Name: Detecção sensível de Proteopathic Sementeira Atividade com FRET Citometria de Fluxo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Aprenda a detectar atividade de semeadura proteopática com citometria de fluxo FRET em amostras biológicas. Este método sensível permite avaliar agregados proteicos em doenças neurodegenerativas com alta especificidade.

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Este trabalho foi apoiado pelo Tau Consortium (M.I.D); National Institutes of Health Grant 1R01NS071835 (M.I.D.), um subsídio do Departamento de Defesa PT110816 (para M.I.D.), 1F32NS087805 (para J.L.F.) e 1F31NS079039 (para B.B.H.).

NOTA: Este protocolo enfatiza a utilização de citometria de fluxo de FRET para detectar a actividade de sementeira a partir de amostras biológicas do rato. Também é compatível com fibrilas recombinantes e amostras biológicas humanas. Rato eutanásia e do cérebro da colheita foi realizada em conformidade com os procedimentos IACUC-aprovado. 1. Cérebro Extração <ol><li> Após anestesia com isoflurano profunda (2%), perfundir um rato com PBS gelado contendo 0,03% de heparina, e extrair o cérebro seguindo os detalhes descritos nos Gage et al. 18 </li><li> Colocar o tecido extraído num crio-frasco, e encaixe congelamento por colocação em azoto líquido. Alternativamente, congelar tecido em gelo seco. Uma vez congelado, se necessário transferir tecido para -80 ° C e armazenar durante um longo período de tempo,. NOTA: Este protocolo é compatível com homogeneizados de cérebro inteiro ou regiões microdissecadas cerebrais. Veja Hagihara et al. Para um protocolo micro-dissecção detalhada 19. </li></ol&gt; 2. Preparação de material de semente Biológica <ol><li> Preparar tampão de homogeneização por dissolução de inibidores de protease (EDTA livre) em 1x TBS (1 comprimido por 10 mL). Vortex vigorosamente, e armazenar no gelo. Os inibidores de protease deve ser EDTA livre, a fim de preservar a viabilidade das células de biossensor. </li><li> Pesar tecido cerebral congelado em um barco pesa descartável, e transferir para um tubo cônico de 5 ml. Adicionar tampão de homogeneização arrefecido em gelo de tal forma que a solução final é de 10% peso / volume. Temporariamente armazenar no gelo. A massa de tecido e o volume de tampão de homogeneização subsequente irá variar dependendo do tamanho do cérebro e / ou regiões utilizado. Aqui, um rato adulto hemibrain pesando 0,2 g é suspenso em 2 ml de uma solução a 10% w / v. </li><li> Amostras de transferência em uma sala fria, e ajustar um sonicador de sonda para as configurações apropriadas. Para sonicação com sonda com um ruptor Omni (mostrado aqui), ajustar a potência para 20%, o que corresponde a cerca de 75 W. O uso de um modo de pulso para assegurar as amostras não forem ovER-aquecida durante a sonicação. Defina o pulsador a 30%, o que corresponde a cerca de 500 ms. </li><li> Limpar a ponta da sonda de ultra-sons, por lavagem com água, isopropanol, e novamente com água, retirando a sonda entre em cada solução. Certifique-se de lavar e limpar ambos os lados e fundo da sonda com LAB-toalhetes. </li><li> Trabalhando com uma amostra de cada vez, submergir a ponta da sonda em tampão de homogeneização, e iniciar o sonicador. Usando as configurações de energia e pulser descritos acima, entregar 25 pulsos totais. Assegurar que o tecido está completamente em suspensão. Ter cuidado para evitar a formação de espuma da amostra, durante este passo. NOTA: As amostras são suscetíveis à formação de espuma, se a) o volume total é baixo ou b) o homogeneizado aquece. Com este instrumento específico, não sonicate com volumes inferiores a 250 mL. Para assegurar amostras ficar refrigeradas, os tubos podem ser armazenados em gelo durante este passo. </li><li> Limpe a sonda por enxugando ligado residual, em seguida, entregar 10 pulsos para uma proveta oágua limpa f. Lavar os lados e o fundo da sonda com água, isopropanol, e água de novo (como no passo 2.4), limpando secar entre cada passo. Para evitar a contaminação, lavar abundantemente a sonda entre amostras. NOTA: Com agregados tau, não encontramos que os métodos de limpeza mais rigorosos são necessários para prevenir a contaminação da amostra-para-amostra. Outros amilóides, no entanto, pode exigir cuidados adicionais que tem sido extensivamente descritos na literatura 20,21. </li><li> Loja homogeneizados em gelo até que todas as amostras tiverem sido processados. </li><li> Girar a 21.300 homogenatos xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Transferir o sobrenadante para um tubo