Detecção sensível de Proteopathic Sementeira Atividade com FRET Citometria de Fluxo

O objetivo geral deste procedimento é detectar a atividade de sementação prionica proveniente de fontes recombinantes ou biológicas, permitindo a detecção sensível de proteínas, agregados e de uma amostra. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da neurodegeneração. Por exemplo, como podemos avaliar quantitativamente as alterações na atividade de sementação após intervenção terapêutica em modelos animais de doença?

As vantagens desta técnica incluem sua alta especificidade em relação a baixos níveis de agregados proteicos. Sua especificidade refinada, facilidade de uso e alto rendimento. Hoje, demonstrarei este procedimento, juntamente com o coautor Brandon Holmes.

Para preparar o material biológico semente, comece pesando o tecido cerebral congelado em um barquinho descartável. Em seguida, transfira o tecido para um tubo cônico e adicione tampão de homogeneização gelado, de modo que a solução final seja 10% em peso por volume, e transfira as amostras para uma câmara fria sobre gelo. A seguir, ajuste uma sonda para o indicador nas configurações apropriadas e enxágue as laterais e a base da sonda.

Portanto, calibre o indicador três vezes conforme indicado, limpando a ponteira entre cada solução. Quando a ponteira estiver pronta, mergulhe a extremidade no tampão de homogeneização de uma amostra e inicie a sonicação, aplicando um total de 25 pulsos. Quando o tecido estiver completamente em suspensão, centrifugue o homogeneizado e transfira o sobrenadante para um tubo limpo.

Tendo cuidado para não perturbar o palato. Embora diversas outras técnicas de homogeneização estejam disponíveis, a prova é superior para isolar pequenas quantidades de sementes protio páticas de espécimes biológicos. A dissociação mecânica permite a quebra consistente e eficiente do tecido e a subsequente extração das sementes.

Em seguida, alíquotar o sobrenadante e armazenar os lisados a 80 graus negativos Celsius. Para repassar as células biosensoras em condições estéreis, lavar cada linhagem celular com PBS morno, seguido por uma incubação de três minutos com tripsina EDTA. Quando as células tiverem se destacado, interromper a reação com meio de cultura morno e transferir imediatamente as células para um tubo cônico.

Centrifugue as células ressus, suspendendo o precipitado em meio fresco. Em seguida, conte as células e prepare uma diluição mestra de células com 3.500.000 células por 13 mililitros de meio. Usando uma pipeta multicanal, transfira lentamente 130 microlitros das células para cada poço de uma placa de cultura de tecidos de fundo plano com 96 poços, tomando cuidado para posicionar as ponteiras no centro dos poços sem tocar o fundo da placa.

Uma vez que as células tenham sido semeadas, deixe-as assentar sem perturbação por 10 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e umidade relativa maior ou igual a 80%. No dia seguinte, quando as células biossensoras atingirem de 60 a 65% de confluência, combine o meio com soro reduzido, o reagente lipossomal e a fonte biológica de sementes para produzir complexos de transdução. Em seguida, adicione cuidadosamente 20 microlitros do complexo de transdução pela parede lateral de cada poço individual do biossensor e retorne as células tratadas ao incubador por mais 24 a 48 horas antes da colheita.

Células não tratadas mostrarão apenas fluorescência difusa. No entanto, células tratadas com material semente de tau mostrarão agregados brilhantes. Após um a dois dias de cultivo, remova as células substituindo o meio de cultura por 50 microlitros de triptina EDTA, interrompendo assim a reação. Após cinco minutos, adicione 150 microlitros de meio de cultura gelado, transfira imediatamente as células para uma placa de fundo redondo com 96 poços e centrifugue para obter o pellet celular. Aspire os sobrenadantes sem perturbar os pellets e, em seguida, ressuspenda suavemente, mas completamente, as células em 50 microlitros de 2% de paraformaldeído por 10 minutos.

Em seguida, centrifugue novamente as células e ressuspenda os pellets em 200 microlitros de tampão de citometria de fluxo gelado o mais rapidamente possível. Após a fixação, coloque a placa em um citômetro de fluxo compatível com fret e gere um gráfico de área de dispersão lateral versus área de dispersão frontal por variante. A seguir, com a linhagem celular um em funcionamento, ajuste as tensões de dispersão lateral e dispersão frontal até que a população celular esteja no quadrante inferior esquerdo.

Em seguida, utilizando a ferramenta de polígono, defina a população celular como gate P1. Agora, crie um gráfico de dispersão frente altura versus área de dispersão frente por variante e aplique o gate P1. Em seguida, defina as células individuais como gate P2 e gere um histograma para cada uma.

