Monitorando a Dinâmica da Interação Proteína-RNA In Vivo em Alta Resolução Temporal Usando χCRAC

O CRAC cinético pode ser usado para estudar associações temporais entre RNA e proteínas de ligação ao RNA em uma escala de tempo curta sem precedentes. Quando combinado com nosso reticulador, o CRAC cinético é capaz de reticular células vivas em segundos. Isso reduz as respostas aos danos causados pelos raios UV e facilita o estudo das respostas ao estresse na resolução em escala mínima.

O Kinetic CRAC é um protocolo muito longo que pode ser desafiador para novos usuários. Além disso, trabalhar com RNA apresenta seus próprios desafios. Para evitar a degradação do RNA, deve-se filtrar, esterilizar todas as soluções e certificar-se de que as pipetas e a bancada do laboratório sejam mantidas limpas.

A demonstração visual desse método é crítica porque algumas das etapas não são muito intuitivas. Isso inclui reticulação UV e colheita de células, bem como extração de RNAs reticulados do gel. Para realizar a reticulação UV em microrganismos em solução, inocular 3,5 litros do meio desejado com levedura a um OD inicial 600 de 0,05 e cultivar a cultura durante a noite a 30 graus Celsius com agitação contínua a 180 rpm.

Quando as células atingirem o OD desejado, despeje 500 mililitros da cultura diretamente no reticulador Vari-X-linker e irradie-o com 250 milijoules de 254 nanômetros UV. Após a reticulação, use um dispositivo de filtragem a vácuo para filtrar as células. Enrole a membrana com as células filtradas e coloque-a em um tubo cônico de 50 mililitros rotulado como T0. Filtre as células restantes em seis filtros diferentes e solte as membranas em três litros de meio indutor de estresse pré-aquecido, misturando-as vigorosamente com uma pipeta por 50 segundos. Continue reticulando as células em volumes de 500 mililitros nos pontos de tempo desejados e armazene as amostras a menos 80 graus Celsius.

Para reticular as células aderentes, transfira a placa de cultura de quartzo com as células para a bandeja especializada e irradie-a com 300 milijoules de 254 nanômetros UV. Coloque imediatamente o prato no gelo. Remova o meio de crescimento do prato e adicione 10 mililitros de PBS gelado. Colete as células raspando e transfira-as para um tubo cônico de 15 mililitros.

Em seguida, pulverize as células por centrifugação a 300 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Depois de lavar as células com PBS, remova o PBS e congele o pellet da célula em gelo seco. Armazene a amostra a menos 80 graus Celsius, conforme necessário.

Defina a centrífuga para quatro graus Celsius e prepare duas fileiras de tubos de 1,5 mililitro por amostra para eluição. Gire rapidamente as colunas com as contas de níquel para se livrar do volume vazio. Em seguida, coloque as colunas na primeira fileira de tubos de eluição e encha-as com 200 microlitros de tampão de eluição.

Após dois minutos, gire rapidamente as colunas e transfira-as para a segunda linha de tubos. Em seguida, repita a eluição conforme demonstrado anteriormente. Quando terminar, misture todos os eluatos em um tubo de cinco mililitros e adicione dois microlitros de 20 miligramas por mililitro de glicogênio.

Em seguida, adicione 100 microlitros de ácido tricloroacético à amostra e vortex por 30 segundos. Após lavar a amostra com acetona, ressuspenda-a em 30 microlitros de tampão de carga de proteína. Em seguida, verifique a radioatividade usando o contador Geiger.

Aqueça a amostra por 10 minutos a 65 graus Celsius e carregue-a em um gel Bis-Tris pré-moldado de um milímetro a 12%. Execute o gel por 90 minutos a 125 volts no tampão MOPS. Quando terminar, enrole o gel em filme plástico e prenda-o no interior de um leve e apertado com fita adesiva.

Depois de expor o gel ao filme radiográfico automático, revele o filme cortando o filme plástico que cobre o gel, certificando-se de não mover o gel e deslocar a imagem. Coloque o filme sobre o gel e retire a faixa de interesse. Coloque a fatia de gel em um tubo de dois mililitros e esmague-a com uma ponta de pipeta P1000.

Em seguida, adicione tampão de proteinase K e proteinase K. Incube a amostra a 55 graus Celsius com agitação vigorosa. Execute o cDNA em um gel pré-moldado de TBE a 6% a 100 volts por uma hora, usando uma escada apropriada para a quantificação de fragmentos curtos de DNA. Quando terminar, coloque o gel em um recipiente à prova de líquidos com TBE suficiente para cobri-lo e adicione uma quantidade adequada de corante SYBR Safe.

Manchar o gel durante 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, substitua o tampão contendo SYBR por TBE novo. Lave o gel por 10 minutos com agitação suave.

Drene o TBE e coloque o gel em uma pasta transparente. Corte a pasta em um tamanho apropriado e crie uma imagem do gel com um quantum de imagem. Extirpar os fragmentos de DNA entre 175 e 400 pares de bases e colocar o pedaço de gel em um tubo de 1,5 mililitro.

Esmague o gel com uma ponta de pipeta P1000 e adicione 400 microlitros de água. Em seguida, incube-o por uma hora a 37 graus Celsius enquanto agita. Congele a amostra em gelo seco por 10 minutos.

Em seguida, repita a incubação a 37 graus Celsius. Insira dois filtros de microfibra de vidro dentro de uma coluna de filtro colocada em um tubo. Em seguida, use uma ponta de pipeta P1000 cortada para transferir a suspensão de gel TBE para a unidade de filtro e gire-a a 17.000 G por 30 segundos.

Este protocolo foi usado para monitorar as interações Nrd1-RNA em células de levedura submetidas a um ambiente carente de glicose. As amostras foram reticuladas antes da mudança para meio sem glicose, bem como um, dois, quatro, oito, 14 e 20 minutos depois. As autorradiografias do experimento mostraram um sinal intenso no peso molecular esperado de Nrd1, representando a proteína ligada a RNAs curtos marcados com rádio não passíveis de sequenciamento.

O sinal acima dessa banda, que é a proteína reticulada a fragmentos de RNA mais longos, foi isolado. Para alterar o protocolo cinético CRAC para células de mamíferos, um estágio especial foi desenvolvido para permitir a irradiação UV de placas com células aderentes. A eficiência dessa configuração foi medida por meio de reticulação e captura de GFP RBM7 marcado de forma estável.

O reticulador foi capaz de recuperar complexos de RNA de proteínas de células de mamíferos usando irradiação UV de 254 nanômetros em eficiências comparáveis a um dispositivo de irradiação UV amplamente utilizado. O desenvolvimento de uma placa de Petri de quartzo permeável aos raios UV durante a reticulação aumentou ainda mais a recuperação de complexos de RNA de proteína. Os dados do Nrd1 mostram que a proteína se liga a muitos transcritos de RNA não codificantes, indicando que ela está envolvida na degradação desses transcritos.

A ligação a transcritos que codificam HXT6 e HXT7, ambos regulados positivamente durante a falta de glicose, também foi demonstrada. O CRAC cinético permite medir as interações dinâmicas entre os RNAs de proteínas durante o desenvolvimento celular, as respostas ao estresse e a montagem de complexos macromoleculares, como o ribossomo ou o spliceossomo.