Name: Um Protocolo para Imunohistoquímica e Distribuição In-situ de RNA dentro do Embrião Drosophila Precoce (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 34 s
Description: Aprenda imunohistoquímica e hibridização in situ em embriões de Drosophila melanogaster. Este protocolo melhora a adesão às lâminas e permite visualizar a distribuição de proteínas e RNA durante o desenvolvimento.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (#31771377/ 31571273/31371256), o Programa de Cientistas Distintos Estrangeiros do Departamento Nacional de Educação (#MS2014SXSF038), o Fundo Nacional de Pesquisa das Universidades Centrais do Departamento de Educação (#GK201301001 201701005/GERP-17-45) e XZ são apoiados pelo Fundo de Tese de Doutorado Excepcional (#2019TS082/2019TS079), Programa-Chave do Departamento de Educação Provincial de Shaanxi (#20JS138), o Projeto Jovem do Programa de Pesquisa Básica de Ciências Naturais do Departamento provincial de Ciência e Tecnologia de Shaanxi (#2020JQ-885).

1. Preparação de pratos de ágar de suco de uva
<ol><li>Adicione 5 g de ágar e 5 g de sacarose a 150 mL de água destilada. Ferva-o usando um micro-ondas até que o ágar e a sacarose estejam totalmente dissolvidos. Misture 50 mL de suco de uva 100% e a solução em conjunto.</li>
	<li>Adicione 1 mL de ácido 100% propiônico para fazer a concentração final a 0,5% de ácido propínico. Despeje 25 mL da solução preparada em cada placa. Depois que o ágar se solidificar, armazene a mídia em 4 °C.</li>
</ol>2. Slides de revestimento
<ol><li>Deslizes pré-tratados com detergente. Lave os slides 3 vezes com água da torneira e uma vez com água destilada. Em seguida, seque as lâminas em um forno de 45 °C por 2 h.</li>
	<li>Mergulhe os slides em cerca de 450 mL de solução de ácido sulfúrico de potássio (20 g de dicromato de potássio, 40 mL de água destilada e 400 mL de ácido sulfúrico concentrado) por 24 horas. Lave os slides 3 vezes com água da torneira e uma vez com água destilada.<ol>
<li>Seque as lâminas em um forno de 45 °C por duas horas. Mergulhe em 95% de etanol por mais de 2h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione 0,5 g de sulfato de potássio de cromo e 5 g de gelatina a 1 L de água destilada. Dissolva-se em um banho de água de 60 °C antes de usar. A gelatina cromada pode ser armazenada a 4 °C por longos períodos.</li>
	<li>Solte 10 μL da gelatina cromada no slide e cubra de forma completa e uniforme toda a superfície do slide com a solução. Coloque o slide com o lado da gelatina para cima em um forno a 42 °C por 48 h. Os slides preparados podem ser armazenados a 4 °C para uso posterior. NOTA: Este é um passo crítico. O revestimento completo é necessário. Para mosca de fruta e seu embrião, esta abordagem de revestimento deslizante parece mais eficiente do que o revestimento de poli-liseina.</li>
</ol>3. Embrião de Drosophila
<ol><li>
Coleção de embriões de Drosophila NOTA: Coletamos embriões de Drosophila em quatro períodos de 0-2 horas (blastoderm sincicial), 2-3 horas (blastoderm celular), 3-12 horas (gastrula precoce) e 12-24 horas (gastrula tardia)18. A proporção dos principais tipos de embriões em cada período é mostrada na Tabela 1.<ol>
<li>Coloque 400-500 moscas em uma garrafa de coleta de plástico e cubra a garrafa com a placa de ágar de suco de uva contendo extrato de levedura. Embriões de drosophila são colocados no ágar de suco de uva à temperatura ambiente.</li>
		<li>Colete quatro períodos de embriões, adicionando suavemente 2 mL de PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCL, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4) a cada placa para flutuar os embriões. Transfira cerca de 200 embriões para um tubo centrífuga de 50 mL e mantenha-o no gelo por 2 minutos para acalmar os embriões.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pré-incorporação<ol>
