Um Protocolo para Imunohistoquímica e Distribuição In-situ de RNA dentro do Embrião Drosophila Precoce

Como um organismo com um curto período gestacional, os embriões de Drosophila melanogaster são temas de estudo privilegiados para investigar a distribuição e localização de proteínas e seus reguladores durante o desenvolvimento. No entanto, devido aos seus embriões ricos em lipídios e corão rica em quitina, sua utilidade é limitada pela dificuldade de montar embriões em superfícies de vidro. Neste trabalho, introduzimos um método prático que aumenta significativamente a fixação do embrião de Drosophila em slides e detalha nossos métodos para histoquímica bem sucedida, imunohistoquímica e hibridização in situ.

Antes dos passos aqui mostrados, os slides devem ser lavados com detergente, depois enxaguados em água da torneira e água destilada antes de serem colocados no forno para secar. As lâminas secas devem absorver suavemente o dicromato de potássio por 24 horas antes de serem enxaguados e secos novamente, depois colocados em 95% de etanol por pelo menos duas horas. Durante esta etapa, você pode preparar mais slides ou a gelatina cromada de acordo com nossos métodos.

A gelatina pode então ser armazenada em água de banho de 60 graus antes de ser usada. Para revestir slides, deixe cair uma pequena quantidade de gelatina em uma borda do slide. Em seguida, use outro slide de vidro para arrastar lentamente e uniformemente a gelatina através da superfície do slide para ser revestida.

Isso cria uma camada fina e uniforme. Antes de ser colocado em um rack ou aparato de secagem para ser armazenado em um forno para permitir a secagem completa por mais uma noite ou 48 horas. O embrião é coletado usando uma placa de ágar de suco de uva, uma vez pronto, o prato de ágar de suco de uva pode então ser removido.

Inunde a placa com PBS e escove delicadamente com uma escova macia para remover quaisquer embriões ligados. Remova o embrião contendo PBS a um tubo centrífugas de 1,5 mililitros e deixe descansar no gelo. Uma vez que o embrião seja instalado no gelo, remova suavemente o PBS sobrenatante.

Tenha cuidado para não perturbar o embrião na parte inferior do tubo. Adicione 1 mL de alvejante de 50% à amostra e agite delicadamente por dois minutos. Remova o alvejante por filtragem e lave embriões em PBS três vezes.

Prepare-se n-heptane. Uma vez pronto, lave os embriões do papel do filtro em n-heptane, agitando o papel do filtro suavemente na solução. Permita que os embriões se instalem na parte inferior da placa de n-heptano e colete este n-heptano em um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.

Adicione um mililitro de metanol ao tubo, deixe a solução precipitar e, em seguida, aspirar o metanol de n-heptano. Lave o embrião em PBS três a cinco vezes para remover o metanol residual. Remova este PBS extra e adicione o fixador de Bouin e deixe se contentar por 30 a 60 minutos para corrigir os embriões.

Remova o fixador de Bouin e lave os embriões novamente na PBS três vezes. Prepare 1,2% de agarose na PBS e mantenha aquecido em um banho de água de 60 graus e prepare os embriões para incorporar, aspirando suavemente pbs extras em que foi armazenado. Cuidado para não perturbar os embriões na parte inferior e, em seguida, aspirar o plugue de embrião na parte inferior da solução e colocar suavemente em um molde de tampa de garrafa.

Aspire qualquer PBS adicional deste molde antes de adicionar gel de 1,2% agarose. Prepare uma solução de PBS para armazenar esses plugues de ágarose. Uma vez que a agarose tenha se solidificado, os plugues individuais podem então ser movidos para este PBS para armazenamento.

Aqui estamos mostrando o processo de desidratação sequencial. Permitindo 15 minutos para incubação cada vez. Em seguida, retire do etanol 100% e fixe em uma solução um-para-um de etanol e xileno por mais 15 minutos.

Uma vez removido desta solução um-para-um, remova em xileno puro por um minuto. Agora a amostra de tecido está pronta para ser movida para uma solução de parafina de xileno aquecida. Deixe descansar por 30 minutos antes da incorporação final em 100% de parafina.

Mova-se para a primeira de 100% de parafina e descanse por duas horas. Repita este processo em suas duas e três parafinas. A amostra está agora pronta para ser movida para um molde e o molde cheio de cera para completar o processo de incorporação.

Incorporação de embriões de Drosophila. Coloque seções de parafina preparadas de embriões de Drosophila em forno de 60 graus por 15 minutos. Coloque-os em uma solução 100% de xileno.

Então começamos a reidratação. Coloque os slides em cada uma dessas soluções por três minutos cada. Uma vez que o slide esteja em água destilada, coloque na solução de hematoxilina por dois minutos.

