Técnicas de microinjeção de embriões para mutagênese específica do local eficiente em Culex quinquefasciatus

As técnicas de microinjeção de embriões abriram caminho para o desenvolvimento de inúmeras ferramentas de controle de vetores de base genética. Embora numerosas espécies de insetos tenham protocolos já bem desenvolvidos, Culex quinquefasciatus permanece relativamente pouco estudado. Este protocolo de microinjeção foi projetado especificamente para acomodar as características biológicas únicas de Culex quinquefasciatus, incluindo coleta de ovos, separação de jangadas de ovos e procedimentos pós-injeção.

Este método provavelmente pode ser adaptado a qualquer espécie de Culex de interesse e pode ser usado para estudar a função do gene ou para gerar tecnologias de controle baseadas em genética para espécies de Culex. Comece separando os ovos das jangadas. Use uma pinça ou um pincel para pressionar a jangada e separar os ovos individuais.

Alinhe os ovos em uma tira fina de fita adesiva dupla face colocada na parte superior de uma lâmina de vidro, fazendo um esforço para apontar o lado anterior de cada ovo na mesma direção. Prepare a mistura de halocarbono misturando suavemente os reagentes de halocarbono com água e incubando a mistura a 25 graus Celsius durante a noite. Cubra os ovos alinhados com a mistura de óleo halocarbônico.

Para gerar agulhas para as microinjeções, coloque um vidro capilar de aluminossilicato em um extrator de agulhas, seguindo as instruções do fabricante. Defina o calor para 560, a velocidade para 100, o atraso para 70, a tração para 97 e a pressão para 500. Em seguida, ative o extrator de agulhas.

Toque suavemente a ponta da agulha puxada na placa abrasiva diamantada rotativa por cerca de 10 segundos em um ângulo de 50 graus para chanfrar a ponta da agulha. Incorpore agulhas puxadas e chanfradas em linhas de argila de modeladores em uma placa de Petri. Preparar a mistura de injecção constituída por reagentes de modificação do genoma e conservá-la no gelo.

Use uma ponta de microcarregador para carregar dois microlitros de mistura de injeção na agulha de injeção. Coloque a agulha de injeção cheia em um micromanipulador ligado a um microinjetor eletrônico e coloque a lâmina de vidro com os ovos alinhados no palco de um microscópio composto. Usando o micromanipulador, alinhe a agulha para mirar na extremidade posterior do embrião em um ângulo de 25 a 35 graus.

Insira cuidadosamente a agulha no embrião e injete a mistura em uma quantidade de cerca de 10% do volume do embrião. Injete 20 óvulos de cada vez, depois pare e execute os procedimentos de recuperação do embrião. Dentro de 20 minutos após a injeção, remova cuidadosamente o óleo de halocarbono dos ovos, escovando-os levemente com um pincel limpo.

Levante os ovos com o pincel e coloque-os em um copo de água bidestilada Nos próximos sete dias, verifique os ovos diariamente quanto à eclosão e siga os procedimentos normais de criação de larvas. Rastreie os mosquitos injetados para os fenótipos mutantes usando um estereoscópio.

Este método tem sido usado para gerar com sucesso mutações somáticas e germinativas de um gene crítico para o desenvolvimento da pigmentação do olho escuro. As mutações somáticas geradas por CRISPR-Cas9 foram pontuadas pela triagem de perda de pigmentação nos olhos do estágio pupilar de indivíduos injetados. As mutações somáticas estavam geralmente presentes como fenótipos em mosaico, onde algumas, mas não todas, as células têm o fenótipo mutante.

As taxas de mutação da linha germinativa foram determinadas pelo cruzamento de indivíduos G zero em mosaico e pontuação por prole de olhos completamente brancos. Esses experimentos resultaram em uma taxa de sobrevivência embrionária de 64 a 82%, uma taxa de mutagênese somática de 37 a 57% e uma taxa de mutagênese germinativa superior a 61%. Ao multiplexar sgRNAs para atingir vários loci no mesmo gene, as taxas de mutagênese somática e germinativa aumentaram para até 86% Além disso, por muitas gerações, estoques homozigotos viáveis dos mutantes brancos foram mantidos com sucesso no laboratório.

Para otimizar as taxas de sobrevivência e mutagênese, todos os materiais, incluindo óleo de halocarbono, fluido de injeção e agulhas, devem ser preparados adequadamente antes de tentar microinjeções. Isso permitirá um processo de microinjeção mais simplificado e focado.