<li>Transfira 200 embriões de Drosophila para um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Mantenha o tubo no gelo por 2 minutos para acalmar os embriões e, em seguida, descarte o sobrenatante com pipeta cuidadosamente. Adicione 1 mL de alvejante de 50% no tubo e agite-o suavemente por 2 minutos. NOTA: O alvejante deve preparar fresco, e a quantidade do alvejante pode variar dependendo da quantidade de embriões coletados.</li>
		<li>Colete suavemente embriões por despeje em papel filtro e lave-os 3 vezes com 1 mL de PBS a cada vez.</li>
		<li>Transfira os embriões com papel filtro para cerca de 5 mL de n-heptane.</li>
		<li>Transfira a mistura para um tubo de centrífuga fresco de 1,5 mL. Adicione 1 mL de metanol e agite delicadamente. Coletar embriões após a sedimentação.</li>
		<li>Remova o supernaspe e lave os embriões em 1 mL de PBS 3-5 vezes.</li>
		<li>Fixar os embriões com 400 μL da solução de Bouin (ácido picrico saturado 71%, 24% de formalina, 5% ácido acético) por 30 min. Lave os embriões fixos 3 vezes em 1 mL de PBS por 5 minutos cada vez.</li>
		<li>Para agregar embriões, transfira as amostras para uma rolha de borracha e remova o PBS.</li>
		<li>Prepare 1,2% de solução agarose-PBS e mantenha a solução a 60 °C. Adicione 200 μL de solução agarose-PBS de 1,2% aos embriões para corrigi-los em um bloco de ágar.</li>
		<li>Tire o bloco da rolha e armazene o bloco na PBS. NOTA: Durante a abordagem pré-incorporação, o pró-aquecimento é fundamental para o sucesso. Sugerimos fortemente que os tubos centrífugas e as pontas de micropipette, que serão usados nesta etapa, devem ser completamente pré-aquecidos antes de operar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incorporação de parafina<ol>
<li>Mergulhe o bloco de ágar pré-incorporado em 35% de etanol, 50% de etanol, 75% de etanol e 85% de etanol por 15 minutos cada. Em seguida, caia 2 vezes em 95% de etanol e 100% etanol. NOTAs: Cerca de 5-10x de volume de bloco de cada seguido por um fixador classificado por 15-30 minutos é necessário dependendo do número de embriões no bloco.</li>
		<li>Mergulhe o bloco de embriões em solução 100% etanol e xileno (proporção 1:1) por 15 min.</li>
		<li>Transfira o bloco para xileno por 1 min para tornar transparente o tecido embrião.</li>
		<li>Submergir o bloco em xileno e parafina (proporção de 1:1) por 30 min.</li>
		<li>Submergir o bloco em parafina I, parafina II, e parafina III por 2h cada vez.</li>
		<li>Encha a caixa de incorporação com parafina com antecedência e, em seguida, transfira suavemente e horizontalmente o bloco para o fundo da caixa de incorporação. Após a parafina se solidificar naturalmente, o bloco de parafina solidificada pode ser armazenado a 4 °C. NOTAs: A amostra pré-incorporada pode ser usada na crioseção seguindo as seguintes etapas. Depois que os embriões são pré-incorporados com agarose como descrito acima, as amostras são simplesmente incorporadas no Composto OCT. Posteriormente, a criosecção pode ser realizada de acordo com o protocolo de crioseção de rotina. Posteriormente, abordagens regulares de coloração podem ser usadas nas seções.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Mancha de hematoxilina-eosina
<ol><li>Prepare seções de embriões de Drosophila . Coloque seções preparadas em um forno a 60 °C por 15 minutos e, em seguida, submerse as seções em xileno 2 vezes por 10 minutos cada. Submergir as seções uma vez em 100% etanol e xileno (proporção de 1:1) por 2 min.</li>
	<li>Hidrate as seções em 100% etanol I, 100% etanol II, 95% etanol, 85% etanol, 75% etanol, 50% etanol, e em água destilada por 3 min.</li>
	<li>Manche as seções com solução de hematoxilina por 2 minutos. Mergulhe os slides em solução de álcool ácida de 1% (1 mL de ácido clorídrico, 100 mL de 70% de etanol) rapidamente e lave os slides em água destilada.</li>
	<li>Queda nos slides em 50% etanol, 75% etanol, 85% etanol e 95% etanol sequencialmente.</li>
	<li>Manche as seções com solução de eosina por 1 min.</li>
