Name: Criação e Double-stranded mediada por RNA silenciamento de genes na Esconder Beetle, Dermestes maculatus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Aprenda a criar colônias de Dermestes maculatus e aplicar RNAi embrionário e parental para estudar função gênica em besouros. Este método permite análises em biologia do desenvolvimento e evolução.

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Agradecemos aos Drs. Alison Heffer e Yong Lu por configurar o aparelho de microinjeção e compartilhar seu inestimável conhecimento e experiência com o RNAi do inseto. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01GM113230 a L.P.).

Os autores não têm nada a divulgar.

Enquanto um pequeno número de sistemas de modelos sofisticados (ratos, moscas, vermes) foram desenvolvidos durante o século 20, o século 21 tem visto uma onda de novos sistemas animais sendo desenvolvidos em laboratórios de todo o mundo. Estes novos sistemas permitem aos cientistas para abordar questões comparativas, evolutivos que não podem ser sondados utilizando apenas os sistemas de modelo &#39;padrão&#39;. Essa implantação de novos modelos requer o rápido desenvolvimento de métodos para a cult...

Em 1998, Fire and Mello relatado que o RNA de cadeia dupla (ARNcd) pode induzir a inibição da função do gene em Caenorhabditis elegans 1. Esta resposta desencadeada por ARNdc foi denominado ARN de interferência (RNAi), e tal silenciamento de genes mediada por ARNi foi relatado para ser conservado em animais, plantas, fungos e 2-7. Em alguns animais e plantas, as funções de ARNi sistemicamente, o que significa que o efeito pode espalhar a outras células / tecidos onde ARNcd não é introduzida directamente (revisto em 8-10). Os cientistas fizeram uso desta resposta RNAi celular endógeno através da concepção de dsRNAs para alvejar genes de interesse, batendo assim, reduzir a função do gene, sem manipular diretamente o genoma (revisto em 11-14). RNAi é uma poderosa ferramenta para estudos funcionais devido às seguintes vantagens. Em primeiro lugar, mesmo com informação da sequência do gene mínimo, um gene pode ser alvejado usando RNAi. Isto é especialmente importante para rudies de organismos não-modelo que faltam dados genômicos ou transcriptomic. Em segundo lugar, em organismos em que a resposta é robustamente ARNi sistémica, RNAi mediada por silenciamento de genes pode ser realizado em praticamente qualquer estágio de desenvolvimento. Este recurso é muito útil para estudar a função de genes pleiotrópicos. Em terceiro lugar, em alguns casos, os efeitos de ARNi para espalhar as gónadas e descendência, tais fenótipos que são observadas em prole 15,16. Este fenómeno, conhecido como parental RNAi (pRNAi), é especialmente vantajoso para os genes que afetam o desenvolvimento embrionário, tão numerosos descendentes produzidos por um único pai injetada podem ser examinados sem manipulação direta de ovos. Por estas razões, pRNAi é o método de escolha. No entanto, se pRNAi é ineficaz, por exemplo, para os genes necessários para a oogénese, então embrionário RNAi (eRNAi) deve ser usado. Em quarto lugar, o RNAi pode ser utilizado para gerar o equivalente a uma série de alelos em que a quantidade de ARNcd entregues pode ser variada ao longo de uma gama para produzir fraco para defeitos fortes. Tal gradação de fenótipos podem ser úteis para a compreensão da função do gene quando o gene está envolvido num processo complexo e / ou perda completa da função é letal. Em quinto lugar, a entrega de dsRNA é geralmente fácil e viável, especialmente em animais que mostram robustos respostas RNAi sistémicos. dsRNA pode ser introduzido por microinjeção 1,5, alimentação / ingestão 17,18, imersão, 19,20 e vírus / entrega de bactérias mediadas 21,22. Em sexto lugar, ao contrário de alguns genes métodos de segmentação / edição, não há necessidade para triagem de organismos portadores da mutação ou para realizar cruzamentos genéticos para gerar homozigotos ao usar RNAi. Portanto, em comparação com muitas outras técnicas para o estudo da função dos genes, RNAi é rápido, barato, e pode ser aplicado para telas de grande escala 23-25. A ampla utilidade de RNAi fornece meios para realizar estudos funcionais em uma ampla gama de organismos, ampliando a gama de espécies disponíveis para estudo beyond os sistemas de modelos tradicionais para as quais foram desenvolvidas ferramentas genéticas. Por exemplo, estudos usando sistemas não-modelo são obrigados a dar insights sobre a evolução de genes e redes de genes, comparando