Criação e Double-stranded mediada por RNA silenciamento de genes na Esconder Beetle, Dermestes maculatus

O objetivo geral deste procedimento é explorar a função do gene em Dermestes maculatus, um novo sistema modelo de insetos, que representa o clado diversificado de besouros e facilita o estudo de questões de pesquisa básica e aplicada. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da biologia do desenvolvimento, biologia evolutiva e além, tornando possível testar a função gênica em embriões e adultos Dermestes. A principal vantagem dessa técnica é que a interferência de RNA pode ser usada para atingir qualquer gene, com base apenas nas informações da sequência, mesmo na ausência de uma sequência completa do genoma.

Os métodos apresentados aqui não apenas fornecem uma abordagem para estudar a função do gene em Dermestes. Eles também podem ser aplicados para desenvolver novos sistemas modelo de insetos e, potencialmente, para controlar pragas de insetos. Para preparar uma gaiola de criação para um D. maculatus, primeiro espalhe uma fina camada de aparas de madeira em uma gaiola de insetos de tamanho médio.

Coloque uma seção de isopor na gaiola para permitir que as larvas tenham um ambiente para se transformarem em pupas. Adicione vinte a cinquenta besouros adultos ou larvas de ínstar tardio à gaiola. Coloque a comida de gato úmida em uma placa de Petri ou barco de pesagem, como fonte de alimento.

Cubra a gaiola com um pano de malha e coloque-a em uma incubadora. Antes de iniciar a coleta de embriões, primeiro verifique cuidadosamente a gaiola quanto a embriões presentes e remova-os. Assim que a gaiola estiver limpa, coloque uma bola de algodão esticada na gaiola e incube a colônia a 30 graus Celsius.

Após a janela de tempo apropriada, colete a bola de algodão e remova todos os adultos presentes e coloque-os de volta na gaiola. Sobre um pedaço de cartolina preta, aperte a bola de algodão suavemente e rasgue-a lentamente em um filamento fino, de modo que os ovos presentes caiam no papel preto. Pegue uma tampa de placa de Petri padrão e use um pedaço de papel de filtro preto para cobrir o interior.

Cole um pedaço de fita dupla-face ao longo da borda de uma lâmina de microscópio padrão. Coloque a lâmina do microscópio no papel de filtro preto na tampa da placa de Petri. Pegando o papel contendo os embriões coletados, bata suavemente para transferir os embriões para a tampa da placa de Petri.

Usando um pincel, alinhe os embriões na fita perpendicular à lâmina, com a extremidade anterior ou posterior voltada para a borda. Para iniciar o RNAi, primeiro pegue 2-4 microlitros de dsRNA em uma ponta de pipeta microcarregadeira de 20 microlitros. Insira a ponta em um capilar de vidro pré-puxado, conhecido como agulha, e pipete suavemente a solução para dentro da agulha.

Fixe a agulha em um suporte capilar de vidro e, em seguida, monte o suporte capilar no micromanipulador. Em seguida, transfira cuidadosamente a lâmina com embriões fixados no estágio do microscópio de dissecação. Mova a lâmina para trazer um embrião para o centro do campo e focar o microscópio.

Enquanto olha para o escopo de dissecação, posicione a ponta do capilar com o micromanipulador. Aproxime a ponta do final do primeiro embrião da fileira. Ligue o nitrogênio ou o suprimento de ar e, em seguida, ajuste a chave seletora de entrada do solenóide para vácuo.

Ajuste o regulador de pressão de ejeção para 10-15 psi, dependendo do aparelho. Abra o capilar e a solução colorida de dsRNA preencherá a ponta, pronta para a injeção. Mova a ponta capilar para frente e perfure suavemente o embrião.

Sob configurações de pressão ideais, nenhum fluido embrionário fluirá para o capilar. Pise no pedal para ejetar o dsRNA no embrião, até que a quantidade apropriada seja dispensada. Deixe a ponta dentro do embrião por cerca de dois segundos e remova-a com cuidado.