	<li>Desidratar os slides em 95% de etanol I, 95% etanol II, 95% etanol III, 100% etanol I, 100% etanol II e 100% etanol III por 1 min cada vez.</li>
	<li>Limpe os slides em 100% xileno I, 100% xileno II, e 100% xileno III por 5 min cada vez.</li>
	<li>Monte os slides com bálsamo neutro de acordo com as instruções do fabricante.</li>
</ol>5. Coloração periódica ácido-prata methenamina
<ol><li>Desparafinar e hidratar seções de parafina do embrião de Drosophila à água destilada.</li>
	<li>Oxidar as seções em ácido periódico de 1% por 15 minutos em temperatura ambiente.</li>
	<li>Enxágüe os slides em água destilada 3 vezes por 1 min cada.</li>
	<li>Incubar os slides em cerca de 40 mL de solução de trabalho de methenamina prateada recém-filtrada (3% de methenamina, 5% de nitrato de prata, 5% solução de bortrato de sódio) por 1h e 20 minutos a 60 °C. Em seguida, enxágue os slides em água destilada por 1 min.</li>
	<li>Tonque os slides em cloreto de ouro de 0,2% por 2 min e enxágue os slides em água destilada por 1 min.</li>
	<li>Coloque os slides em 3% de tiossulfato de sódio por 3 minutos e depois enxágue os slides em água destilada por 1 min.</li>
	<li>Contratente os slides na hematoxilina por 30 s. Lave os slides em água da torneira por 3-5 min.</li>
	<li>Desidratar os slides em 70% de etanol, 80% etanol, 95% de etanol I, 95% de etanol II, 95% etanol III, 100% etanol I e 100% etanol II por 5 min cada.</li>
	<li>Limpe os slides em 100% xileno I, 100% xileno II e 100% xileno III por 5 min cada.</li>
	<li>Monte os slides em bálsamo neutro de acordo com as instruções do fabricante.</li>
</ol>6. Imunohistoquímica
<ol><li>Desparafinar e reidratar seções de parafina de embrião de Drosophila para PBS seguindo o protocolo padrão19.</li>
	<li>Trate slides com 0,3% de H2O2 em metanol por 10 minutos à temperatura ambiente e evite a luz.</li>
	<li>Pré-aqueça o tampão de recuperação de antígeno apropriado para aproximadamente 100 °C em um recipiente com os slides no vapor vegetal. O recipiente também deve ter uma tampa. Coloque os slides no recipiente. Feche a tampa do vapor.<ol>
<li>Mantenha o recipiente no vapor por 20 minutos a partir deste ponto. Observe que a tampa do recipiente de lâmina não deve ser totalmente apertada para que o vapor de água possa entrar durante o processo de vapor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deixe que os slides retornem à temperatura ambiente antes de enxágüe-os suavemente em PBS-T (PBS com Interpol-20, pH 7.2) 3 vezes por 5 minutos cada e, em seguida, enxágue os slides em PBS 3 vezes por 1 min cada.</li>
	<li>Bloqueie os slides com 1% de albumina de soro bovino (BSA) na PBS por 60 minutos em temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar os slides com anticorpo primário (anti-FKBP12 a 1:1000) durante a noite a 4 °C ou em temperatura ambiente por 4h.</li>
	<li>Lave os slides em PBS-T 4 vezes por 5 minutos cada.</li>
	<li>Aplique os slides com polímero rotulado HRP conjugado com anticorpos secundários (anti-Coelho, 1:5.000) por 90 minutos à temperatura ambiente. Faça isso no escuro para evitar branqueamento de fotos.</li>
	<li>Lave os slides em PBS-T 3 vezes por 5 minutos cada.</li>
	<li>Incubar os slides com 5% 3,3'-diaminobenzidina-tetrahidrocloreto (DAB) por 2-10 min até que a cor dos produtos de reação seja apropriada sob microscópio.</li>
	<li>Contratente os slides na hematoxilina por 30 s e lave os slides em água destilada 2 vezes por 5 minutos cada.</li>
	<li>Desidratar os slides em 50% etanol, 70% etanol, 90% etanol, 95% etanol e 100% etanol por 1 min cada.</li>
	<li>Limpe os slides em 100% xileno I, 100% xileno II e 100% xileno III por 5 min cada.</li>
	<li>Monte os slides em bálsamo neutro de acordo com as instruções do fabricante.</li>
</ol>7. Hibridização in-situ 
NOTA: Foram preparadas seções de embrião de drosophila com água tratada de pirocarbonato de diotila (DEPC) de 0,01%. Todos os acessórios utilizados para a hibridização in situ aplicam o tratamento noturno DA DEPC com antecedência.
