Detecção sensível de Proteopathic Sementeira Atividade com FRET Citometria de Fluxo

O objetivo geral deste procedimento é detectar a atividade de semeadura protio pática de fontes recombinantes ou biológicas, permitindo a detecção sensível de proteínas, agregados e uma amostra. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurodegeneração. Por exemplo, como podemos avaliar quantitativamente as mudanças na atividade de semeadura após intervenção terapêutica em modelos animais de doenças?

As vantagens desta técnica incluem sua alta especificidade para baixos níveis de agregados proteicos. Sua especificidade requintada, sua facilidade de uso e seu alto rendimento. Demonstrando este procedimento hoje serei eu, junto com o co-autor Brandon Holmes.

Para preparar o material biológico da semente, comece pesando o tecido cerebral congelado em um barco de soro de leite descartável. Em seguida, transfira o tecido para um tubo cônico, adicione tampão de homogeneização gelado, de modo que a solução final seja de 10% para esperar o volume e transferir as amostras para uma câmara fria no gelo. Em seguida, ajuste uma sonda para que o indicador para as configurações apropriadas e enxágue ao lado e na parte inferior da sonda.

Portanto, o indicador inclina três vezes conforme indicado, limpando a sonda entre cada solução. Quando a sonda estiver pronta, mergulhe a ponta no tampão de homogeneização de uma amostra e inicie o sonicado fornecendo 25 pulsos no total. Quando o tecido estiver completamente em suspensão, gire o homogeneizado e transfira o supinato para um tubo limpo.

Tomando cuidado para não perturbar o paladar. Embora várias outras técnicas de homogeneização estejam disponíveis, a liberdade condicional é superior para isolar pequenas quantidades de sementes protio páticas de espécimes biológicos. A dissociação mecânica permite a quebra consistente e eficiente do tecido e a subsequente extração de sementes.

Em seguida, alíquota do supino e armazene os lisados a 80 graus Celsius negativos. Para reproduzir as células do biossensor em condições estéreis, enxágue cada linha celular com PBS quente seguido de uma incubação de três minutos com tripsina EDTA. Quando as células se soltarem, interrompa a reação com meio de cultura quente e transfira imediatamente as células para um tubo cônico.

Centrifugar as células resus, suspendendo o pellet em meio fresco. Em seguida, conte as células e faça uma diluição de células master mix de 3.500.000 células por 13 mililitros de meio. Usando uma pipeta multicanal, transfira lentamente 130 microlitros das células para cada poço de uma placa de 96 poços tratada com cultura de tecidos de fundo plano, tendo o cuidado de colocar as pontas da pipeta no centro dos poços sem tocar no fundo da placa.

Uma vez que as células tenham sido plaqueadas, deixe-as assentar sem serem perturbadas por 10 minutos em temperatura ambiente e, em seguida, incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e maior ou igual a 80% de umidade relativa. No dia seguinte, quando as células biossensoras estiverem 60 a 65% confluentes, combine o reagente lipossomal do meio sérico reduzido e a fonte biológica da semente para fazer complexos de transdução. Em seguida, pipete 20 microlitros de complexo de transdução na lateral de cada biossensor individual e retorne as células tratadas à incubadora por mais 24 a 48 horas antes da colheita.

As células não tratadas mostrarão apenas fluorescência difusa. No entanto, as células tratadas com material de semente de tau apresentarão agregados brilhantes Após um a dois dias para colher as células, substitua o meio de cultura celular por 50 microlitros de tentina EDTA, interrompendo a reação. Após cinco minutos com 150 microlitros de cultura resfriada, médio, transfira imediatamente as células para uma placa inferior redonda de 96 poços e coloque as células em pellets, aspire os sobrenadantes S sem perturbar os pellets e, em seguida, sussus, suavemente, mas completamente, suspenda as células em 50 microlitros de 2% de paraldeído por 10 minutos.

Em seguida, gire as células novamente e ressuspenda os pellets em 200 microlitros de tampão de citometria de fluxo resfriado o mais rápido possível. Após a fixação, carregar a placa num citómetro de fluxo compatível com trastes e gerar uma área de dispersão lateral versus área de dispersão direta por gráfico variante. Em seguida, com a linha celular um em execução, ajuste as tensões de dispersão lateral e direta até que a população de células esteja no quadrante inferior esquerdo.

Em seguida, usando a ferramenta polígono, defina a população de células como marcha P um. Agora faça uma altura de dispersão para frente versus área de dispersão para frente por gráfico de variantes e aplique a porta P um. Em seguida, defina as células individuais como marcha P dois e gere um histograma cada.