Para os filtros C-F-P-Y-F-P e fret, aplique o gate P a dois ou três histogramas diferentes, um para cada filtro C-F-P-Y-F-P e fret, para compensação. Adicione 30 microlitros da suspensão da linhagem celular um a 200 microlitros da suspensão da linhagem celular dois. Em seguida, clique no ícone de configurações do instrumento, depois na guia de compensação e verifique a matriz para abrir a tabela de compensação.

Gere um gráfico de área de fret versus área de CFP por meio de um gráfico de variados e aplique o gate P dois. Em seguida, com a linhagem celular um e a linhagem celular dois em execução, clique no ícone de quadrante e desenhe quadrantes de forma que as populações fluorescentes negativas e positivas sejam separadas pelos dois quadrantes inferiores. Agora, crie uma tabela de estatísticas que exiba a intensidade mediana de fluorescência ou MFI de fret para os gates LL três e LR três e ajuste o parâmetro de fret na matriz de compensação até que a MFI do sinal de fret seja aproximadamente igual entre LL três e LR três.

Em seguida, crie um gráfico de dispersão de área YFP versus área CFP com quadrantes. Ajuste o parâmetro YFP na matriz de compensação até que a MFI do sinal YFP seja aproximadamente igual entre os quadrantes. Semelhante ao mostrado anteriormente para citometria de fluxo FRET.

O extravasamento fluorescente primário ocorre da CFP emitida no canal de detecção de fret, o qual pode ser corrigido por meio da compensação de fluorescência utilizando células de controle positivo de cor única. Após todos os gates terem sido definidos e o sinal de CFP ter sido compensado, destaque as poças de interesse e execute o restante da placa para analisar os dados. Primeiro, defina as células e células únicas utilizando os mesmos parâmetros usados para configurar a análise de fluxo.

Em seguida, utilizando a linhagem celular três, plote as células simplesmente positivas para YFP em um gráfico de fret versus YFP por variante. Desenhe um portão poligonal ao longo e afastado da inclinação da população de células positivas para fret, definindo um portão falso de fret, que exclui a extravasão de YFP para o filtro de fret. Após aplicar o portão falso de fret a todas as amostras, plote as células C-F-P-Y-F-P tratadas com lipossomos vazios em um gráfico de fret versus CFP por variante e introduza um portão poligonal ao longo da inclinação da população, estendendo-se para cima e para a esquerda, afastando-se da população.

Considera-se que quaisquer eventos que entrem nesta porta são positivos para fret e a porcentagem de células correlacionará com a titulação da semente utilizada durante o tratamento. Por fim, registre os parâmetros de análise de interesse, incluindo a porcentagem de positividade para fret e a intensidade mediana de fluorescência das células positivas para fret. Em seguida, meça o produto da porcentagem de positividade e da MFI para calcular manualmente a densidade integrada de fret.

Na ausência de agregados ou sementes de tau, a proteína tau é mantida em um estado monomérico solúvel, conforme representado por um sinal fluorescente difuso e negativo para FRET consistente. Após a introdução de sementes de tau nas células biosensoras, a tau endógena é convertida em um estado agregado e positivo para FRET, permitindo a quantificação por FRET. A análise por citometria de fluxo confirma que concentrações no intervalo de femtomolar de tau recombinante são suficientes para detecção. Aqui.

Tecido do tronco encefálico de camundongos com tauopatia sacrificados em diferentes idades serve como uma região cerebral representativa, demonstrando detecção consistente de atividade de nucleação nos animais já aos 1,5 meses de idade. Neste experimento, o homogeneizado cerebral de indivíduos com doença de Alzheimer exibiu atividade de nucleação robusta, enquanto indivíduos controle pareados por idade e com doença de Huntington não demonstraram especificidade do ensaio para agregados de tau. Culturas primárias de neurônios não tratados transduzidos com construtos lentivirais de tau, CFP e tau, YFP exibiram sinal fluorescente difuso após tratamento com sementes recombinantes de tau.

No entanto, a proteína tau endógena forma grandes agregados detectáveis por citometria de fluxo com transferência de ressonância de energia de fluorescência, mesmo na ausência de transdução mediada por lipossomos. Quando as fontes de sementes são pré-incubadas com fármacos que inibem a captação de tau, como heparina, e tratadas na ausência de lipossomos, a atividade de sementação presente tanto em amostras recombinantes de fis quanto em amostras de cérebro de camundongos com tauopatia pode ser bloqueada. Uma vez dominado.

Essa técnica pode ser concluída em três dias, com apenas uma a duas horas de trabalho na bancada por dia. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que será necessária uma otimização interna para certas etapas. Por exemplo, ao determinar os títulos eficazes de sementes protio páticas provenientes de diversas fontes biológicas.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar, executar e analisar experimentos de citometria de fluxo com fret para detectar atividade de semeadura protio-pática a partir de fontes recombinantes e biológicas.