<ol><li>Preparação de Riboprobe<ol>
<li>Linearize o DNA do modelo cortando um local de enzima de restrição rio abaixo da inserção clonada usando uma enzima de restrição que cria saliências de 5'. Após a linearização, purifique o DNA do modelo através da extração fenol/clorofórmio e da precipitação subsequente do etanol. Use protocolos padrão.</li>
		<li>Adicione 1 μg de DNA de modelo purificado a um tubo de centrífuga livre de RNase. Coloque o tubo de centrífuga no gelo. Adicione água tratada com DEPC suficiente ao volume total de 13 μL.<ol>
<li>Em seguida, adicione os seguintes reagentes em ordem: 2 μL de mistura de rotulagem NTP 10x, 2 μL de tampão de transcrição de 10x, 1 μL do inibidor RNase protetor, 2 μL de RNA Polymerase SP6 ou RNA Polymerase T7.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Misture a reação por pipetação e centrífuga em breve. Incubar por 2 h a 37 °C. NOTA: Incubações mais longas não aumentam o rendimento do RNA rotulado. Um giro curto (~800 rpm) aplicado no tubo de reação é necessário para ser necessário antes de continuar para o próximo passo. Este giro permitirá que todo o conteúdo, que poderia gerar a partir da incubação, chegue ao fundo do tubo.</li>
		<li>Adicione 2 μL de DNase I sem RNase para remover o DNA do modelo e incubar por 15 min a 37 °C.</li>
		<li>Adicione 2 μL de 200 mM EDTA (pH 8.0) para parar a reação. NOTA: As sondas de RNA com rótulo DIG podem ser armazenadas a -15 a -25 °C em etanol durante um ano.</li>
	</ol></li>
	<li>Pré-hibridização da seção de embriões de Drosophila<ol>
<li>Coloque seções de embrião de Drosophila em forno de 42 °C por 48 h.</li>
		<li>Desparafinar os slides em 100% de xileno por 10 minutos duas vezes.</li>
		<li>Hidrate os slides sequencialmente submersos em 100% etanol, 95% etanol, 90% etanol, 70% etanol e 50% etanol por 5 min.</li>
		<li>Incubar os slides em PBS por 5 min 3 vezes para remover a solução fixativa/solução de Bouin do tecido.</li>
		<li>Lave os slides com 100 mmol/L glicina/PBS solução 2 vezes por 5 min cada.</li>
		<li>Lave os slides com PBS 2 vezes por 5 minutos cada.</li>
		<li>Incubar os slides com 0,3% Triton X-100 em PBS por 15 minutos para permeabiliizar as membranas.</li>
		<li>Lave os slides com PBS 3 vezes por 5 minutos cada.</li>
		<li>Incubar os slides em 15 μg/mL RNase-free proteinase K por 30 minutos a 37 °C.</li>
		<li>Incubar os slides com 4% de paraformaldeído em PBS por 3 minutos para parar a digestão.</li>
		<li>Lave os slides com PBS 2 vezes por 5 minutos cada.</li>
		<li>Incubar os slides em tampão de trietanolamina de 100 mM (pH 8.0) com anidrido acético de 0,25% (v/v) 2 vezes por 5 min cada.</li>
		<li>Adicione água DEPC na câmara de umidade do slide. Adicione 20 μL de solução de pré-hibridização (contendo 100 μg/mL de DNA de esperma de salmão) nas lâminas. Coloque os slides na câmara de umidade do slide. Incubar os slides a 42 °C por 4 h. NOTA: É necessário garantir o aperto da tampa da caixa molhada e que a caixa molhada seja sempre mantida horizontalmente para evitar a volatilização e o desvio do tecido da solução de pré-hibridização e da solução de hibridização seguida.</li>
	</ol></li>
	<li>Hibridização da seção de embriões de Drosophila<ol>
<li>Remova a solução de pré-hibridização e lave os slides com 0,2x SSC (cloreto de sódio de 150 mM, citrato de sódio de 15 mM, pH 7.0) 3 vezes por 5 min cada. Limpe o excesso de 0,2x SSC ao redor das amostras de tecido.</li>
		<li>Aplique 30 μL de solução de hibridização da sonda (contendo 2-6 ng de sonda RNA com etiqueta de digoxina, diluindo em solução de pré-hibridização) com uma pipeta. Incubar os slides na câmara de umidade de slides a 42 °C por aproximadamente 20 h. NOTA: Certifique-se do aperto da tampa como sugestão da última nota. Caso contrário, o secamento causado pelo vazamento de pré-hibridização ou pré-hibridização gerará fundo sujo, incluindo pseudo-positivo em slides.</li>
	</ol></li>
	<li>Hibridização<ol>
<li>Remova a solução de hibridização e lave os slides com solução SSC 4 vezes por 15 minutos cada a 37 °C.</li>
		<li>Lave os slides em solução SSC 2x com 20 μg/mL de RNase A por 30 min a 37 °C.</li>
		<li>Lave os slides em solução SSC de 1x por 15 min a 37 °C.</li>
		<li>Lave os slides em solução SSC de 0,5x por 15 min a 37 °C.</li>
		<li>Lave os slides em solução SSC de 0,1x por 15 min a 37 °C.</li>
		<li>Lave os slides com PBS 3 vezes por 5 minutos cada.</li>
		<li>Lave os slides no tampão de lavagem (100 mM ácido masculino, 150 mM NaCl, 0,3% (v/v) Interpol 20, pH 7.5) por 1 min.</li>
		<li>Incubar os slides em 100 mL de solução de bloqueio recém-preparada (2% soro de ovelha em tampão de ácido maleico sem Interpol 20) por 30 minutos.</li>
		<li>Incubar os slides em 20 mL de solução de anticorpos por 45 minutos.<ol>