Para os filtros C-F-P-Y-F-P e traste, aplique a porta P dois a três histogramas diferentes, um para cada um dos filtros C-F-P-Y-F-P e outro para compensação. Pico em 30 microlitros da suspensão da linha celular um em 200 microlitros da linha celular duas suspensão. Em seguida, clique no ícone de configurações do instrumento seguido da guia de compensação e marque a matriz para abrir a tabela de compensação.

Gere uma área de traste versus área CFP por gráfico variável e aplique a porta P dois. Em seguida, com a linha celular um e a linha celular dois em execução, clique no ícone do quadrante e desenhe os quadrantes como as populações fluorescentes negativa e positiva são separadas pelos dois quadrantes inferiores. Agora crie uma tabela de estatísticas que exiba a intensidade média de fluorescência ou MFI do traste para as portas LL três e LR três e ajuste o parâmetro do traste na matriz de compensação até que o MFI do sinal do traste seja aproximadamente igual entre LL três e LR três.

Em seguida, faça uma área YFP versus área CFP por gráfico variável com quadrantes. Ajuste o parâmetro YFP na matriz de compensação até que o MFI do sinal YFP seja aproximadamente igual entre os quadrantes. Semelhante ao mostrado anteriormente Para citometria de fluxo de traste.

O transbordamento fluorescente primário ocorre a partir do CFP emitido no canal de detecção de trastes, que pode ser corrigido por meio de compensação de fluorescência usando as células de controle positivo de cor única Quando todas as portas foram definidas e o sinal CFP foi compensado. Destaque os poços de interesse e execute o restante da placa para analisar os dados. Primeiro, defina as células e células individuais usando os mesmos parâmetros que estamos configurando a análise de fluxo.

Em seguida, usando a linha celular três, plote as células positivas únicas YFP em um traste versus YFP por gráfico variante. Desenhe uma porta poligonal ao longo e longe da inclinação da população de células positivas para definir uma marcha de traste falso, que exclui o transbordamento de YFP para o filtro de traste. Depois de aplicar a marcha de falso traste a todas as amostras, plote as células CFP tratadas com lipossomas vazios em um traste versus CFP por gráfico variável e introduza um ga poligonal ao longo da inclinação da população que se estende para cima e para a esquerda longe da população.

Quaisquer eventos que se desloquem para esta porta são considerados positivos para o traste e a porcentagem de células se correlacionará com o título de sementes usado durante o tratamento. Finalmente, registre os parâmetros de análise de interesse, incluindo a porcentagem de positividade do traste e a intensidade média de fluorescência das células positivas do traste. Em seguida, meça o produto da porcentagem de positividade e MFI para calcular manualmente a densidade de trastes integrados.

Na ausência de agregados ou sementes de tau, a tau é mantida em um estado monomérico solúvel, representado por um sinal fluorescente difuso e negativo de traste consistente. Após a introdução de sementes de tau nas células biossensoras, a tau endógena é convertida em uma quantificação agregada e de estado positivo de traste. A análise de citometria de fluxo após a análise confirma que as concentrações femtomolares de tau recombinante são suficientes para a detecção. Aqui.

O tecido do tronco cerebral de camundongos tauopatia sacrificados em diferentes idades serve como uma região representativa do cérebro, demonstrando uma detecção consistente da atividade de semeadura nos animais já aos 1,5 meses de idade. Neste experimento, o cérebro homogêneo de indivíduos com doença de Alzheimer exibiu atividade de semeadura robusta, enquanto o controle pareado por idade e os indivíduos com doença de Huntington não demonstraram a especificidade do ensaio para agregados de tau culturas neuronais primárias não tratadas transduzidas com tau, CFP e tau. As construções lentivirais YFP exibiram sinal fluorescente difuso após o tratamento com sementes de tau recombinante.

No entanto, a tau endógena forma grandes agregados detectáveis por citometria de fluxo de fret, mesmo na ausência de transdução mediada por lipossomas. Quando as fontes de sementes são pré-incubadas com drogas que inibem a absorção de tau, como a heparina, e são tratadas na ausência de lipossomas, a atividade de semeadura contida nas amostras de cérebro de camundongos recombinantes e tauopatia pode ser bloqueada. Uma vez dominado.

Esta técnica pode ser concluída em três dias, com cada dia apenas uma a duas horas de trabalho de bancada. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a otimização interna será necessária para determinadas etapas. Por exemplo, ao determinar títulos efetivos de sementes protio páticas de várias fontes biológicas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como configurar, executar e analisar experimentos de citometria de fluxo de traste com o objetivo de detectar a atividade de semeadura protio pática de fontes recombinantes e biológicas.