Visualização bidimensional e quantificação de labile, nutrientes vegetais inorgânicos e contaminantes no solo

A biociclagem química de elementos no solo desempenha um papel crucial nos sistemas ambientais. Com este protocolo, a distribuição das frações de elementos disponíveis na planta pode ser visualizada em 2D usando imagens de espectrometria de massa DGT. Este método é único em sua capacidade de visualizar e quantificar níveis ultratraços de várias espécies de soluto inorgânico na interface do soluto, excedendo substancialmente a resolução espacial de métodos alternativos.

Além da investigação de fluxos de mão de obra e soluto em solos e sedimentos, esse método pode ser aplicado para investigar como as raízes das plantas absorvem nutrientes e elementos contaminantes. Para a fabricação de gel DGT, primeiro coloque uma fina película de suspensão de gel de ligação de ânion e cátion à base de poliuretano em uma placa de vidro e coloque a placa em um forno para iniciar a formação do gel por evaporação do solvente. Depois de repetir a aplicação e evaporação três vezes, hidrate a placa de vidro tripla revestida resultante em banho-maria para obter um gel de ligação de ânion e cátion misto de 0,1 milímetro de espessura, à prova de rasgos.

Para montar o rizotron, use dois grampos para prender uma pequena lâmina de acrílico na parte inferior da elevação do rizotron com a pressão dos grampos direcionada para a estrutura do rizotron, de modo que a placa não dobre para dentro. Incline o rizotron ligeiramente em direção à pequena placa de plástico e encha o rizotron com solo pré-umedecido até uma altura aproximada de quatro centímetros. Agite levemente o rizotron para distribuir uniformemente o solo e use uma ferramenta de compactação para comprimir suavemente o solo em alguns milímetros.

Repita o enchimento e a compressão até que o rizotron esteja cheio de terra, deixando um espaço de três centímetros no topo. Use fita adesiva para fixar cuidadosamente um pedaço de folha de PTFE de 13 por 22 centímetros na estrutura do rizotron, um canto de cada vez, aplicando tensão para garantir uma superfície plana da folha. Quando a folha de PTFE for plana e contígua à superfície do solo, prenda um segundo pedaço de folha na extremidade inferior do rizotron, sobrepondo o pedaço superior de folha de PTFE em um centímetro da mesma maneira.

Quando a segunda peça estiver presa, aplique uma capa protetora de papel alumínio. Coloque uma placa frontal no rizotron cheio de solo e coberto com papel alumínio e coloque um trilho ao redor de cada lado do rizotron. Em seguida, aperte os parafusos manualmente para fixar os trilhos na placa frontal ao rizotron com a posição dos parafusos voltada para o lado fechado do rizotron.

Para regar o solo, empurre as pontas das pipetas nos orifícios de irrigação e deixe a água fluir para o solo por gravidade. Para cultivar plantas, plante até duas mudas no rizotron e adicione cinco mililitros de água diretamente às mudas para apoiar seu crescimento. Cubra a abertura superior do rizotron nos primeiros dois dias após o plantio com um filme transparente de retenção de umidade e envolva o rizotron em papel alumínio para evitar o crescimento microfítico.

Em seguida, coloque o rizotron plantado em uma sala de crescimento com as condições ambientais definidas para os requisitos específicos da planta e incline o rizotron de 25 a 35 graus para garantir o desenvolvimento da raiz ao longo da placa frontal por meio do gravitropismo. Para aplicar o gel DGT fabricado, corte uma membrana de policarbonato de 10 mícrons de espessura com um tamanho de poro de 0,2 mícron para pelo menos mais um centímetro de largura e comprimento de cada lado do gel e coloque a membrana no gel. Aplique água para remover as bolhas de ar da pilha e use fita isolante de vinil para fixar a membrana à placa ao longo das quatro bordas do gel.

Depois de remover a placa frontal e as películas protetoras, alinhe o visor de uma câmera digital reflex de lente única equipada com uma lente macro ao centro da região de interesse no gel e incluindo uma barra de escala na imagem adquira uma foto ortogonal da região de interesse. Em seguida, alinhe uma borda da placa equipada com a pilha de membrana de gel com uma borda do rizotron aberto. Dobre suavemente a placa em direção ao solo e use os trilhos e parafusos para prender a placa ao rizotron.

Após o período de amostragem de solidão, transfira a placa frontal do rizotron para uma capela de fluxo laminar com o lado da pilha de membrana de gel voltado para cima e remova cuidadosamente a fita e a membrana de policarbonato que cobre o gel. Aplique água para ajudar o gel a flutuar livremente em uma fina película de água na placa com o lado de contato do solo voltado para cima e transfira o gel para uma membrana de polietersulfona com tamanho de poro de 0,45 mícron e suporte de papel mata-borrão. Depois de cobrir a pilha de gel com papel alumínio, coloque a pilha em um secador de gel a vácuo.

Quando o gel estiver totalmente seco, use fita adesiva dupla face para fixar o gel seco junto com outras amostras de gel em uma placa de vidro. Para realizar uma análise de varredura de linha de espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado de ablação a laser dos géis DGT secos, primeiro fixe os espaços em branco e os padrões da amostra no estágio de amostra de ablação a laser e trave o estágio do laser na célula de ablação do sistema de ablação a laser. No software de ablação a laser, mova a região de interesse na superfície do gel e desenhe uma única linha de aproximadamente um mililitro de comprimento na superfície do padrão de gel.