Uma vez concluído certifique-se de drenar o máximo possível da solução do slide. Uma vez que o slide tenha sido lavado em água destilada, então manche o escorregador em eosin por um minuto. Por fim, remova o slide da eosina e lave em água destilada.

Uma vez que este slide está limpo, agora começamos nosso processo de desidratação final. Finalmente sendo colocado em 100% xileno por cinco minutos. Este processo se repete em duas novas soluções de 100% xileno e solta uma pequena quantidade de goma neutra ao longo de uma borda do slide.

Pegue este deslizamento de cobertura e posicione delicadamente em uma borda do slide. Primeiro desparafinar os slides colocando em 100% xileno. Uma vez que os slides são removidos da água destilada, eles devem ser cobertos com solução de ácido 1%periódica.

Em seguida, descartamos o excesso de solução e enxaguamos em água destilada. Colocando o slide diretamente em uma solução pré-aquecido. Uma vez que isso esteja completo, enxágüemos o escorregador em água destilada e, em seguida, matize a solução com cloreto de ouro de 0,2% por um a dois minutos.

Em seguida, fixamos o tecido com 3% de sulfato de tio de sódio por três minutos usando água destilada. E, em seguida, contra-mancha com hematoxilina. Após a contra-mancha, a mancha pode ser lavada com qualquer tubo de água destilada, como mostrado aqui.

Então passamos para o processo de desidratação. Siga isso colocando os slides diretamente em 100% de xileno e, em seguida, aplique uma pequena quantidade de goma neutra no canto do slide. Cubra delicadamente com um deslizamento de cobertura.

Comece a preparar os slides como anteriormente, desparafinando e xileno. E depois em um-para-um etanol de xileno. Uma vez que os slides são desparafinados, começamos a reidratar seu tecido e, finalmente, na PBS.

Coloque os slides em peróxido de hidrogênio de 0,3% feito em metanol por 10 minutos. Em seguida, os slides são cobertos com 20 mLs de solução de recuperação de destino. Os slides podem então ser colocados na caixa de coloração.

Coloque a caixa do stainer em um vapor, garantindo que nenhuma solução escape e os slides ainda estejam totalmente cobertos. Observe que a tampa da caixa de manchas não deve ser totalmente fechada para que o vapor de água possa escapar durante o processo de vapor. E, em seguida, suavemente enxaguando em PBS-T três vezes.

Descarte a solução em excesso e repita o processo, desta vez com PBS. Em seguida, incubamos os slides em um bloco de peróxido por cinco a 10 minutos e, em seguida, enxaguar várias vezes novamente no PBS-T e, em seguida, em PBS. Prepare o anticorpo e caia diretamente no tecido.

Esses tecidos podem então ser incubados ou em temperatura ambiente por quatro horas. O anticorpo secundário deve ser incubado à temperatura ambiente por 90 minutos, que é a coloração com 5%DAB por dois a 10 minutos. Depois que a cor apropriada for obtida, enxágue em água destilada e, em seguida, contra-mancha na hematoxilina.

Após esta mancha de hematoxilina, os slides podem então ser sequencialmente desidratados. Coloque os slides em 100% de xileno e deixe de molho por três minutos. Em seguida, solte pequenas quantidades de goma neutra em uma borda do slide.

Uma vez colocado um chiclete, pegue a tampa do slide e coloque delicadamente de uma borda do slide. Adicione um micrograma de DNA de modelo linearizado purificado a um frasco de reação livre de RNase estéril. Em seguida, adicione o suficiente estéril RNase-free DEPC tratado água dupla destilada para fazer um volume amostral total de 13 microliters.

Em seguida, centrífuga brevemente e incubar por duas horas a 37 graus Celsius. Para experimentos de proteção RNase, recomendamos incubação por 15 minutos com dois microliters de Dnase-1, livre de RNase para remover DNA modelo. Uma vez que o passo de incubação esteja completo, pare a reação adicionando dois microlitadores de 0,2 molar EDTA no pH de oito.

Antes das etapas mostrarem aqui os slides foram desparaffinizados e rehidratados, de acordo com nosso protocolo previamente demonstrado. Após a reidratação incubar os slides em 0,01 mol por litro PBS em pH de 7,4 por cinco minutos cada para remover a solução fixa do tecido. Depois de enxaguar em PBS, enxágüemos em seguida com 100 milimões por litro de solução de glicina por litro por cinco minutos duas vezes para remover grupos de aldeído livre do tecido.

Após esta etapa, enxágue slides com PBS por cinco minutos. Em seguida, incubar em PBS contendo 0,3% tritão X-100 por 15 minutos antes de enxaguar e, em seguida, incubar novamente com um micrograma por microliter de proteinase K.Next, fixar slides com 4% de paraformaldeído e PBS em pH de 7,2 por três minutos. Em seguida, lave os slides antes de incubar com 0,1 tampão de trietanolamina molar pH 8, contendo anidrido acético de 0,25%.

