Exon Pulando em miotubos reprogramados diretamente obtidos a partir de células derivadas da urina humana
7 de maio de 2020
Neste artigo, descrevemos um protocolo detalhado para modelagem eficiente do músculo distrofia muscular de Duchenne usando células derivadas de urina convertidas por MYOD1para avaliar a restauração de mRNA de distrofina e níveis de proteína após o salto do exon.
Estabelecemos um novo protocolo para a reprogramação direta de células humanas derivadas da urina em miotubes. Esta modelagem in vitro nos permite avaliar o exon pulando nos môbos derivados do paciente com distrofia muscular de Duchenne. Descobrimos que 3-deazaneplanocina Um cloridrato, DZnep, é inibidor de histona metiltransferase poderia promover significativamente a triagem direta de UDCs no miotube em um curto espaço de tempo.
Esta nova modelagem autóloga baseada em doenças baseadas em UDC poderia levar à aplicação de medicina de precisão para várias doenças musculares. Para começar, centrifufique toda a amostra de urina a 400 x g por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, aspire o supernatante deixando um mililitro no tubo.
Resuspend as pelotas individualmente no restante um mililitro de urina. Colete-os em um único tubo de 50 mililitros e adicione 10 mililitros de tampão de lavagem ao tubo. Centrifugar as amostras a 200 x g por 10 minutos em temperatura ambiente.
Aspire o supernasal deixando 0,2 mililitros no tubo. Resuspense as pelotas de célula em 4,5 mililitros de meio primário. Semente as células em três poços de placa de seis poços revestidos de gelatina, 1,5 mililitros de suspensão celular por poço.
Cultura a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono. Durante três dias adicione 1,5 mililitros do meio primário a cada dia. No quarto dia, substitua o meio por 1,5 mililitros de meio de crescimento suplementado conforme descrito no manuscrito.
Após o quarto dia, substitua o meio de crescimento suplementado a cada dois dias até que a cultura UDC seja 80 a 90% confluente. Em seguida, remova o meio e lave as células com PBS. Divida as células usando 0,25% de trippsina-EDTA.
Semear as células a uma densidade de 3.000 a 5.000 células por centímetro quadrado em um novo prato revestido de gelatina de 60 milímetros. Semente os UDCs a 3.000 a 5.000 células por centímetro quadrado em um prato revestido de gelatina 60 milímetros e coloque o prato na incubadora. 24 horas após a semeadura, infecte as células com retrovírus descongelado em uma multiplicidade de infecção de 200.
Use meio fresco com uma concentração de brometo de hexadimetrina de 8 microgramas por mililitro. Incubar por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Para selecionar as células transduzidas pelo MYOD1, substitua o meio de cultura por um meio de crescimento fresco contendo um micrograma por mililitro de puromicina.
Continue a mudar o meio a cada dois dias por sete a dez dias. Emplaque os UDCs miod1 transduzidos em uma placa de colágeno revestida de vários poços. Após incubar as células por 24 horas, mude o meio de crescimento para o meio de diferenciação descrito no manuscrito.
Em seguida, depois de três dias, mude o meio de diferenciação de diferenciação para o meio de diferenciação fresco sem DZNep. Continue mudando o meio a cada três dias. Para transfetar o oligonucleotídeo antissamerado nos UDCs transduzidos pelo MYOD1, misture reagente de transfecção ASO e meio de diferenciação até uma concentração final de um a 10 micromolar.
E use esta mistura para substituir o meio nos poços. Incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de umidade. Após 72 horas de incubação com ASO, mude o meio de diferenciação médio para fresco sem ASO.
Três a sete dias após a transfecção do ASO, remova o meio de diferenciação. Lave os UDCs uma vez com PBS e adicione o tampão de lise celular. Colher o RNA total usando um kit de extração de RNA.
Meça a concentração de RNA com um espectotômetro. Como descrito no manuscrito, combine os reagentes para um passo RT-PCR em tubos PCR. Coloque os tubos PCR no termociclador e execute o termociclador.
Realize a eletroforese do microchip e calcule a eficiência de pular o exon. Os UDCs foram coletados facilmente e não invasivamente e formaram colônias dentro de uma semana de cultura primária. Os UDCs transfectados MYOD1 em meio de diferenciação com DZNep poderiam se fundir uns aos outros e formaram miotubes multinucleados de forma eficiente.
RT-PCR detectou claramente exon pulando em MYOD1-UDCs derivados de pacientes com distrofia muscular de Duchenne. Pular a eficiência dependia da dose de ASO. O salto de exon dependente de dose também foi detectado pela mancha ocidental.
As intensidades da distrofina foram medidas com microscópio fluorescente uma semana após a transfecção do ASO. Sinais fluorescentes notavelmente mais elevados foram observados em MYOD1-UDCs tratados com ASO do que no controle. Podemos modelar qualquer doença muscular que leve à compreensão da fisiopatologia dessas doenças.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para modelar a distrofia muscular de Duchenne (DMD) utilizando células derivadas de urina convertidas por MYOD1 (UDCs). O estudo avalia a restauração dos níveis de mRNA e proteína de distrofina após o salto de éxon.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Pesquisa sobre Distrofia Muscular
Contexto
- A distrofia muscular de Duchenne é uma desordem genética grave caracterizada pela degeneração muscular progressiva.