Clique com o botão direito do mouse na linha na janela de padrões de varredura para verificar se os parâmetros de ablação a laser foram definidos e adotados e use a ferramenta duplicar varreduras para duplicar essa linha quatro vezes com uma distância entre linhas maior que o diâmetro do ponto. Depois de repetir esta linha para cada branco de calibração padrão de gel e método em branco, desenhe uma única linha ao longo da borda superior da área retangular da amostra de gel a ser analisada e duplique a linha para criar linhas paralelas para toda a área da amostra, conforme demonstrado, usando uma distância entre linhas de 300 a 400 micrômetros. Verifique se cada ponto inicial e final de cada linha está devidamente focado na superfície do gel e clique em analisar lote para iniciar a sequência de amostra no espectrômetro de massa de plasma indutivamente acoplado.

Clique na emissão na janela de energia do laser para recarregar a cabeça do laser. Clique em executar para abrir a janela do experimento de execução e selecione somente os padrões selecionados. Defina o atraso de lavagem para 20 a 30 segundos.

Selecione a caixa de laser ativado durante as varreduras e defina o tempo de aquecimento do laser para 10 segundos. Em seguida, clique em executar e ok para iniciar a análise de varredura de linha e monitorar a intensidade do sinal bruto em contagens por segundo para cada isótopo no espectrômetro de massa de plasma indutivamente acoplado em tempo real. Cada linha deve começar e terminar com um gás em branco.

Após a análise, importe o arquivo de dados brutos para cada linha ablacionada em uma planilha. A tabela de dados brutos mostra as leituras de espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado para cada isótopo em contagens por segundo e os pontos de tempo correspondentes em segundos. Liste todas as linhas próximas umas das outras em colunas diferentes.

Calcule um branco de gás médio para cada isótopo de todos os valores de gás em branco registrados antes das ablações de linha e subtraia o branco de gás médio das intensidades brutas correspondentes para cada isótopo para corrigir o sinal de fundo. Para aplicar a normalização interna, divida a intensidade do sinal corrigido do branco de gás de cada isótopo pela intensidade do sinal corrigido do branco do carbono padrão interno 13 para cada ponto de dados para corrigir variações na quantidade de material ablado e desvio instrumental. Corte os dados antes do início e depois do final de cada linha ablacionada para remover o sinal de fundo do gás em branco e transponha a tabela de dados para obter uma matriz de grade na qual cada linha corresponde a uma linha ablacionada e cada coluna corresponde a um valor de intensidade de isótopo normalizado.

Em seguida, aplique a função de calibração obtida a partir da análise dos padrões de gel e salve a matriz de dados calibrada como um arquivo de texto. Para gerar uma imagem, importe a matriz de dados de amostra calibrada para o software de análise de imagem como uma imagem de texto e aplique o fator de correção da proporção e uma tabela de pesquisa para visualizar os gradientes químicos na imagem de soluto. Ajuste o equilíbrio de cores da imagem para controlar os limites inferior e superior da faixa de exibição, adicione uma barra de calibração e salve a imagem de soluto como um arquivo TIF.

Use o comando copiar para o sistema para copiar a imagem sólida e colar a imagem no software de editoração eletrônica. Em seguida, dimensione, corresponda, alinhe e componha a imagem sólida com uma foto da região de interesse e das outras imagens de soluto. O alinhamento das imagens de soluto com uma imagem fotográfica da região de interesse revela que a distribuição do fluxo sólido 2D submilimétrico de diferentes elementos é altamente variável de acordo com a estrutura do solo e a morfologia da raiz.

Por exemplo, nesta análise de uma raiz jovem de trigo sarraceno cultivada em solo livre de carbonato, fertilizada com nitrato de amônio, a distribuição submilimétrica de solutos mostrou zonas de diminuição dos fluxos de alumínio, fósforo e ferro ao lado de seções radiculares mais antigas devido à absorção radicular e fluxos altamente aumentados de magnésio, alumínio, fósforo, manganês e ferro no ápice radicular devido à localização de processos de mobilização de nutrientes. Nesta análise, uma depleção distinta de zinco, cádmio e chumbo pode ser observada na posição imediata da raiz, ilustrando que as raízes da espécie de salgueiro tolerante a metais Salix smithiana atuam como um sumidouro localizado para metais lábeis em solo contaminado. Nesta análise, a distribuição de metais traços lábeis ao lado das raízes de Salix smithiana foi co-localizada com a distribuição do pH, usando um gel de ligação catiônico optode-DGT planar de camada única combinado.

Essa combinação de métodos revelou que o aumento dos fluxos de soluto de manganês, ferro, cobalto, níquel, cobre e chumbo foi associado a uma diminuição do pH em aproximadamente uma unidade, sugerindo solubilização de metal induzida por pH. É fundamental garantir um contato próximo e estável entre a ferramenta DGT e a superfície sólida para evitar artefatos analíticos. Em caso de dúvida, repita o procedimento de aplicação do gel.

Este método pode ser combinado com outras técnicas de imagem sólida baseadas em difusão, como optódios planares para avaliar simultaneamente uma série de parâmetros envolvidos na absorção de elementos vegetais.