limpo, tomando cuidado para não perturbar o sedimento. Descarte o sedimento. Alíquota o sobrenadante, e armazenar a -80 ° lisados ​​C para posterior utilização. Evitar ciclos de congelamento / descongelamento dos homogeneizados, no entanto, dado que isso reduz a eficiência da semeadura. </li></ol> 3. repique Biosensor Cells NOTA:Use quatro linhas de células para este ensaio: HEK 293T (célula linha # 1), RD-P301S-PCP (célula linha # 2), RD-P301S-YFP (célula linha # 3) e RD-P301S-CFP / YFP ( linha celular # 4). Por favor, refira Tabela 1 para a contribuição de cada linha celular para o ensaio. <ol><li> Em um ambiente estéril, meio de cultura aspirado. Lavar as células com PBS quente, e aspirado. Tripsinizar as células (3 ml de tripsina-EDTA (0,05%)) durante 3 min, diluiu-se com meio de cultura quente (9 ml de DMEM, 10% FBS, 1% de pen / strep, 1% de GlutaMax), e transferir imediatamente as células para um tubo cónico. </li><li> Centrifugar a 1.000 células xg durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar médio e ressuspender pellet celular em meio de cultura quente. </li><li> Usando um hemocitómetro, determinar a densidade celular para cada linha celular. A densidade celular irá variar dependendo da confluência no momento da colheita e o volume de ressuspensão. Ressuspender as células colhidas a partir de uma placa de 10 cm a 90% de confluência em 10 ml de meio, para a densidade celular de aproximadamente 1 milhão de células / ml. </li><li> Façouma mistura principal de células + meios de modo a que cada poço de uma placa de 96 poços conterá 35.000 células em 130 ul de meios de comunicação (por exemplo, para fazer uma mistura principal para 100 poços, ressuspender 3,5 milhões de células em 13 ml de meio). Modifique o número de células para caber projetos experimentais individuais e cronogramas. Para o tratamento de células ~ 18 horas após o plaqueamento, adicionar 35.000 células em cada poço de uma placa de 96 poços. </li><li> Usando uma pipeta de multi-canal, lentamente pipetar 130 ul de suspensão de células de mistura principal para cada poço de um fundo plano, de cultura de tecidos tratados com placa de 96 poços. Enquanto o plaqueamento, colocar a ponta da pipeta no centro do poço, não tocar no fundo da placa. NOTA: Embora o plaqueamento formato pode ser alterado, é recomendado fazer n = 4 para cada um dos poços de linhas de células de 1-3 por placa. O restante da placa (n = 84) é reservado para a linha celular # 4 (células de biossensor). </li><li> Permitir que as células se contentar deixando a placa em repouso durante 10 min à temperatura ambiente. Incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO 2, e &amp;# 8805; 80% de umidade relativa. </li></ol> 4. O tratamento de células NOTA: O dia seguinte, quando as células de biossensor de tau são 60-65% confluentes, preparar complexos de transdução de semente da seguinte forma: <ol><li> Num tubo, combinar o reagente de transfecção, tais como Lipofectamina, com meio de soro reduzido, como Opti-MEM para preparar uma mistura principal. Por bem, adicione 1,25 reagente de transfecção ul e 8,75 mL de mídia de soro reduzido. Flick tubo suavemente para misturar, brevemente girar para baixo, e incubar durante 5 min à TA. </li><li> Em um outro tubo, combinar material de semente (alíquota de lisado do passo 2.9) com meios de soro reduzido. NOTA: O volume do material de semente irá variar de acordo com a experiência individual. Ao escolher o volume de sementes, levar em consideração: abundância de sementes em uma amostra e toxicidade potencial. Homogenatos brutos pode ser tóxico para as células. Como tal, usar a menor quantidade possível de monitorar o efeito desejado. Anteriormente testados volumes de lisado / poço gama FRom pi 1-5, correspondendo a 5-20 ug de proteína total. Certifique-se que o volume total por poço (sementes + media de soro reduzido) é 10 jul. </li><li> Juntar o conteúdo dos dois tubos descritos em 4.1 e 4.2, súbito suavemente para misturar, brevemente girar para baixo (1.000 x g, 5 segundos), e incuba-se à temperatura ambiente durante pelo menos 20 minutos e até 2 horas. </li><li> Pipeta suavemente 20 ul de complexo de transdução no lado de poços individuais de biossensor. Use três repetições técnicos, se possível. Células tratadas e volta para a incubadora durante 24-48 hr. Incubar sob as mesmas condições tal como descrito no passo 3.6. NOTA: A condição de controle negativo apropriado para esta configuração é células de biossensor tratados com lipossomas vazios (ou seja, reagente lipossoma + media de soro