da lipofectamina do reagente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr>, <tr><td>pipeta</td><td></td><td></td><td></td>estéril</tr><tr><td>disposable</td><td></td><td></td><td>#11</td></tr><tr><td>shRNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> Trypsin-EDTA ThermoFisher 25200056 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

o uso de células tumorais do rato mamário em um ensaio de invasão in vitro como medida de comportamento de células oncogênicas

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

O ensaio in vitro da invasão usa uma matriz proteína-rica em uma câmara de Boyden para medir a habilidade de pilhas cultivadas passar através da matriz e de uma membrana porosa em um processo análogo às etapas iniciais da metástase da pilha de cancro. As células testadas podem ser alteradas para a expressão gênica ou tratadas com inibidores para testar alterações no potencial de invasão. Esta experimentação testa o phenotype agressivo das pilhas mamária do tumor do rato para descobrir e caracterizar os oncogenes potenciais que promovem a invasão da pilha. Esta técnica, no entanto, pode ser versátil e adaptada a muitas aplicações diferentes. O experimento em si pode ser feito em um dia e os resultados são adquiridos por microscopia de luz em menos de um dia. Os resultados incluem contagens do número de células invasoras para comparação e análise. O ensaio de invasão in vitro é um método rápido, barato e de corte claro para determinar o comportamento celular em uma cultura que pode ser usada como uma avaliação inicial antes de mais envolvidos em ensaios in vivo.

Este método de invasão in vitro através de uma matriz proteica foi utilizado para avaliar os fenótipos agressivos e os comportamentos celulares oncogênicos de células tumorais do camundongo com expressão alterada da proteína do dedo de zinco ZC3H8,8. Em conjunto com outras abordagens que também examinam a migração celular e o crescimento em ambientes 3D, verificou-se que níveis mais elevados de expressão de Zc3h8 em linhagens celulares tumorais, ou por expressão me...

O ensaio de invasão celular in vitro é utilizado para medir o potencial de metástase oncológica, quantificando o potencial celular para invasão e migração usando inserções de cultura celular contendo matriz proteica. As células são desafiadas a migrar através da matriz proteica e uma membrana porosa, em direção a um quimioatractivo, e depois quantificada por microscopia de luz.

O uso de células tumorais do rato mamário em um ensaio de invasão in vitro como medida de comportamento de células oncogênicas

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

Este protocolo, o ensaio de invasão in vitro, é uma ferramenta útil para medir quantitativamente uma capacidade de migração de linhas de células através de uma matriz rica em proteínas e passar por uma membrana porosa, em um processo semelhante aos estágios iniciais da invasão celular cancerosa. Essas linhas celulares podem ser geneticamente alteradas a fim de expressar um gene ou ter a expressão reduzida de um gene, a fim de determinar se esse gene desempenha um papel na migração celular ou invasão celular. Muitos cânceres agressivos envolvem mudanças drásticas no comportamento celular, incluindo aumento da migração e invasão.Assim, este ensaio de invasão in vitro pode nos permitir entender melhor os genes e outros fatores envolvidos nesse processo. Para iniciar este procedimento, cresça células tumorais mamárias de camundongos aderentes em um frasco T25 a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 100% de umidade até que sejam 70% a 90% confluentes para o primeiro dia do experimento. Recupere as pastilhas da câmara de Boyden do armazenamento e transfira-as para um capô de cultura celular para aquecer à temperatura ambiente por 20 minutos.Use três inserções para gerar dados e

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Uma visão abrangente das técnicas envolvidas na geração de um modelo do rato de câncer oral e monitorização quantitativa de invasão tumoral dentro da língua por meio de microscopia multi-fotão de células marcadas é apresentado. Este sistema pode servir como uma plataforma útil para a avaliação molecular e eficácia de drogas anti-invasivos compostos.

Multi-fotão imagem de invasão das células tumorais em um modelo de camundongo ortotópico de carcinoma epidermóide oral

Um ensaio para medir quantitativamente Transforming Growth Factor (TGF)-β induzida por invasão em gel 3-dimensional colágeno é descrito. Este ensaio se aproveita da série MCF10A de linhas de células, que representam diferentes fases de desenvolvimento de câncer de mama. Este método pode ser adotado para ser usado com outras linhagens de células e pode ser usado para investigar outras possíveis ativadores ou inibidores de invasão.