as funções de ortólogos de espécies que representem os diferentes modos de desenvolvimento ou exibindo características morfológicas distintas 26-29. Estes tipos de estudos irá proporcionar uma melhor compreensão da diversidade biológica, com impactos para a pesquisa aplicada e básica. Sendo o maior grupo de animais no planeta, insetos fornecem uma grande oportunidade para explorar os mecanismos diversidade subjacente. Além disso, os insetos são geralmente pequenos, têm ciclos de vida curtos, alta fecundidade, e são fáceis de criar em laboratório. Nas últimas duas décadas, RNAi tem sido aplicado com sucesso em insetos abrangendo encomendas, incluindo Diptera (moscas verdadeiras) 5, Lepidoptera (borboletas e mariposas) 30, Coleoptera (besouros) 16,31, Hymenoptera (Sawfmentiras, vespas, formigas e abelhas) 32, Hemiptera (percevejos), Isoptera (cupins) 34, Blattodea (baratas) 35, Orthoptera (grilos, gafanhotos, gafanhotos e gafanhotos) 36 e Phthiraptera (piolhos) 37. Aplicação bem sucedida de RNAi forneceu dados funcionais para estudos de padronização na embriogênese precoce (eixo ântero-posterior 32, eixo dorso-ventral 28, segmentação 26,38), a determinação do sexo 39,40, quitina / cutícula biossíntese 41, ecdisona sinalização 42, comportamento social 43, e muito mais. ARNi métodos desenvolvidos para diferentes espécies de insectos pode ser um benefício adicional na medida em que eles são susceptíveis de serem úteis para o controlo de pragas (revisto em 44-46). efeitos de RNAi será tão bem como específicas de espécies específicas de gene, enquanto regiões não conservados são escolhidos para segmentação. Para as espécies de insetos benéficos como abelhas e bichos da seda, tendo como alvo genes vitais para a sobrevivência devírus ou parasitas para controlar a infecção pode proporcionar uma nova estratégia para proteger estas espécies 47,48. Dermestes maculatus (D. maculatus), nome comum hide besouro, é distribuído em todo o mundo, exceto na Antártida. Como um inseto holometabolous, o ciclo de vida D. maculatus inclui embrionário, larval, pupal e estágios adultos (Figura 1). Porque se alimenta de carne, D. maculatus é usado em museus para esqueletizar animais mortos e entomologistas forenses podem usá-lo para estimar o tempo de morte 49,50. D. maculatus alimenta de produtos de origem animal, incluindo carcaças, carne seca, queijo e as pupas / casulos de outros insetos e, assim, provoca danos às famílias, alimentos armazenados, e a seda, queijo e indústrias de carne 51,52. Aplicando RNAi neste besouro poderia fornecer uma maneira eficiente e ambientalmente amigável para minimizar o seu impacto económico. Nosso laboratório tem usado D. maculatus como um novo modelo inseto para estudar segmentação 53. Além de ser passível de criação do laboratório, D. maculatus é de interesse para a investigação fundamental, pois é um desenvolvedor intermediário de germes, tornando-se uma espécie úteis para estudar a transição entre o curto eo desenvolvimento a longo germe. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig1.jpg"> Figura 1: Ciclo de Vida de D. maculatus. Fotografias de D. maculatus em diferentes fases da vida, como indicado. O ciclo de vida de ovo a adulto demora três semanas a 30 ° C, mas mais tempo em temperaturas mais baixas. (A, F) de embriões recentemente estabelecidas são de cor branca a amarelo claro e oval, aproximadamente 1,5 mm de comprimento. Embriogênese leva ~ 55 h a 30 ° C. (B, C e G) As larvas têm listras escuras pigmentados e são cobertas com cerdas. As larvas passam por vários estádios, dependendo do ambiente e seu comprimento pode estender-se a mais de 1 cm. (D, H) (E, I) Logo após a eclosão, pigmentação escura aparece sobre o corpo adulto besouro. Os adultos podem viver até vários meses e uma fêmea pode colocar centenas de embriões sobre sua vida. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54976/54976fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Anteriormente, mostramos que a RNAi é eficaz para derrubar a função do gene em D. maculatus 53. Aqui a nossa experiência criação de colônias de D. maculatus em laboratório é compartilhada junto com o passo-a-passo protocolos para ambos embrionário e parental RNAi set-up, injeção, cuidados pós-injeção, e análise fenotípica. O knockdown e métodos de análise de genes dsRNA mediadas introduzidas aqui não só fornecer informações detalhadas para abordar questões em D. maculatus, mas também têm potencial relevância for aplicação de RNAi em outros não-modelo besouro / espécies de insetos.