reduzido) porque a aplicação de fosfolipídios introduz uma ligeira mudança no perfil de fluorescência em relação ao biossensor células não expostas ao reagente lipossoma. </li></ol> 5. As células de colheita para FRET Citometria de Fluxo <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; NOTA: Antes de colher células-geral 24-48 horas pós-tratamento é possível obter uma leitura preliminar de atividade semeadura usando o filtro GFP em um padrão invertido microscópio de fluorescência. As células tratadas sem material de semente (ou seja, lipossomas vazios) irá mostrar fluorescência difusa, enquanto que as células tratadas com material de semente irá mostrar pontuada intensa e inclusões intracelulares reticular (Figura 1A - B). <ol><li> Usando uma pipeta multi-canal, aspirar todo o meio celular (150 mL). Trypsinize (50 ul) as células durante 5 min, e diluiu-se com 150 ul de meio de cultura gelado. Não inclua uma lavagem com PBS antes da tripsinização neste passo, uma vez que pode provocar elevação de células e perda de células subsequente. Excluir todas as células mortas e detritos contaminantes durante a citometria de fluxo através de estratégias de propagação. </li><li> Imediatamente após têmpera, as células de transferência para uma placa de fundo bem rodada 96, e centrifugar a 1000 xg durante 5 min TA. </li><li> Aspirar e descartar meio, tomando cuidado para não perturbar o pellet celular. </li><li> Suavemente, mas completamente, ressuspender o sedimento celular em 50 ul de 2% de paraformaldeído, e incubar durante 10 min. Alternativamente, as células são executados ao vivo, embora a fixação fornece resultados mais limpas e mais consistentes. </li><li> Centrifugar a 1.000 células xg durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar e descartar paraformaldeído, tomando cuidado para não perturbar o pellet celular. </li><li> Suavemente, mas completamente, ressuspender o sedimento celular em 200 ul de tampão de citometria de fluxo gelada (HBSS, 1% de FBS, 1 mM de EDTA) e rodar a placa, o mais rapidamente possível para evitar a aglutinação de células. </li></ol> 6. FRET Citometria de Fluxo NOTA: Usar um citómetro de fluxo tal como o MACSQuant VYB, que está equipado com FRET compatível com linhas de laser e os conjuntos de filtros (Tabela 2). Para cada passo dentro desta seção, clique no bem de interesse usando o modelo de 96 poços do software e clique em&quot;Jogar&quot; para começar a captação de amostra e fluxo. Faça parcelas ou tabelas de estatísticas, clicando no ícone &#39;janela nova análise&#39;. Alterar parâmetros do eixo em lotes individuais bivariadas clicando no título em X ou eixo Y e selecionando o filtro apropriado. Para deslocar as populações de células ou de sinais de fluorescência, aumentar ou diminuir as tensões associadas com os filtros apropriados. Com este instrumento, execute &lt;1.000 eventos / seg para assegurar o acompanhamento de uma única célula precisa. <ol><li> Faça um Scatter-Side Area (SSC-A) vs Forward Scatter-Área (FSC-A) gráfico de duas variáveis, e com a linha celular # 1 em execução, ajustar as tensões e FSC SSC até que a população celular está no quadrante inferior esquerdo. Clique na ferramenta polígono, e definir a população de células (Portão P1). Para todos os parâmetros de propagação veja a Figura 2. </li><li> Faça uma FSC-H (altura) vs enredo FSC-A bivariada, e aplicar Portão P1 para este lote, clicando em &quot;ao vivo&quot; acima da trama, e selecionando P1. Com a linha celular # 1execução, clique na ferramenta polígono, e definir células individuais (Portão P2). </li><li> Faça 3 histograma, uma para cada um dos filtros de interesse: PCP, YFP, e FRET. Aplicar Portão P2 a todas estas parcelas, clicando em &quot;ao vivo&quot; acima das parcelas, e selecionando P2. Com a linha celular # 1 em funcionamento, ajustar tensões de tal modo que a população de células intermédias na PCP, YFP, FRET e histogramas são todos entre 0 e 1. Para medir PCP e de FRET, excitar células com o laser de 405 nm, e com uma captura de fluorescência 450/50 nm e 525/50 nm, filtro, respectivamente. Para medir YFP, excitam células com um laser de 488 nm e captura de fluorescência com um filtro 525/50 nm. As configurações de filtro de laser e são descritos mais adiante na Tabela 2. </li><li> Execute a compensação para PCP spillover para os canais FRET e YFP. NOTA: Compensação é o processo de correção de escape de fluorescência. O escape de fluorescência ocorre quando a emissão de fluorescência de um fluorocromo é detectada dentro de um filtro designed para medir sinal