<li>Centrifugar o anticorpo por 5 min a 10.000 rpm no frasco original antes de cada uso, e encaixe a quantidade necessária cuidadosamente da superfície. Diluir anti-digoxigenina-AP 1:5000 (150 mU/mL) na solução de bloqueio.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Lave os slides em 100 mL de tampão de lavagem 2 vezes por 15 minutos cada para remover o conjugado de anticorpos desvinculados.</li>
		<li>Equilibre os slides em 20 mL de tampão de detecção (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 9.5) por 2-5 min.</li>
		<li>Incubar os slides com 10 mL de solução de substrato de cores recém-preparada na câmara de umidade de slides. A reação começa em poucos minutos e é completa após 16 h. Não agite ou misture enquanto a cor estiver se desenvolvendo.</li>
		<li>Lave os slides com 50 mL de água destilada por 5 minutos para parar a reação.</li>
		<li>Seque a amostra durante a noite no escuro.</li>
		<li>Desidratar os slides em 70% etanol, 80% etanol, 90% etanol, 95% etanol, 100% etanol I e 100% etanol II por 3 min cada.</li>
		<li>Limpe os slides em 100% xileno I, 100% xileno II e 100% xileno III por 20 min cada.</li>
		<li>Monte os slides com bálsamo neutro.</li>
		<li>Documente imagens e analise com a microscopia invertida e o software do fabricante. Realizar análise de distribuição utilizando ImageJ de acordo com a densidade de sinal positivo ao longo do eixo longitudinal ou dentro da zona diferencial de embriões. NOTA: Durante a incubação com a solução de substrato de cores recém-preparada na etapa 7.4.12, a cor da reação pode ser vista mesmo com um olho nu. Esta observação sobre como o desenvolvimento de cores pode ser inspecionado sob estereoscópio. Uma vez que a cor da reação é razoável e o passo 7.4.13 pode ser realizado para parar a reação.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Weisleder, N., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Ca2%2B+sparks+in+aging+skeletal+and+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle.</a> Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).</li>
<li>Cheng, H., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Sparks%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Calcium Sparks.</a> Physiological Reviews. 88 (4), 1491-1545 (2008).</li>
<li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+Receptors%3A+Functional+Structure+and+Their+Regulatory+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ryanodine Receptors: Functional Structure and Their Regulatory Factors.</a> Chinese Journal of Cell Biology. 37 (1), 6-15 (2015).</li>
<li>Xu, X., Balk, S. P., Isaacs, W., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling%3A+an+underlying+link+between+cardiac+disease+and+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling: an underlying link between cardiac disease and carcinogenesis.</a> Cell & Bioscience. 8 (39), 1-2 (2018).</li>
<li>Xu, X., Bhat, M. B., Nishi, M., Takeshima, H., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+cDNA+encoding+a+Drosophila+ryanodine+receptor+and+functional+studies+of+the+carboxyl-terminal+calcium+Release+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of cDNA encoding a Drosophila ryanodine receptor and functional studies of the carboxyl-terminal calcium Release Channel.</a> Biophysical Journal. 78 (3), 1270-1281 (2000).</li>
<li>George, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+FKBP+family+protein%3A+evaluation%2C+structure%2C+and+function+in+mammals+and+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of FKBP family protein: evaluation, structure, and function in mammals and Drosophila melanogaster.</a> BMC Developmental Biology. 18 (1), 1-12 (2018).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syncytium+calcium+signaling+and+macrophage+function+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Syncytium calcium signaling and macrophage function in the heart.</a> Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+CaSR%2FIP3R+in+prostate+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Calcium and CaSR/IP3R in prostate cancer development.</a> Cell & Bioscience. 8 (1), 1-7 (2018).</li>
<li>Xu, M., Seas, A., Kiyani, M., Ji, K. S., Bell, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+temporal+examination+of+calcium+signaling+in+cancer-+from+tumorigenesis%2C+to+immune+evasion%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Bioscience%22%5BJournal%5D)">A temporal examination of calcium signaling in cancer- from tumorigenesis, to immune evasion, and metastasis.</a> Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).</li>
<li>Shou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+defects+and+altered+ryanodine+receptor+function+in+mice+lacking+FKBP12%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cardiac defects and altered ryanodine receptor function in mice lacking FKBP12.</a> Nature. 391 (6666), 489-492 (1998).</li>
<li>Xin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oestrogen+protects+FKBP12.6+null+mice+from+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oestrogen protects FKBP12.6 null mice from cardiac hypertrophy.</a> Nature. 416 (6878), 334-337 (2002).</li>