<table><tbody><tr><td>Dermestes maculatus besouros vivos</td><td>Nosso laboratório ou Carolina Biological Supply</td><td>#144168</td><td>Nossa cepa de laboratório foi verificada por código de barras COI; a variação da cepa da Carolina não pode ser descartada</td></tr><tr><td>Comida de gato úmida</td><td>Fancy Feast</td><td></td><td>Pedaços de carne com molho. Pode comprar na maioria dos alimentos para animais de estimação e mercearias</td></tr><tr><td>Ração seca para cães</td><td>Purina Puppy Chow</td><td></td><td>Pode comprar na maioria dos alimentos para animais de estimação e mercearias</td></tr><tr><td>Gaiola de insetos (tamanho médio, 30,5 x 19 x 20,3 cm)</td> <td>Exo Terra</td><td>PT2260</td><td>Para manutenção de colônias. Pode usar gaiola maior, se necessário</td></tr><tr><td>Gaiola de insetos (tamanho mini, 17,8 x 10,2 x 12,7 cm)</td><td>Exo Terra</td><td>PT2250</td><td>Para coleta de embriões</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>VWR</td><td>89038-968</td><td></td></tr><tr><td>Bola de algodão</td><td>Fisher</td><td>22-456-883</td><td></td></tr><tr><td>Megascript T7 kit de transcrição</td><td>Fisher</td><td>AM1334</td><td>Para 40 reações</td></tr><tr><td>Bomba pneumática</td><td>WPI</td><td>PV830</td><td></td></tr><tr><td>Suporte capilar</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>NARISHIGE</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro preto (90&nbsp; mm)</td><td>VWR</td><td>28342-010</td><td></td></tr><tr><td>Corante alimentar (verde)</td><td>McCormick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capilar de vidro borossilicato</td><td>Hilgenberg</td><td>1406119</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de agulhas (extrator de micropipetas)</td><td>Sutter Instrument Co.</td>Lâmina de vidro para microscópio <td>P-97</td><td></td></tr><tr><td></td><td>WorldWide Life Sciences Division</td><td>41351157</td><td></td></tr><tr><td>Sealing film (Parafilm M)</td><td>Seringa Fisher</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Modelo 801 (10&nbsp; &micro; l)</td> <td>Agulha Hamilton</td><td>7642-01</td><td></td></tr><tr><td>(calibre 32)&nbsp;</td><td>Solução de fixação Hamilton</td><td>7762-05</td><td></td></tr><tr><td>(Pampel's)</td><td>BioQuip Products, Inc.</td><td>1184C</td><td>Tóxico, precisa ser manuseado em fórceps de capela</td></tr><tr><td>de exaustão (DUMONT #5)</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Lamínula (24 x 50 mm, nº 1.5)</td>Ponta de pipeta Globe <td>Scientific</td><td>1415-15</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotips Microcarregador Microscopia</td><td></td><td></td> de dissecação Fisher E5242956003 <td></td></tr><tr><td>para injeção de embriões</td><td>Leica</td><td>M420</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia de dissecação para visualização fenotípica larval</td><td>Zeiss</td><td>SteREO Discover. V12</td><td></td></tr><tr><td>DIC microscopia</td><td>Zeiss</td><td>AXIO Imager. M1</td><td></td></tr></tbody></table>