Você pode optar por inclinar a caixa nesta fase para garantir a cobertura completa com a solução. A caixa é preparada adicionando 20% de glicerol ou água DEPC ao fundo de uma caixa de hibridização seca. Em seguida, cubra os slides em 20 microliters de solução de pré-hibridização.

DNA de esperma de salmão a uma concentração de 100 microgramas por mililitro para cada lâmina. E então incubar a 42 graus Celsius por quatro horas. Isso é feito em uma caixa umidificada pré-preparada para garantir que a solução não seque durante esse processo.

Na fase pós hibridização, é muito importante que a solução de hibridização seja completamente enxaguada de suas amostras. Isso pode ser feito em lavagem consecutiva de 15 minutos a 37 graus, utilizando quatro vezes a concentração SSC, duas vezes concentração uma vez, 0,5 vezes concentração e 0,1 vezes a solução de SSC de concentração. Cada uma incubando por 15 minutos a 37 graus Celsius.

Depois que isso for feito, lave com PBS três vezes por cinco minutos cada um antes de adicionar o tampão de lavagem. Tampão de lavagem deve ser enxaguado por um minuto antes dos próximos passos Certifique-se de que o tampão de lavagem esteja completamente seco dos slides antes de adicionar a próxima solução. Adicione 100 mililitros de solução de bloqueio a cada slide e incubar o slide por 30 minutos.

Isso é melhor feito em um ambiente livre de luz para garantir uma boa coloração. Em seguida, incubar os slides por 30 minutos novamente em 20 mLs de solução de anticorpos. Aplique a solução de anticorpos diretamente em slides para cobertura completa do seu tecido.

Uma vez concluída a incubação, aplique 100 mililitros de tampão de lavagem. Incubar por 15 minutos em condições livres de luz para remover conjugados de anticorpos sem saída. Remova o tampão de lavagem.

Em seguida, aplique 20 mililitros de tampão de detecção e permissão para incubar por aproximadamente quatro minutos. Após quatro minutos, remova o tampão de detecção. Seque as lâminas para garantir que não haja solução adicional e adicione 10 mililitros de solução de substrato de cores recém-preparada.

Esta reação começa em poucos minutos, mas está completa após 16 horas. Então permita incubar por esse período de tempo em uma condição livre de luz. Uma vez que as manchas desejadas onde as bandas são detectadas, lave o slide com 50 mililitros de tampão de TE para parar a reação.

E então complete nosso processo de desidratação e montagem previamente mostrado para goma neutra. As figuras um e dois demonstram o método de revestimento de gelatina cromada de alumínio para seções de parafina e o método de incorporação para perfil de expressão de FKBP12 e DmFKBP12 no desenvolvimento de embriões de Drosophila. A Figura três mostra a distribuição proteica de anticorpos detectados FKBP12 nos estágios de blastoderm celular sinintífilo.

A partir desses resultados histoquímicos, pode-se ver que a expressão FKBP12 é menos polarizada no blastoderme sinintítital, então começa a se localizar dentro da membrana do porão sob o epitélio do trophectoderm informa o gradiente com mais expressão encontrada nos polos anterior e posterior. A Figura quatro, que segue os estágios iniciais e tardios da relação gasosa do embrião Drosophila, mostra a proteína FKBP12 ficando restrita a certos componentes arquitetônicos do tecido embrionário primitivo. Com distribuição extracelular menor do que a observada nos estágios embrionários gastro precoces e tardios.

Curiosamente, a distribuição dinâmica de proteínas acima descrita não é acompanhada por alterações correspondentes nos níveis de ressonância magnética do FKBP12, como visto na figura cinco. Indicando expressão proteica como resultado de um mecanismo molecular pós-transcrição ainda desconhecido. A sinalização mediada de cálcio pelo receptor de ryanodo é um caminho fundamental em muitos processos fisiológicos e patológicos de animais vertebrados e invertebrados.

Mutações neste gene são conhecidas por causar muitos distúrbios fisiológicos que levam a doenças ou morte cardíaca precoce. No entanto, o papel desse gene no desenvolvimento precoce da Drosophila tem sido difícil de estudar. Como componente de trânsito do embrião, embrião rico em lipídios e chorão rico em quitina, dificultam estudos de proteína e expressão embrionária no desenvolvimento precoce de Drosophila.

O revestimento de slides, a incorporação de embriões e as técnicas imunohistoquímicas descritas neste artigo nos permitiram estudar detalhadamente a distribuição dinâmica da proteína do receptor de ryanodo e do mRNA. Compartilhamos essas técnicas e a esperança de que elas permitam que outras pessoas estudem outras proteínas durante os estágios iniciais de desenvolvimento da Drosophila.