Fluxo de trabalho de espectrometria de massa de imunoprecipitação sem rótulos para perfis de interactom nuclear em larga escala

Este fluxo de trabalho proteômica permite a identificação imparcial e mapeamento de interações proteígenas-proteínas endógenas com resolução subcelular. Esta técnica é particularmente vantajosa ao investigar proteínas iscas que são sensíveis à dosagem, baixa abundância ou têm múltiplas localizações subcelulares. Este método pode ser aplicado ao mapeamento de interações proteicas endógenas assumindo que há um reagente de afinidade adequado disponível.

Isso é particularmente importante para muitas das milhares de proteínas que têm função desconhecida, muitas das quais foram ligadas à doença humana. Este método pode ser adaptado a qualquer linha celular ou tecido ameniz a fracionamento subcelular. Qualquer proteína com um reagente de afinidade adequado pode ser alvo.

Um resultado comum para experimentos de purificação de afinidade muitas vezes não é resultado. Reagentes muito bons, coleta de dados QC por toda parte, e limitação do manuseio de amostras são todos realmente importantes. Saiba que você tem uma amostra.

Para começar, descongele as pelotas de célula preparadas por 15 minutos em volume de pelotas 1X de tampão frio A com inibidores de protease ou inibidores de fosfatase. Coloque o tubo contendo a pelota celular em um nutador a quatro graus Celsius para ajudar na ressuspensão por 30 minutos. Em seguida, coloque o tubo em uma centrífuga a 2.000 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos para a pelota.

Decante o supernasce e resuspense as células com 5X o volume de células embaladas com tampão A.Incubar no gelo por 20 minutos. Em seguida, pelota novamente a 2.000 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos. Decante o buffer e resuspend com 2X original pacote de volume de célula tampão A com inibidores de protease ou inibidores de fosfatase.

Dounce cerca de sete vezes com o pilão solto A.Centrifuge o lysate por 10 minutos a 2.000 vezes g e quatro graus Celsius. Transfira cuidadosamente o supernasal para um novo tubo e congele-o com nitrogênio líquido. Armazene o lise a menos 80 graus Celsius.

Resuspenque a pelota com 0,9X de volume de pelota de tampão B com inibidores de protease ou inibidores de fosfatase e misture em um nutador por cinco minutos a quatro graus Celsius. Para lise os núcleos, dounce 20 vezes com o pilão de titer B.Misture o lysato nuclear em um nutador por 30 minutos a quatro graus Celsius para que seja homogêneo. Em seguida, centrifugar o lise nuclear por 30 minutos a 21.000 vezes g a quatro graus Celsius.

Pipeta fora do supernante e salvar como um extrato de proteína nuclear solúvel. Para diálise do extrato nuclear solúvel, primeiro corte um comprimento apropriado de tubo de diálise de largura de 24 milímetros com um corte de peso molecular de oito quilodalton. Aperte um lado da tubulação e carregue o nucleoplasma na tubulação.

Depois de carregar o lise, aperte a outra extremidade e submerse em um recipiente de vidro limpo contendo tampão C com inibidores de protease. Dilíspe por três horas a quatro graus Celsius. Depois disso, transfira o nucleoplasma do extrato nuclear dialisado para um tubo e centrífuga a 21.000 vezes g a quatro graus Celsius por 30 minutos.

Transfira três alíquotas de 20 microliter do extrato nuclear para novos tubos de microcentrifuuagem para validação fracionada por mancha ocidental. Usando pontas de pipeta que foram cortadas na ponta, prepare uma mistura de proteínas A/G para cada réplica, combinando 12,5 microliter de coletor de proteína A Sepharose com 12,5 microliters de Protein G Sepharose em tubos de microcentrifuge. Lave a mistura de contas proteína A/G duas vezes com 300 microliters de tampão IP I.Gire as contas a 1.500 vezes g a quatro graus Celsius por um minuto e decante o tampão.

Em seguida, prepare as contas de proteína de anticorpos A/G. Para ligar o anticorpo às contas, adicione ao tubo 300 microliters de tampão IP I e 10 microgramas do anticorpo desejado. Deixe a mistura de anticorpos de contas balançar em um nutador a quatro graus Celsius durante a noite.

Agora, aliquot volumes apropriados dos lisatos nucleares em tubos de microcentrifuge de baixa retenção para um miligrama de entrada de proteína por réplica. Gire o lysate a 16.000 vezes g por 30 minutos e transfira o supernante para um novo tubo. Adicione um microliter de Benzonase a 250 unidades por microliter para cada miligrama do lysato nuclear e a rocha em um nutador a quatro graus Celsius por 10 a 15 minutos.

Para preparar contas para pré-limpar o liseto, adicione 12,5 microliters de cada proteína A e proteína G contas a tubos de baixa retenção de 1,5 mililitro. Lave duas vezes com tampão de lavagem IP I com inibidores de protease. Decante o tampão e adicione um miligrama do lysate nuclear preparado às contas.