criação e double-stranded mediada por rna silenciamento de genes na esconder beetle, dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Os avanços na genômica levantaram a possibilidade de sondar a biodiversidade em uma escala sem precedentes. No entanto, a sequência por si só não será informativa sem ferramentas para estudar a função do gene. O desenvolvimento e compartilhamento de protocolos detalhados para o estabelecimento de novos sistemas modelo em laboratórios e para ferramentas para realizar estudos funcionais é, portanto, crucial para alavancar o poder da genômica. Os coleópteros (besouros) são o maior clado de insetos e ocupam praticamente todos os tipos de habitats do planeta. Além de fornecer modelos ideais para pesquisa fundamental, os estudos de besouros podem ter impactos no controle de pragas, pois muitas vezes são pragas de residências, agricultura e indústrias alimentícias. Protocolos detalhados para criação e manutenção de colônias de laboratório de D. maculatus e para a realização de interferência mediada por dsRNA em D. maculatus são apresentados. Os procedimentos de RNAi embrionário e parental - incluindo configuração do aparelho, preparação, injeção e recuperação pós-injeção - são descritos. Também são apresentados métodos para análise de fenótipos embrionários, incluindo viabilidade, defeitos de padronização em larvas eclodidas e preparações de cutícula para larvas não eclodidas. Esses ensaios, juntamente com a hibridização in situ e a imunocoloração para marcadores moleculares, tornam D. maculatus um sistema modelo acessível para pesquisa básica e aplicada. Eles também fornecem informações úteis para estabelecer procedimentos em outros sistemas de modelos de insetos emergentes.

Laboratório dos autores tem utilizado tecnologia de RNAi para estudar a evolução funcional dos genes que regulam a segmentação em insetos 53,55. Enquanto todos os insetos são segmentadas, os genes que regulam este processo parecem ter divergido durante radiações insetos 26,38,56-63. Telas genéticos em Drosophila identificou um conjunto de nove genes de segmentação par de regras que são responsáveis por promover a formação de segmentos corporais 64-70.<...

Aqui, apresentamos os protocolos de criação de um besouro intermediário de germes, Dermestes maculatus (D. maculatus) no laboratório. Também compartilhamos protocolos de RNAi embrionário e parental e métodos para análise de fenótipos embrionárias para estudar a função de genes nesta espécie.

Criação e Double-stranded mediada por RNA silenciamento de genes na Esconder Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

O objetivo geral deste procedimento é explorar a função do gene em Dermestes maculatus, um novo sistema modelo de insetos, que representa o clado diversificado de besouros e facilita o estudo de questões de pesquisa básica e aplicada. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da biologia do desenvolvimento, biologia evolutiva e além, tornando possível testar a função gênica em embriões e adultos Dermestes. A principal vantagem dessa técnica é que a interferência de RNA pode ser usada para atingir qualquer gene, com base apenas nas informações da sequência, mesmo na ausência de uma sequência completa do genoma.Os métodos apresentados aqui não apenas fornecem uma abordagem para estudar a função do gene em Dermestes. Eles também podem ser aplicados para desenvolver novos sistemas modelo de insetos e, potencialmente, para controlar pragas de insetos. Para preparar uma gaiola de criação para um D. maculatus, primeiro espalhe uma fina camada de aparas de madeira em uma gaiola de insetos de tamanho médio.Coloque uma seção de isopor na gaiola para permitir que as larvas tenham um ambiente para se transformarem em pupas. Adicione vinte a cinquenta besouros adultos ou l

rearing-double-stranded-rna-mediated-gene-knockdown-hide-beetle

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Neste protocolo combinamos RNAi mediada silenciamento de genes com...