de outro fluorocromo. Com compensação apropriada, o transbordamento de fluorescência PCP pode ser removido a partir dos canais de FRET e YFP. NOTA: Compensação requer a presença de ambas as células -positivas e negativos de fluorescência. Assim, para compensar em células CFP-positiva (linha celular # 2), células negativas (linha celular # 1) devem ser adicionados à amostra antes da passagem. <ol><li> Pico de 30 ul de linha celular # 1 de suspensão de um único poço em 200 ul de linha celular # 2 suspensão imediatamente antes da compensação. </li><li> Clique no ícone &quot;Configurações do instrumento&quot;, depois no separador &quot;compensação&quot;, e verificar &quot;matriz&quot; para abrir a tabela de compensação. </li><li> Adicione uma FRET-A contra-PCP Um gráfico de duas variáveis, e aplicar porta P2, tal como descrito na etapa 6.3. Com linhas celulares 1 + 2 em execução, clique no ícone &quot;quadrante&quot; e desenhar quadrantes tal que os fluorescência -negativas e -positivas populações são separados pelos dois quadrantes inferiores (Portões LL3 umND LR3, respectivamente). </li><li> Criar uma tabela de estatísticas que mostra a intensidade mediana de fluorescência (MFI) de FRET para o LL3 e portões LR3. Ajustar o parâmetro de FRET na matriz de compensação até a MFI do sinal de FRET é equivalente entre LL3 e LR3. Após este passo, o MFI do sinal de FRET é igual entre as células não coradas e células PCP-positivas, sugerindo a ausência de PCP extravasamento para o canal de FRET. </li><li> Adicione uma YFP-A contra-PCP Um gráfico de duas variáveis, e aplicar porta P2, tal como descrito na etapa 6.3. Desenhe quadrantes (LL4 e LR4) semelhante ao que fez no passo 6.4.3. </li><li> Criar uma tabela de estatísticas que mostra o MFI de YFP para LL4 e LR4. Ajustar o parâmetro YFP na matriz de compensação até a MFI do sinal YFP é equivalente entre LL4 e LR4. Após este passo, o MFI de um sinal YFP é igual entre as células não coradas e células PCP-positivas, sugerindo a ausência de PCP extravasamento para o canal de YFP. </li></ol></li><li> Folldevido configuração do portão e compensação, realce poços de interesse e executar o restante do prato. </li><li> Depois de todas as amostras foram executados, arquivos de dados de exportação clicando em &#39;arquivo&#39;, então &#39;copiar&#39;. Selecione a guia &#39;arquivos de dados&#39;, realce a pasta experimento, e clique em &#39;copiar&#39;. </li></ol> Análise 7. Dados NOTA: Alterar parâmetros do eixo em lotes individuais bivariadas clicando no título em X ou eixo Y e selecionando o filtro apropriado. <ol><li> FCS arquivos abertos na citometria de fluxo programa de análise. </li><li> Com base nas propriedades de dispersão, utilizar uma porta poligonal para definir a população de células (vs SSC FSC) e população singuleto (FSC-H vs FSC-A) a partir de células tratadas com lipossomas vazios, de forma semelhante à que se descreveu na Secção 6. </li><li> Se foi realizada a compensação CFP durante a instalação, não se ajustam mais PCP. </li><li> Criar um traste vs YFP bivariada enredo. Usando linha celular # 3, Definir uma porta de FRET falsa pelo desenho de um portão poligonal que corre ao longo do declive da população de células positiva FRET. Este portão exclui YFP células individuais-positiva que emitem um sinal de FRET dentro do filtro, e é desenhado semelhante ao mostrado anteriormente, proibindo et al. 22 </li><li> Definir um portão FRET traçando células CFP / YFP tratados com lipossomas vazios em um FRET vs PCP bivariada enredo. Introduzir um portão poligonal ao longo da inclinação da população que se estende para cima e para a esquerda para longe da população. Esta porta deve excluir a maioria das células (~ 99%), de tal modo que o fundo FRET é ≥1% das células. Todos os eventos que mudam a este portão são considerados FRET-positivo. NOTA: cada uma das portas anteriormente descrito é aplicado a todas as amostras antes de construir portas posteriores. Após a análise, quatro portas individuais são definidos (população celular; singleto; falsa FRET; FRET). </li><li> Parâmetros de análise da ficha de interesse, incluindo: por cento FRET positividade e MFIcélulas de FRET-positiva. Calcular manualmente a densidade FRET integrado medindo o produto de por cento de positividade e MFI. NOTA: Se a densidade de FRET integrado é usado como uma medida do resultado, definido FRET fundo (tal como definido no passo 7.5) e a maior IMF do que ou igual a 1, a fim de evitar o cálculo de um produto que é menos do que os seus dois factores individuais. </li></ol>