Ensaio esferóide para TGF-β Medida induzida Invasion

Ativação de mutações latentes com adenovírus-Cre no sistema ductal resultados mamárias em um câncer de mama metastático clinicamente relevante. Incorporação de um promotor YFP permite o rastreamento de células tumorais metastáticas distais. Este modelo é útil para estudar metástase latente, a imunidade anti-tumor, e para a concepção de novas imunoterapias para tratar o câncer de mama.

Início do Carcinoma de mama metastático por Segmentação do ductal Epithelium com Adenovírus-Cre: Um Modelo Novel de camundongo transgênico do Câncer de Mama

Este artigo proporciona metodologias detalhadas para a utilização de ensaios tridimensionais (3D), para quantificar a invasão das células do cancro da mama. Especificamente, vamos discutir os procedimentos necessários para a criação de tais ensaios, quantificação e análise de dados, bem como métodos para analisar a perda da integridade da membrana que ocorre quando as células invadem.

Quantificação de cancro da mama invasiva das células usando um modelo (3D) tridimensional

O cancro é uma doença complexa que é influenciada pelo tecido circundante do tumor, bem como pro- local e anti-inflamatórias mediadores. Portanto, os modelos de injeção ortotrópicas, ao invés de modelos subcutâneos pode ser útil para estudar a progressão do câncer de uma forma que melhor mimetiza patologia humana.

Injeção Orthotopic de células cancerosas da mama na mamária Fat Pad de Ratos para o Estudo de crescimento tumoral.

Um módulo de laboratório viável para alunos de graduação em biologia que explora conceitos celulares e moleculares avançados usando cultura de células animais é descrito. Os alunos crescem, caracterizam e manipulam um modelo de célula de câncer de mama por exposição a agentes quimioterápicos. A viabilidade celular é testada por meio da contagem de células usando um método padrão e novo.

Usando o rato do mamárias Células Tumorais para ensinar Biologia Conceitos Básicos: A Módulo Lab Simples

Um modelo de tumor primário do cancro da mama ortotópico e remoção cirúrgica do tumor primário para prolongar a vida do rato para gerar metástase espontânea são descritos. O crescimento do tumor e progressão são monitorados e quantificado por imagens de fluorescência da luciferase.

Um modelo de camundongo ortotópico de câncer de mama espontânea metástase

Aqui, apresentamos um protocolo para implante de células de câncer de mama para a almofada de gordura mamária de forma simples, menos invasiva e fácil de manusear de maneira, e este modelo de câncer de mama ortotópico rato com um ambiente adequado do tecido mamário pode ser usado para investigar vários aspectos da câncer.

Ortotópico injeção de células de câncer de mama para a almofada de gordura mamária de ratos

Este protocolo fornece ferramentas in vitro experimentais para avaliar a transformação das células mamárias humanas. São descritas etapas detalhadas para a taxa de proliferação celular de acompanhamento, capacidade de crescimento independente de ancoragem e distribuição de linhagens celulares em culturas 3D com matriz de membrana de porão.

Avaliação In Vitro da Transformação Oncogênica em Células Epiteliais Mamárias Humanas

Este protocolo descreve métodos para cultivar, manipular e analisar CAFs murinos, incluindo ensaios funcionais in vitro / in vivo , transcriptômica e análise computacional. Além disso, descreve uma plataforma baseada na web desenvolvida para analisar os transcriptomas publicamente disponíveis de componentes estromais e epiteliais microdissecados por captura a laser de uma coleção de tumores de câncer de mama humano.

Fibroblastos Associados ao Câncer de Tumores Mamários de Camundongos como Ferramentas para Estudos Moleculares e Computacionais

Aprenda a realizar ensaios de invasão in vitro com células tumorais mamárias de rato para estudar migração celular e metástase do câncer. Este método permite quantificar a capacidade invasiva e identificar genes relacionados à progressão tumoral.

O uso de células tumorais do rato mamário em um ensaio de invasão in vitro como medida de comportamento de células oncogênicas

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