<li>Zalk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+mammalian+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a mammalian ryanodine receptor.</a> Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).</li>
<li>Ridgway, E. B., Gilkey, J. C., Jaffe, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+calcium+increases+explosively+in+activating+medaka+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Free calcium increases explosively in activating medaka eggs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (2), 623-627 (1977).</li>
<li>Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+free+calcium+wave+traverses+the+activating+egg+of+the+medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes.</a> Journal of Cell Biology. 76 (2), 448-466 (1978).</li>
<li>Kreko-Pierce, T., Azpurua, J., Mahoney, R. E., Eaton, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+health+span+and+life+span+in+Drosophila+by+S107+requires+the+calstabin+homologue+FK506-BP2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Extension of health span and life span in Drosophila by S107 requires the calstabin homologue FK506-BP2.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (50), 26045-26055 (2016).</li>
<li>Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ryanodine+receptor+is+essential+for+larval+development+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5942-5947 (2000).</li>
<li>Feng, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+expression+of+DmFKBP12%2FCalstabin+during+embryonic+early+development+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Dynamics expression of DmFKBP12/Calstabin during embryonic early development of Drosophila melanogaster.</a> Cell & Bioscience. 9 (1), 1-16 (2019).</li>
<li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+JA+%22The+embryonic+development+of+Drosophila+melanogaster%22">The embryonic development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer. 633-645 (1958).</li>
<li>Xu, X., Dong, C., Vogel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemicentins+Assemble+on+Diverse+Epithelia+in+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Hemicentins Assemble on Diverse Epithelia in the Mouse.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (2), 119-126 (2007).</li>
<li>Wehrens, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FKBP12.6+deficiency+and+defective+calcium+release+channel+%28ryanodine+receptor%29+function+linked+to+exercise-induced+sudden+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death.</a> Cell. 113 (7), 829-840 (2003).</li>
<li>Wehrens, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+from+cardiac+arrhythmia+through+ryanodine+receptor-stabilizing+protein+calstabin2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Protection from cardiac arrhythmia through ryanodine receptor-stabilizing protein calstabin2.</a> Science. 304 (5668), 292-296 (2004).</li>
<li>Bellinger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+ryanodine+receptor+complex+causes+%26%2334%3Bleaky%26%2334%3B+channels%3A+a+molecular+mechanism+for+decreased+exercise+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Remodeling of ryanodine receptor complex causes &#34;leaky&#34; channels: a molecular mechanism for decreased exercise capacity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (6), 2198-2202 (2008).</li>
<li>Maruyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FKBP12+is+a+critical+regulator+of+the+heart+rhythm+and+the+cardiac+voltage-gated+sodium+current+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">FKBP12 is a critical regulator of the heart rhythm and the cardiac voltage-gated sodium current in mice.</a> Circulation Research. 108 (9), 1042-1052 (2011).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FKBP12+is+the+only+FK506+binding+protein+mediating+T-cell+inhibition+by+the+immunosuppressant+FK506%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">FKBP12 is the only FK506 binding protein mediating T-cell inhibition by the immunosuppressant FK506.</a> Transplantation. 73 (11), 1835-1838 (2002).</li>
<li>Zalk, R., Marks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+release+channels+join+the+%27resolution+revolution%27%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ca2+ release channels join the 'resolution revolution'.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 543-555 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

RyRs e IP3Rs mediados sinalização de cálcio é um caminho fundamental em muitos processos fisiológicos e patológicos de animais vertebrados e invertebrados1,2,3,4. Em humanos, mutações pontuais, como a mutação R4496C associada ao CPVT, no gene RyR2 levam ao vazamento de cálcio do ritúlumo sarcoplasmático do cardiomiócito, resultando em disfunção cardíaca. Essas mutações apresentam-se como arritm...