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<li>Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Features+of+Tau+Fibrils+from+Alzheimer%27s+Disease+Brain+Are+Faithfully+Propagated+by+Unmodified+Recombinant+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer's Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein.</a> Biochemistry. , (2013).</li>
<li>Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+aggregation+assays+using+hyperphosphorylated+tau+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein.</a> J Vis Exp. (95), e51537(2015).</li>
</ol>

Este ensaio foi licenciado para a Janssen Pharmaceuticals.

A citometria de fluxo sistema FRET aqui descrito é uma ferramenta poderosa para a rápida e quantitativamente avaliar a atividade tau semeadura. Ela exige apenas a experiência de cultura celular moderada e um conhecimento prático de FRET e citometria de fluxo. Outros ensaios de semeadura, como Tioflavina T - que exibe fluorescência aumentada quando obrigado a estrutura de folha beta - são trabalhosos e requerem um substrato de proteína pura, recombinante. Além disso, os ensaios in vitro de semeadura para tau são...

A acumulação intracelular de tau amilóides define tauopatias, tais como a doença de Alzheimer. Nas fases iniciais da doença, patologia está geralmente localizada em regiões discretas do cérebro, mas com a progressão da doença, patologia invariavelmente se espalha ao longo de redes neuronais distintas 1-5. Evidências sugerem propagação transcelular de agregados de proteínas tóxicas subjacente a esta patologia (revisto em 10/06). Neste modelo, sementes proteopathic (por exemplo, tau) são libertados a partir de células do doador e entrar nas células vizinhas, transformando proteína tau nativo na forma mal dobrada através modelada alteração conformacional 11-15. O ensaio aqui descrito foi desenvolvido para detectar com sensibilidade tal actividade semeadura. É compatível com a proteína recombinante e amostras biológicas e permite a quantificação dos níveis de actividade de semeadura proteopathic 16 minutos. Células HEK 293T que expressam estavelmente tau d repetiçãoOMain (RD) contendo a mutação P301S associado à doença, quer fundido a PCP ou YFP (daqui em diante referido como células tau-RD-PCP / YFP) servir como um biossensor estável de actividade semeadura. Na ausência de sementes proteopathic, as células manter tau como um monómero solúvel em água, e não têm fundo apreciável de FRET. Absorção espontânea ou transdução mediada por lipossomas de sementes de tau para células, no entanto, resulta em RD-PCP e agregação RD-YFP, que produz um sinal de FRET, que é medida no interior das células individuais através de citometria de fluxo. Numerosos componentes deste ensaio foram modificadas para aumentar a sensibilidade e reduzir a variabilidade. Uma linha celular monoclonal com uma proporção de 1: expressão RD-PCP / YFP 1 foi seleccionado, uma vez que proporciona melhor sinal: ruído. Para aumentar a sensibilidade, fosfolípidos são usados ​​para introduzir sementes directamente em células (embora para estudar os mecanismos biológicos de captação, esta pode ser omitida). Finalmente, citometria de fluxo monitores FRET ao nível da população e uma única célula<html> nível, ao contrário de outros ensaios de agregação de proteínas. A medida do resultado final, a densidade de FRET integrado, é altamente quantitativa e contabilidade, tanto para o número de células com a agregação, e do grau de agregação que ocorreu dentro de cada célula. Todos estes parâmetros optimizados aumentar a sensibilidade e garantir a reprodutibilidade. Este sistema foi recentemente empregado em um estudo abrangente em camundongos transgênicos tauopathy P301S 17 que avaliou o aparecimento temporal e progressão da atividade sementeira tau em relação a outros marcadores patológicos de tau utilizada (por exemplo, MC1, AT8, PG5 e ThioflavinS). Sementeira actividade é, de longe, o marcador mais antigo e mais robusta de patologia tau avaliada, precedendo a detecção histológica por pelo menos 6 semanas. Atividade Sementeira aparece em 1.5 meses e aumenta progressivamente com a idade, sugerindo um papel causal de sementes proteopathic no início e / ou progressão da neurodegeneração 16. e_content &quot;&gt; quantificação precisa dos níveis de material de semente de amostras biológicas hora pode facilitar estudos que monitoram a progressão da doença mais cedo. Ao encurtar a duração julgamento e permitindo o uso de animais mais jovens, isto poderia aumentar a eficiência ea precisão de testes em animais pré-clínicos. Por exemplo, em a P301S rato previamente descrito, os compostos de chumbo pode ser entregue tão cedo quanto 4-6 semanas (imediatamente antes, ou no início da actividade sementeira), e monitorizados quanto à eficácia de 2-4 semanas mais tarde. O ensaio deve quantificar com precisão quaisquer reduções de semeadura actividade. FRET citometria de fluxo tem aplicações in vitro de rastreio bem. Por exemplo, reagentes anti-tau (por exemplo, anticorpos, moléculas pequenas, etc.) pode ser rapidamente testado para a sua capacidade para bloquear a indução sementeira directamente em cultura, utilizando quer a tau recombinante agregados ou lisados ​​derivado do cérebro como uma fonte de sementes (Figura 5). Com esta configuração, quando o material de semente é preparada, um experiment leva apenas três dias para ser concluída, incluindo a análise de dados. A rápida quantificação da actividade de semeadura proteopathic pode, assim, facilitar muitos estudos de neurodegeneração.