Depois que todos os embriões forem injetados, coloque a lâmina em uma placa de Petri. Adicione uma bola de algodão molhada ao prato, tomando cuidado para não deixá-la entrar em contato com a lâmina. Cubra a placa de Petri e envolva-a com filme de vedação.

Rotule-o com o tipo de dsRNA, concentração, data, hora e número de embriões injetados. Por fim, coloque o prato em uma incubadora a 30 graus Celsius até que os embriões eclodam. Para realizar o pRNAi, primeiro colete pupas da colônia.

Separe as pupas masculinas e femininas em dois pratos separados e coloque-os em uma incubadora de 30 graus Celsius. Verifique as placas diariamente em busca de besouros fechados e transfira esses indivíduos para duas placas de Petri separadas para adultos machos e fêmeas. Alimente esses adultos e mantenha as placas em dias alternados, até que adultos suficientes tenham fechado para iniciar a injeção.

Quando o pool adulto estiver completo, anestesie um besouro fêmea e segure o lado ventral individual para cima com uma mão, segurando a seringa na outra. Penetre suavemente na membrana segmacoria entre os esternitos 2 e 3. Verifique a escala da seringa e dispense lentamente cerca de dois microlitros por fêmea.

Após a injeção, segure a agulha com firmeza por pelo menos 5 segundos e, em seguida, retire-a cuidadosamente. Transfira as fêmeas injetadas para uma placa de Petri com comida de gato. Rotule o prato adequadamente.

Coloque o prato em uma incubadora de 30 graus Celsius. Após 24 horas, transfira as fêmeas injetadas para uma mini gaiola e adicione um número igual de machos jovens não injetados. Rotule a gaiola e adicione comida de gato.

Coloque a gaiola em uma incubadora de 30 graus Celsius, para permitir o acasalamento. A prole resultante pode então ser examinada para determinar os efeitos do pRNAi. Esta imagem mostra uma prole de um indivíduo de pRNAi injetado com DS GFP, proteína fluorescente verde como controle.

Aqui, como acontece com os indivíduos do tipo selvagem, a prole eclodiu com uma faixa pigmentada por segmento. As listras pigmentadas vizinhas foram separadas por uma lacuna não pigmentada. Após o pRNAi pareado, a prole afetada eclodiu com listras pigmentadas vizinhas fundidas, indicando limites segmentares defeituosos.

A gravidade fenotípica foi variável, mas as fusões apareceram consistentemente em certas regiões de contorno, indicando defeitos semelhantes a regras de pares. Da mesma forma, os fenótipos de cutícula de embriões não eclodidos após knockdown pareado mostraram perda de segmentos abdominais, bem como comprimento corporal encurtado. A coloração de embriões precoces com anticorpo engradado para examinar defeitos moleculares mostrou faixas de expressão de igual intensidade em cada segmento em indivíduos controle.

Em contraste, a expressão reduzida foi detectada em listras alternadas na prole de fêmeas injetadas com dsRNA emparelhado com Dmac. Este padrão de expressão reduzida é consistente com o padrão de cutícula defeituoso observado nas larvas eclodidas afetadas. Aqui, pela primeira vez, apresentamos nosso protocolo para derrubar um gene de interesse, durante o desenvolvimento embrionário inicial em Dermestes maculatus, usando interferência de RNA.

Ao tentar esses procedimentos, é importante lembrar de usar embriões ou fêmeas adultas no estágio apropriado. Uma vez dominado, a injeção de cerca de 100 embriões ou 10 fêmeas adultas pode ser feita em meia hora. Após esse procedimento, outros métodos, como coloração de embriões ou PCR quantitativo, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre mecanismos reguladores de genes.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como configurar uma colônia de laboratório Dermestes e realizar a interferência de RNA embrionário e parental neste besouro. Atualmente, apenas um pequeno número de modelos de insetos está disponível para estudos funcionais. As técnicas aqui apresentadas abrem caminho para que os pesquisadores usem o Dermestes como um sistema modelo, expandindo o escopo de insetos passíveis de análise genética molecular.