RNAi mediada knockdown do gene e<em&gt; In Vivo</em&gt; Ensaio diurese no Feminino Adulto<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Os mosquitos

Neste protocolo, descrevemos duas estratégias que suprimem simultaneamente dois genes (gene knockdown double) em abelhas. Em seguida, apresentamos como usar a resposta de extensão probóscide (PER) ensaio para estudar o efeito do gene knockdown duplo em mel de abelha percepção gustativa.

RNAi mediado por Gene Knockdown duplo e Mensuração Percepção gustativa em abelhas do mel (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

Enquanto dsRNA alimentação em C. elegans é uma ferramenta poderosa para avaliar a função do gene, os protocolos atuais para telas de alimentação em grande escala resultar em eficiências knockdown variáveis. Descreve-se um protocolo melhorado para a realização em grande escala de RNAi telas de alimentação, que resulta em knockdown altamente eficaz e reprodutível de expressão do gene.

Em larga escala Knockdown Gene em<em&gt; C. elegans</em&gt; Usando bibliotecas de alimentação dsRNA para gerar fenótipos robustos perda de função

Interferência de RNA (RNAi) técnicas de genes baseados em knockdown estão no centro de pesquisa Tribolium. Aqui, nós fornecemos uma visão geral de nossa técnica de RNAi larval em Tribolium castaneum. Larval RNAi é uma técnica simples, mas poderosa que fornece acesso rápido a fenótipos de perda de função, permitindo que os pesquisadores para estudar as funções dos genes em diversos contextos.

A interferência RNA larval no Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

Aqui, descrevemos um processo para a inibição da função do gene em vectores mosquitos doença através do uso de quitosano / interferindo nanopartículas de RNA que são ingeridos pelas larvas.

A quitosana / RNA de interferência Nanoparticle Mediated silenciamento gênico na Doença Vector Mosquito Larvas

A interferência de RNA (RNAi) é uma ferramenta extremamente valiosa para descobrir a função do gene. No entanto, a capacidade de direcionar genes usando RNAi durante os estágios pré-adultos é limitada no principal vetor da malária humana, Anopheles gambiae. Descrevemos um protocolo de RNAi para reduzir a função do gene por meio de injeção direta durante o desenvolvimento da pupa.

RNAi gatilho para o interior<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; As pupas

Aqui nós apresentamos um protocolo para injetar ovos do grilo, uma técnica que sirva como um método fundamental em muitas experiências no grilo, incluindo, mas não limitado a, a interferência do RNA e a manipulação genomic.

Injetando ovos de Gryllus bimaculatus

A interferência de RNA é uma técnica amplamente aplicável e poderosa para manipular a expressão genética em estágios específicos de desenvolvimento. Aqui, descrevemos os passos necessários para a implementação dessa técnica no besouro de mergulho aquático Thermonectus marmoratus, desde a aquisição de sequências genéticas até o knockdown de genes que afetam a estrutura ou o comportamento.

Interferência de RNA em besouros aquáticos como uma poderosa ferramenta para manipular a expressão genética em pontos de tempo específicos de desenvolvimento

Fornecemos um protocolo detalhado para a interferência mediada por eletroporação no RNA em insetos da ordem Odonata (libélulas e damselflies) usando a damselfly de cauda azul(Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) e a libélula de skimmer pied(Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera).

Método de interferência de RNA mediado por eletroporação em Odonata

Apresentado aqui está um protocolo de microinjeção de embrião Helicoverpa armigera (Hübner) e identificação mutante nocaute criada pela edição do genoma CRISPR/Cas9. Insetos mutantes permitem mais pesquisas sobre a função genética e a interação entre diferentes genes in vivo.

Microinjeção de Embrião e Identificação Mutante Nocaute de NÍTIda/Cas9 Editado Genoma Helicoverpa Armigera (Hübner)

O presente protocolo descreve as diretrizes passo a passo para as técnicas de operação rnai em P. americana.

Aplicações de interferência de RNA na barata americana

Aprenda a criar colônias de Dermestes maculatus e aplicar RNAi embrionário e parental para estudar função gênica em besouros. Este método permite análises em biologia do desenvolvimento e evolução.

Criação e Double-stranded mediada por RNA silenciamento de genes na Esconder Beetle, Dermestes maculatus

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