<table><tbody><tr><td>TBS</td><td>Sigma</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>Inibidores de Protease Completa (sem EDTA)</td><td>Frascos</td><td>criogênicos Roche 4693159001</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sarstedt</td><td>72.694.006</td><td></td></tr><tr><td>Balança Analítica</td><td>Mettler Toledo</td><td>XSE 105DU</td><td></td></tr><tr><td>Barcos de Pesagem</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-735-743</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de 15 ml</td><td>EUA Homogeneizador</td> Ultrassônico Omni Sonic Ruptor Científico <td>1475-0501</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Micro-Ponta <td></td></tr><tr><td>para Homogeneizador Ultrassônico</td><td>Omni International</td><td>OR-T-156</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451</td><td></td></tr><tr><td>Protetores de Ouvido com Cancelamento de Ruído</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-145-412</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47299</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 ml</td><td>USA Scientific</td><td><a href="http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-sterile.aspx">1615-5510</a></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.215</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 50 ml</td><td>Phenix Research</td><td>SS-PH15</td><td></td></tr><tr><td>Reservatórios de reagentes de 25 ml</td><td>VWR</td><td>41428-954</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta multicanal</td><td>Fisher Scientific</td><td>TI13-690-049</td><td></td></tr><tr><td>Placas de fundo plano de 96 poços</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>96 placas inferiores redondas boas</td><td>RT</td><td></td> 15710 das ciências da microscopia eletrônica do paraformaldeído de Corning 3788 <td></td></tr><tr><td>16%</td><td></td><td></td> PBS Sigma-Aldrich P5493 EDTA Sigma-Aldrich ED2SS HBSS <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 40 Centrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004509</td><td></td></tr><tr><td>BIOLiner Rotor de Balde Oscilante</td><td>Thermo Scientific</td><td>75003796</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitômetro</td><td>VWR</td><td>15170-172</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant VYB Cilindro de Fluxo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-116</td><td></td></tr><tr><td>Chill 96 Rack</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-459</td><td></td></tr><tr><td>Software de análise Flow Jo</td><td>Flow Jo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; l pontas de pipeta</td><td>Rainin</td><td>GPS-L10</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l pontas de pipeta</td><td>Rainin</td><td>GPS-250</td><td></td></tr><tr><td>1 ml pontas de pipeta</td><td>Rainin</td><td>GPS-1000</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l pipet tips</td><td>USA Scientific</td><td>1111-1800</td><td></td></tr><tr><td>pipeta sorológica de 5 ml</td><td>Phenix Research</td><td>SPG-606180</td><td></td></tr><tr><td>pipeta sorológica de 10 ml</td><td>Phenix Research</td><td>SPG-607180</td><td></td></tr><tr><td>pipeta sorológica de 25 ml</td><td>Phenix Research</td><td>SPG-760180</td><td></td></tr></tbody></table>

detecção sensível de proteopathic sementeira atividade com fret citometria de fluxo

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Evidências crescentes apóiam a propagação transcelular de agregados de proteínas tóxicas, ou sementes proteopáticas, como um mecanismo para o início e progressão da patologia em várias doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer e as tauopatias relacionadas. O papel potencialmente crítico das sementes de tau na progressão da doença apóia fortemente a necessidade de um ensaio sensível que detecte prontamente a atividade de semeadura em amostras biológicas. 
Ao combinar a especificidade da transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), a sensibilidade da citometria de fluxo e a estabilidade de uma linhagem celular monoclonal, um ensaio de semeadura ultrassensível foi projetado e é compatível com a detecção de sementes de amostras recombinantes ou biológicas, incluindo homogeneizados cerebrais humanos e de camundongos. O ensaio emprega células monoclonais HEK 293T que expressam de forma estável o domínio repetido (RD) propenso à agregação de tau que abriga a mutação P301S associada à doença fundida a CFP ou YFP, que produzem um sinal FRET na agregação de proteínas. A absorção de sementes proteopáticas de tau (mas não de outras proteínas) nas células biossensoras estimula a agregação de RD-CFP e RD-YFP, e a citometria de fluxo monitora sensível e quantitativamente esse FRET induzido por agregação. O ensaio detecta concentrações femtomolares (equivalente a monômero) de sementes de tau recombinantes, tem uma faixa dinâmica que abrange três ordens de magnitude e é compatível com homogeneizados cerebrais de camundongos transgênicos de tauopatia e indivíduos de tauopatia humana. Com pequenas modificações, o ensaio também pode detectar a atividade de semeadura de outras sementes proteopáticas, como a α-sinucleína, e também é compatível com culturas neuronais primárias. A facilidade, sensibilidade e ampla aplicabilidade da citometria de fluxo FRET tornam útil estudar uma ampla gama de distúrbios de agregação de proteínas.

FRET citometria de fluxo permite sensível, quantitativa e rápida detecção de atividade semeadura a partir de amostras recombinantes ou biológicas. Ensaio de configuração é fácil: As linhas celulares estáveis ​​que expressam monoclonais derivados de tau-RD-PCP / YFP são transduzidas com material de semente, incubou-se durante 24-48 h, e submeteu-se a análise de citometria de fluxo (Figura 1A). Na ausência de sementes, as células de biossensor manter tau numa forma solúvel, monomérica (Figura 1B)....