- As terapias atuais visam restaurar a expressão da distrofina em células musculares.
- Células derivadas da urina oferecem uma fonte não invasiva para modelar doenças musculares.
- MYOD1 é um fator de transcrição que pode converter fibroblastos em células miogênicas.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um protocolo confiável para gerar miotúbulos a partir de células derivadas da urina.
- Avaliar a eficácia da salto de exon na restauração dos níveis de distrofina.
- Explorar o potencial das CUDs na medicina de precisão para doenças musculares.
Métodos Utilizados
- Reprogramação direta de células derivadas da urina em miotubos usando MYOD1.
- Cultura in vitro de CUDs com meios específicos de crescimento e diferenciação.
- Transfecção de oligonucleotídeos antisense para induzir salto de éxon.
- Avaliação dos níveis de mRNA e proteína por meio de RT-PCR e análise de Western blot.
Resultados Principais
- UDCs transduzidas com MYOD1 diferenciaram-se com sucesso em miotúbulos multinucleados.
- A eliminação de éxons foi confirmada por meio de RT-PCR e Western blot, demonstrando eficiência dependente da dose.
- Níveis mais elevados de distrofina foram observados nas células tratadas em comparação com os controles.
- O protocolo permite a modelagem eficiente da DMD e potencialmente de outras doenças musculares.
Conclusões
- O protocolo estabelecido fornece uma ferramenta valiosa para o estudo da DMD.
- A exclusão de éxons representa uma estratégia terapêutica promissora para restaurar a expressão da distrofina.
- Essa abordagem pode facilitar avanços na medicina de precisão para distrofias musculares.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A reprogramação direta de células derivadas da urina em miotúbulos permite a modelagem rápida e não invasiva da distrofia muscular de Duchenne (DMD) para avaliação pré-clínica de terapias de salto de éxon. Essa abordagem sustenta a confiança preditiva no engajamento do alvo e na restauração funcional, orientando decisões de portfólio em estágios iniciais para terapêuticos neuromusculares de precisão. A escalabilidade e a especificidade do paciente tornam essa plataforma um ativo valioso para pesquisas translacionais e pipelines de triagem de fármacos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Facilita a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da modelagem de mutações de DMD em miótubos derivados de pacientes.
- Permite a validação funcional de alvos por meio da quantificação da restauração da distrofina após o salto de éxon.
- Oferece confiança preditiva nas estratégias de salto de éxon ao associar correção molecular à expressão proteica.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Oferece um sistema celular padronizado e reproduzível para triagem de oligonucleotídeos antisense e compostos relacionados.
- Fornece resultados quantitativos por meio de RT-PCR, Western blot e imunocitoquímica para desenvolvimento robusto de ensaios.
- Permite plataformas escaláveis e específicas para cada paciente para avaliação em alto rendimento da eficiência de salto de éxon.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha modelos celulares relevantes para doenças com pontos finais de biomarcadores translacionais, como a expressão de distrofina.
- Apóia a continuidade da descoberta in vitro até a validação pré-clínica, modelando respostas específicas do paciente.
- Reduz a ambiguidade mecanicista na avaliação terapêutica ao medir diretamente a restauração funcional da proteína.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método se integra à continuidade descoberta-a-pré-clínica ao permitir testes de hipóteses, triagem de compostos e validação translacional em um único sistema derivado de paciente.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação da hipótese nula quanto à eficácia da exclusão de éxons e correção de vias em modelos de DMD.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas reprodutíveis para priorização de compostos e análise de resposta à dose.
- Análises: Permite a medição da eficiência de exclusão de éxons e da restauração da distrofina para orientar decisões de continuidade ou interrupção.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro a modelos pré-clínicos ao alinhar respostas celulares com biomarcadores relevantes para a doença.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável e escalonável, adaptável a outras doenças musculares e genótipos de pacientes.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz o risco biológico no desenvolvimento precoce de fármacos neuromusculares.
- Valor Operacional: Padroniza modelos e fluxos de trabalho de ensaios específicos para cada paciente, garantindo reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de avançar ou não avançar e o progresso eficiente em termos de capital dos terapêuticos com salto de éxon.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco de candidatos com base na restauração funcional do alvo.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em cultura celular, transdução viral e técnicas de análise molecular.
- Requer acesso a equipamentos para RT-PCR, Western blot e microscopia de fluorescência.
- Exige padronização entre equipes de protocolos para reprodutibilidade entre locais e estudos.
- A adaptação a outros modelos de doenças musculares pode exigir otimização das condições de reprogramação e diferenciação.
- A eficiência e a escalabilidade são influenciadas pela qualidade da amostra do paciente e pelos parâmetros de transdução.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:54
Isolation and Primary Culture of Urine-Derived Cells
2:31
Infection with MYOD1-Retroviral Vector
3:20
Myogenic Differentiation of MYOD1-Transduced UDCs
3:53
Evaluation of Exon Skipping Efficiency by RT-PCR
5:05
Results: Restoration of Dystrophin mRNA in UDCs
5:57
Conclusion