Incubar enquanto balança em um nutator por uma hora a quatro graus Celsius. Centrifugar os lises pré-limpos a 1.500 vezes g e quatro graus Celsius por um minuto. Em seguida, lave a proteína de anticorpos as contas A ou G duas vezes com tampão IP I com inibidores de protease.

Depois de centrifugar a 1.500 vezes g e quatro graus Celsius por um minuto, decantar o buffer. Agora transfira o lise nuclear pré-limpo para as contas de proteína de anticorpos A ou G. Incubar enquanto balança em um nutator a quatro graus Celsius por quatro horas.

Após a incubação, centrífuga a 1.500 vezes g e quatro graus Celsius por um minuto. Transfira o supernatante em tubos rotulados como o fluxo para cada réplica. Lave a proteína de anticorpos as contas A ou G quatro vezes com um mililitro de tampão IP II com inibidores de protease.

Em seguida, lave as contas duas vezes com um mililitro de tampão IP I com inibidores de protease. Certifique-se de que todos os buffers sejam removidos após a última lavagem. Proteína elute fora das contas incubando com 20 microlitres de 0,1 molar glycine em pH 2,75 cada por 30 minutos em um nutador.

Em seguida, gire a 750 vezes g e quatro graus Celsius por um minuto e pipeta fora do supernante. Repita esta incubação com o tampão de eluição uma segunda vez. Depois de preparar a pelota de proteína, resuspensá-la com 30 microliters de tampão de alquilação SDS.

Incubar a amostra em um bloco de calor de 95 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, deixe esfriar em temperatura ambiente por 15 minutos. Adicione 300 mililitros de solução UA e 30 microliters de 100 mililitros de TCEP a cada amostra.

Carregue a solução em um filtro centrífugo de 30K. Depois de girar o filtro centrífuga a 21.000 vezes g à temperatura ambiente por 10 minutos, mantenha o fluxo através caso haja um problema com o filtro. Após lavar o filtro de acordo com o manuscrito, adicione três microliters de um micrograma por microliter lyse C resuspended em 0,1 molar Tris pH 8.5.

Encha os filtros até a marca de 100 microliteres com 0,1 molar Tris pH 8.5. Deixe-o digerir por uma hora a 37 graus Celsius enquanto balança em um nutador. Em seguida, adicione um microliter de um micrograma por trippsina de grau MS microliter.

Misture suavemente e deixe a trippsina incubar com a amostra durante a noite a 37 graus Celsius enquanto balança em um nutador. Pela manhã, centrífugas várias vezes a 21.000 vezes g por 20 minutos para eluto os peptídeos do filtro em um tubo de microcentrifuge de baixa retenção limpa. Depois de desalar os peptídeos usando colunas de giro C18, resuspenque os peptídeos liofilizados em sete microliters de 0,1%TFA em 5% de acetonitrila.

Sonicar a amostra por três minutos para garantir que os peptídeos tenham sido resuspended, em seguida, gire para baixo em 14.000 vezes g por 10 minutos. Carregue de 15 a 30% da amostra no sistema de espectrometria de massa cromatografia líquida para análise. Neste estudo, foram analisadas imunoprecipitações triplicadas a partir de cinco miligramas de extrato nuclear hela utilizando um controle somente de contas.

A isca DYRK1A ficou entre as três proteínas enriquecidas sobre o controle, o que indica que o experimento IP-MS realizado era confiável. Mostrou-se uma clara separação entre os interagidores de alta confiança e mais de 95% das proteínas copurificadas como não específicas. Para o exemplo de conjunto de dados DYRK1A, os parceiros de interação IREF apresentaram valores FC-A tão baixos quanto 0,45 representando um enriquecimento muito baixo sobre o controle.

Assim, muitas dessas interações relatadas anteriormente são falsos negativos dentro deste conjunto de dados, ficando abaixo do limiar FC-A de três. O número de cópia absoluta calculado de cada interação IREF não mostrou correlação com os níveis de detecção de um parceiro de interação por IP-MS. O uso combinado de FC-A maior que três e santo maior que 0,9 reduziu a lista de interagidores de alta confiança para seis proteínas.

No entanto, ao aplicar um corte FC-A de maior que três em isolamento, oito proteínas adicionais foram adicionadas à rede. A parte mais crucial deste protocolo é a seleção de reagente de anticorpos para imunoprecipitação. Recomenda-se a validação de seletividade de manchas ocidentais ou coomassie antes de completar este fluxo de trabalho.

Evidências de suporte de interações proteína-proteína podem ser tidos a partir de manchas ocidentais co-IP de interagidores identificados. A ligação cruzada química proteica, embora mais complexa, pode revelar domínios de interação dos interacttores. Usando este método, meu grupo de pesquisa descobriu novas funções para dyrk1A, uma quinase proteica necessária para o desenvolvimento cerebral de mamíferos e ligada à neuropatologia da doença de Alzheimer.