A transferência de célula para célula de agregados proteicos, ou sementes proteopáticas, pode estar subjacente à progressão da patologia em doenças neurodegenerativas. Aqui, é descrito um novo ensaio de citometria de fluxo FRET que permite a detecção específica e sensível da atividade de semeadura de amostras recombinantes ou biológicas.

Detecção sensível de Proteopathic Sementeira Atividade com FRET Citometria de Fluxo

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

O objetivo geral deste procedimento é detectar a atividade de sementação prionica proveniente de fontes recombinantes ou biológicas, permitindo a detecção sensível de proteínas, agregados e de uma amostra. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da neurodegeneração. Por exemplo, como podemos avaliar quantitativamente as alterações na atividade de sementação após intervenção terapêutica em modelos animais de doença?As vantagens desta técnica incluem sua alta especificidade em relação a baixos níveis de agregados proteicos. Sua especificidade refinada, facilidade de uso e alto rendimento. Hoje, demonstrarei este procedimento, juntamente com o coautor Brandon Holmes.Para preparar o material biológico semente, comece pesando o tecido cerebral congelado em um barquinho descartável. Em seguida, transfira o tecido para um tubo cônico e adicione tampão de homogeneização gelado, de modo que a solução final seja 10% em peso por volume, e transfira as amostras para uma câmara fria sobre gelo. A seguir, ajuste uma sonda para o indicador nas configurações apropriadas e enxágue as laterais e a base da sonda.Portanto, calibre o indicador três vezes conforme indicado, limpando a ponteira entre cada solução. Quando a ponteira estiver pronta, mergulhe a extremidade no tampão de homogeneização de uma amostra e inicie a sonicação, aplicando um total de 25 pulsos. Quando o tecido estiver completamente em suspensão, centrifugue o homogeneizado e transfira o sobrenadante para um tubo limpo.Tendo cuidado para não perturbar o palato. Embora diversas outras técnicas de homogeneização estejam disponíveis, a prova é superior para isolar pequenas quantidades de sementes protio páticas de espécimes biológicos. A dissociação mecânica permite a quebra consistente e eficiente do tecido e a subsequente extração das sementes.Em seguida, alíquotar o sobrenadante e armazenar os lisados a 80 graus negativos Celsius. Para repassar as células biosensoras em condições estéreis, lavar cada linhagem celular com PBS morno, seguido por uma incubação de três minutos com tripsina EDTA. Quando as células tiverem se destacado, interromper a reação com meio de cultura morno e transferir imediatamente as células para um tubo cônico.Centrifugue as células ressus, suspendendo o precipitado em meio fresco. Em seguida, conte as células e prepare uma diluição mestra de células com 3.500.000 células por 13 mililitros de meio. Usando uma pipeta multicanal, transfira lentamente 130 microlitros das células para cada poço de uma placa de cultura de tecidos de fundo plano com 96 poços, tomando cuidado para posicionar as ponteiras no centro dos poços sem tocar o fundo da placa.Uma vez que as células tenham sido semeadas, deixe-as assentar sem perturbação por 10 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e umidade relativa maior ou igual a 80%. No dia seguinte, quando as células biossensoras atingirem de 60 a 65% de confluência, combine o meio com soro reduzido, o reagente lipossomal e a fonte biológica de sementes para produzir complexos de transdução. Em seguida, adicione cuidadosamente 20 microlitros do complexo de transdução pela parede lateral de cada poço individual do biossensor e retorne as células tratadas ao incubador por mais 24 a 48 horas antes da colheita.Células não tratadas mostrarão apenas fluorescência difusa. No entanto, células tratadas com material semente de tau mostrarão agregados brilhantes. Após um a dois dias de cultivo, remova as células substituindo o meio de cultura por 50 microlitros de triptina EDTA, interrompendo assim a reação. Após cinco minutos, adicione 150 microlitros de meio de cultura gelado, transfira imediatamente as células para uma placa de fundo redondo com 96 poços e centrifugue para obter o pellet celular. Aspire os sobrenadantes sem perturbar os pellets e, em seguida, ressuspenda suavemente, mas completamente, as células em 50 microlitros de 2% de paraformaldeído por 10 minutos.Em seguida, centrifugue novamente as células e ressuspenda os pellets em 200 microlitros de tampão de citometria de fluxo gelado o mais rapidamente possível. Após a fixação, coloque a placa em um citômetro de fluxo compatível com fret e gere um gráfico de área de dispersão lateral versus área de dispersão frontal por variante. A seguir, com a linhagem celular um em funcionamento, ajuste as tensões de dispersão lateral e dispersão frontal até que a população celular esteja no quadrante inferior esquerdo.Em seguida, utilizando a ferramenta de polígono, defina a população celular como gate P1. Agora, crie um gráfico de dispersão frente altura versus área de dispersão frente por variante e aplique o gate P1. Em seguida, defina as células individuais como gate P2 e gere um histograma para cada uma.Para os filtros C-F-P-Y-F-P e fret, aplique o gate P a dois ou três histogramas