Citometria de fluxo de alta dimensionalidade para análise da função imune de tecidos dissecados de implantes

Este protocolo pode nos ajudar a caracterizar a resposta imune do hospedeiro contra diferentes biomateriais que podem subsequentemente auxiliar no projeto de melhores implantes médicos futuros. A citometria de fluxo nos dá informações sobre células imunes infiltrando um biomaterial, o que nos ajuda a determinar mecanismos de como as células respondem à lesão e à implantação do material, bem como alvos para melhorar a terapêutica. O mesmo protocolo pode ser modificado para caracterizar a resposta imune em diferentes cenários.

Dissecção do músculo quádruplo de camundongos que receberam implante de MEC há uma semana e coletados em um tubo de 50 mililitros contendo cinco mililitros de soro livre. Por fim, corte o tecido com tesoura. Em seguida, adicione cinco mililitros de meio de enzimas digestivas ao tubo.

Coloque o tubo contendo meios digestivos e tecidos cortados em cubos em uma incubadora de agitação por 45 minutos a 37 graus Celsius e 100 RPM. No final da incubação, filtre a suspensão de tecido digerido através de um filtro de 70 mícrons em um tubo individual de 50 mililitros. Use uma cabeça de seringa de cinco mililitros para amassar qualquer pedaço sólido de tecidos e lave o filtro com PBS à temperatura ambiente.

Descarte qualquer resíduo remanescente no filtro e ajuste o volume do tubo para 50 mililitros com PBS à temperatura ambiente. Coletar as células por centrifugação e ressuspender os pellets em 10 mililitros de solução fria de EDTA de cinco milimolares em PBS. Se as células sanguíneas estiverem presentes na amostra, ressuspenda o pellet em um mililitro de tampão de lise eritrocitária, incube por 10 minutos e, em seguida, adicione nove mililitros de EDTA.

Deixe a suspensão no gelo por 10 minutos. Em seguida, ajuste o volume para 50 mililitros com PBS frio. Coletar as células por centrifugação e ressuspender os pellets e 100 microlitros de PBS frio.

Transfira 10 microlitros da suspensão para tubos microcentrífugos individuais e misture com 10 microlitros de trip e azul para contagem. Distribua o volume restante de células em cada poço de uma placa de fundo V 96 poço. Remova 20 microlitros de células do poço e adicione-as em um novo poço para usar como controle sem manchas.

Em seguida, use PBS para trazer o volume final em cada poço para 200 microlitros. Coletar as células no fundo dos poços de placa por centrifugação e ressuspender as células em 100 microlitros de uma concentração de um a 1000 de corante de viabilidade por poço. Ao final da incubação, lave cada poço com 100 microlitros de PBS fresco e ressuspenda os pellets em 200 microlitros de tampão de coloração por poço.

Após a segunda centrifugação, ressuspender as células em 50 microlitros de uma a 100 diluições de bloqueador de monócitos. Incubar a suspensão celular por cinco minutos no gelo e, em seguida, adicionar 50 microlitros de coquetel de anticorpos. Incubar por 30 minutos em gelo protegido da luz.

Em seguida, lave os poços com 100 microlitros de tampão de coloração por poço. Centrifugar novamente as células e lavar com 200 microlitros de tampão corante. Repetir o processo mais duas vezes seguido de ressuspensão das células em 400 microlitros de tampão corante.

Antes de analisar a amostra, execute uma amostra não corada para permitir que a população celular seja ajustada em um gráfico de dispersão lateral versus um gráfico de dispersão para frente. Em seguida, execute a amostra manchada. Extraia a assinatura autofluorescente.

Em seguida, importe os arquivos FCS para usá-los como um controle para desmisturar. Clique no ícone de desmistura para abrir o assistente de desmistura e executar a desmistura usando todos os controles de cor única, limitando as populações positivas e negativas. Em seguida, clique na seção QC e veja o índice de complexidade.

O índice de complexidade é uma medida de quão distinguível é uma coleção de assinaturas espectrais quando as assinaturas espectrais são desmisturadas. Finalmente, desmisture a amostra clicando em live unmix. Aqui, os resultados de um fato de 14 cores em tecido de camundongo controle podem ser observados.

Nesta análise, várias populações lobistas, como neutrófilos ly6g positivos e classes de monócitos ly6c de média e alta expressões, puderam ser observadas. MHC alto de CD11c duas células dendríticas positivas foram prontamente aparentes quando acopladas contra CD11b para descartar macrófagos e outras células de linhagem mielóide, como neutrófilos e monócitos. Um subconjunto de células dendríticas CD86 positivas para CD206 pôde ser identificado concentrando-se nessa população CD11c positiva, que inclui tanto populações de células dendríticas CD86 altas M1 quanto CD206 M2 altas.

F4/80 demonstrou um gradiente de expressão como é comumente observado em várias populações de macrófagos. Siglec-F esteve presente em ambas as populações positivas e negativas de F4-80, provavelmente correspondendo a um subgrupo de macrófagos e eosinófilos, respectivamente. Embora a coloração com marcadores de superfície celular permita que essas designações de tipos celulares sejam feitas, é importante notar que as células que expressam diferentes marcadores devem ser vistas de maneira funcional, em oposição a uma classificação mais binária.

Ao tentar este protocolo, tenha em mente que entender a assinatura autofluorescente de suas amostras subcoradas antes de projetar seu painel é fundamental para conseguir uma melhor mistura. Além de analisar as células, as células isoladas podem ser classificadas em populações específicas para avaliações a jusante com ensaios celulares, in vitro, análise transcriptômica, ou para análise microscópica para avaliar a morfologia celular. A crescente complexidade das análises de citometria de fluxo de biomateriais ajuda a preencher a lacuna entre os estudos básicos de imunologia e a engenharia de novas terapêuticas.