A sinalização de liberação de cálcio (CICR) tem papel crítico em muitos processos biológicos, como músculo esquelético/liso e função vascular cardíaca, proliferação celular e apoptose, desenvolvimento, envelhecimento, plasticidade sináptica neuronal e regeneração1,2,3,4,5,6 . Os receptores ryanodine (RyRs) e os receptores de linfosfato inositol 1,4,5-trisfosfato (IP3Rs) são os principais players na via de sinalização de cálcio controlada por seus reguladores protein quinase A (PKA), Ca2+/calmodulin-dependent protein quinase II (CaMKII), FK506 proteínas vinculantes (FKBPs), calsequestrin (CSQ), tqdinria, tqdinria, tq e junctina1,2,3,4,5,6 . A expressão humana anormal e as mutações nessas proteínas podem levar à fisiologia patológica, como arritmias7 e proliferação oncogênica8,9.
FKBPs regulam a liberação de cálcio do reticular endoplasmico (ER) por RyRs. Este processo é essencial para o mecanismo de contração e, portanto, responsável por todo o movimento mecânico gerado pela contração miosina-actina através da liberação de cálcio induzida pelo cálcio, juntamente com ryRs1,2 embrionário. Nos modelos de mouse, a falta de RyR2 e seu regulador FKBP12/Calstabin é invariavelmente letal, seja durante o desenvolvimento embrionário ou no período pós-natal inicial10,11,12. Os camundongos eliminados FKBP12/Calstabin apresentam defeitos cardíacos críticos com acoplamento irregular de excitação- contração (CE) e edema cerebral durante o desenvolvimento embrionário. Isso indica que o FKBP12/Calstabin desempenha um papel essencial na regulação da expressão do canal RyR2, o que é importante tanto para o desenvolvimento cardíaco quanto cerebral10.
As faíscas de cálcio conduzidas pelo RyR foram inicialmente descobertas na fase de formação de zigotos de ovos Medaka fertilizados13,14. No entanto, poucas investigações foram realizadas sobre a função da sinalização de cálcio no desenvolvimento embrionário precoce. Em Drosophila melanogaster, os resultados obtidos dos mutantes DmFKBP12 S107 fornecem fortes evidências que sustentam a importância desse gene para o desenvolvimento larval e uma vida útil saudável, que é atribuída à sua função contra o estresse oxidativo15,16. Recentemente, identificamos a localização dinâmica da proteína FKBP12/Calstabin e do RNA mensageiro durante o desenvolvimento inicial de Drosophila melanogaster17. Utilizando as abordagens descritas nesta metodologia, pudemos rastrear a expressão de FKBP12/Calstabin em D. melanogaster durante o blastoderm sincicial (0-2 h), blastoderm celular (2-3 h), gastrula precoce (3-12 h) e gastrula tardia (12-24 h). Neste artigo, apresentamos os protocolos detalhados de todas as abordagens do estudo anterior, incluindo incorporação pré-embrionária para secção clássica de parafina, tratamento de slides pré-revestimento para seções embrionárias, coloração de histoquímica e imunostaining, e hibridização mRNA in-situ para identificação da expressão genética.

<table><tbody><tr><td>-20&deg; C Frigorífico</td><td>Meiling Biologia & Médico</td><td>DW-YL270</td><td>Usado para armazenamento regente-80</td></tr><tr><td>&deg; C Refrigerador de temperatura ultra baixa</td><td></td><td>Thermo Forma 90</td><td>Series Usado para armazenamento de regentes</td></tr><tr><td>Ágar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WXBB6360V</td><td>Preparação de placas de ágar suco de uva</td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenina-AP, fragmentos de Fab</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td>Para a detecção de composto marcado com digoxigenina</td></tr><tr><td>Incubadora bioquímica</td><td>Shanghai Bluepard Instruments</td><td>LRH-250</td><td>In-situ Hibridização</td></tr><tr><td>Solução de Bouin</td><td>Reagente Químico Sinopharm em Pequim</td><td>69945460</td><td>Drosophila Centrífuga de Incorporação de Embriões</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>540BH07808</td><td>In-situ Tubo</td></tr> de <tr><td>Centrífuga</td> de Hibridização <td>Denville</td><td>C-2170</td><td>Coleção de Embriões de Drosophila</td></tr><tr><td>Reagente Químico Sinopharm de Alum de Cromo</td><td>em Lâminas</td> de <td>revestimento</td><td>de 10001018</td> de Pequim</tr><tr><td>Banho-maria de temperatura constante</td><td>Jintan Henfeng Instruments</td><td>KW-1000DC</td><td>Coloração de hematoxilina-eosina, imuno-histoquímica, hibridização in-situ e coloração de metenamina de ácido periódico-prata</td></tr><tr><td>Dako REAL EnVision Sistema de detecção</td><td>Dako</td><td>K5007</td><td>Na reação imuno-histoquímica ou reação de hibridização in situ, ele se liga ao anticorpo antígeno primário e o alvo é marcado por coloração.