diferentes, um para cada filtro C-F-P-Y-F-P e fret, para compensação. Adicione 30 microlitros da suspensão da linhagem celular um a 200 microlitros da suspensão da linhagem celular dois. Em seguida, clique no ícone de configurações do instrumento, depois na guia de compensação e verifique a matriz para abrir a tabela de compensação.Gere um gráfico de área de fret versus área de CFP por meio de um gráfico de variados e aplique o gate P dois. Em seguida, com a linhagem celular um e a linhagem celular dois em execução, clique no ícone de quadrante e desenhe quadrantes de forma que as populações fluorescentes negativas e positivas sejam separadas pelos dois quadrantes inferiores. Agora, crie uma tabela de estatísticas que exiba a intensidade mediana de fluorescência ou MFI de fret para os gates LL três e LR três e ajuste o parâmetro de fret na matriz de compensação até que a MFI do sinal de fret seja aproximadamente igual entre LL três e LR três.Em seguida, crie um gráfico de dispersão de área YFP versus área CFP com quadrantes. Ajuste o parâmetro YFP na matriz de compensação até que a MFI do sinal YFP seja aproximadamente igual entre os quadrantes. Semelhante ao mostrado anteriormente para citometria de fluxo FRET.O extravasamento fluorescente primário ocorre da CFP emitida no canal de detecção de fret, o qual pode ser corrigido por meio da compensação de fluorescência utilizando células de controle positivo de cor única. Após todos os gates terem sido definidos e o sinal de CFP ter sido compensado, destaque as poças de interesse e execute o restante da placa para analisar os dados. Primeiro, defina as células e células únicas utilizando os mesmos parâmetros usados para configurar a análise de fluxo.Em seguida, utilizando a linhagem celular três, plote as células simplesmente positivas para YFP em um gráfico de fret versus YFP por variante. Desenhe um portão poligonal ao longo e afastado da inclinação da população de células positivas para fret, definindo um portão falso de fret, que exclui a extravasão de YFP para o filtro de fret. Após aplicar o portão falso de fret a todas as amostras, plote as células C-F-P-Y-F-P tratadas com lipossomos vazios em um gráfico de fret versus CFP por variante e introduza um portão poligonal ao longo da inclinação da população, estendendo-se para cima e para a esquerda, afastando-se da população.Considera-se que quaisquer eventos que entrem nesta porta são positivos para fret e a porcentagem de células correlacionará com a titulação da semente utilizada durante o tratamento. Por fim, registre os parâmetros de análise de interesse, incluindo a porcentagem de positividade para fret e a intensidade mediana de fluorescência das células positivas para fret. Em seguida, meça o produto da porcentagem de positividade e da MFI para calcular manualmente a densidade integrada de fret.Na ausência de agregados ou sementes de tau, a proteína tau é mantida em um estado monomérico solúvel, conforme representado por um sinal fluorescente difuso e negativo para FRET consistente. Após a introdução de sementes de tau nas células biosensoras, a tau endógena é convertida em um estado agregado e positivo para FRET, permitindo a quantificação por FRET. A análise por citometria de fluxo confirma que concentrações no intervalo de femtomolar de tau recombinante são suficientes para detecção. Aqui.Tecido do tronco encefálico de camundongos com tauopatia sacrificados em diferentes idades serve como uma região cerebral representativa, demonstrando detecção consistente de atividade de nucleação nos animais já aos 1,5 meses de idade. Neste experimento, o homogeneizado cerebral de indivíduos com doença de Alzheimer exibiu atividade de nucleação robusta, enquanto indivíduos controle pareados por idade e com doença de Huntington não demonstraram especificidade do ensaio para agregados de tau. Culturas primárias de neurônios não tratados transduzidos com construtos lentivirais de tau, CFP e tau, YFP exibiram sinal fluorescente difuso após tratamento com sementes recombinantes de tau.No entanto, a proteína tau endógena forma grandes agregados detectáveis por citometria de fluxo com transferência de ressonância de energia de fluorescência, mesmo na ausência de transdução mediada por lipossomos. Quando as fontes de sementes são pré-incubadas com fármacos que inibem a captação de tau, como heparina, e tratadas na ausência de lipossomos, a atividade de sementação presente tanto em amostras recombinantes de fis quanto em amostras de cérebro de camundongos com tauopatia pode ser bloqueada. Uma vez dominado.Essa técnica pode ser concluída em três dias, com apenas uma a duas horas de trabalho na bancada por dia. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que será necessária uma otimização interna para certas etapas. Por exemplo, ao determinar os títulos eficazes de sementes protio páticas provenientes de diversas fontes biológicas.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar, executar e analisar experimentos de citometria de fluxo com fret para detectar atividade de semeadura protio-pática a partir de fontes recombinantes e biológicas.

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Detecção sensível de Proteopathic Sementeira Atividade com FRET Citometria de Fluxo

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