</td></tr>Kit de marcação de RNA <tr><td>DIG de hibridização in-situ</td> <td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td></tr><tr>Marcação de<td>RNA</td><td>11093274910</td> da <td>Roche</td><td>com diagoxigenina-UTP por transcrição in vitro com RNA polimerase SP6 e T7</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664</td><td>Os estoques de Drosophila melanogaster mutante</td></tr><tr><td>Forno elétrico de secagem por explosão</td><td>Tianjin Taiste Instruments</td><td>101-0AB</td><td>Para revestimento de lâminas e incorporação de parafina</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230251</td><td>Coloração de Hematoxilina-Eosina</td></tr><tr><td></td><td>Reagente Químico de Sinopharm de Etanol em Pequim</td><td>100092680</td><td>Incorporação de Parafina, Coloração de Hematoxilina-Eosina, Imuno-histoquímica, Hibridização In-situ e Coloração</td></tr> <tr><td>de Ácido Periódico-Prata MetenaminaReagente químico de gelatina</td><td>Sinopharm em lâminas</td><td>de revestimento</td><td>de 10010328</td> de Pequim</tr><tr><td>Cloreto de ouro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>379948</td><td>Coloração de metenamina de ácido periódico-prata</td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3136</td><td>Coloração de hematoxilina-eosina</td></tr><tr><td>Kit de purificação de produto de PCR de alta pureza Roche</td><td></td><td>11732668001</td><td>Para purificação de produtos</td></tr> <tr><td>de PCRCaixa inteligente de temperatura e umidade constante</td><td>Ningbo Jiangnan Instruments</td><td>HWS</td><td>para manutenção de moscas</td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>HyAgarose</td><td>14190108029</td><td>Reagente químico pré-incorporado de</td></tr><tr><td>metanol</td><td>Sinopharm em Pequim</td><td>10014108</td><td>Microscópio de coleta de embriões Drosophila</td></tr><tr><td></td><td>ZEISS</td><td>Observer.A1</td><td>Coloração de hematoxilina-eosina, imuno-histoquímica, hibridização in-situ e coloração de metenamina de ácido periódico-prata</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>MeVid Labware Manufacturing</td><td>P105-2001</td><td>Lâminas de revestimento</td></tr><tr>Reagente químico de<td>goma neutra</td><td>Sinopharm em Pequim</td><td>10004160</td><td>Coloração de hematoxilina-eosina</td></tr><tr>Reagente químico<td>N-heptano</td><td>Sinopharm em Pequim</td><td>40026768</td><td>Embrião de Drosophila Coleção</td></tr><tr><td>Cortador de parafina</td><td>Huahai instrumento científico</td><td>HH-2508III</td><<td>em>In-situ Reagente químico de parafina de hibridização</td></tr><tr><td></td><td>Sinopharm em Pequim</td><td>69019461</td><td>Medidor</td></tr> de <tr><td>pH / mV</td> de incorporação de parafina <td>Sartorius</td><td>PB-10</td><td>Para determinar o valor de pH de uma solução</td></tr><tr><td>Reagente químico Sinopharm</td> de<td>nitrato de prata</td> na 10018461 de Pequim <td></td> Medidor de água ultrapuro <td>de coloração de metenamina de ácido periódico-prata</td></tr><tr><td></td><td>Thermo</td><td>AFXI-0501-P</td><td>In-situ</td></tr><tr>Reagente químico de<td>xileno</td><td>Sinopharm</td> de hibridização em Pequim <td>10023418</td><td>incorporação de parafina</td></tr></tbody></table>

um protocolo para imunohistoquímica e distribuição in-situ de rna dentro do embrião drosophila precoce

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

A sinalização de liberação de cálcio induzida por cálcio (CICR) desempenha um papel crítico em muitos processos biológicos. Toda atividade celular desde a proliferação celular e apoptose, desenvolvimento e envelhecimento, até a plasticidade sináptica neuronal e a regeneração têm sido associadas aos receptores ryanodo (RyRs). Apesar da importância da sinalização de cálcio, o mecanismo exato de sua função no desenvolvimento precoce não é claro. Como um organismo com um curto período gestacional, os embriões de Drosophila melanogaster são temas de estudo primordial para investigar a distribuição e localização de proteínas associadas ao CICR e seus reguladores durante o desenvolvimento. No entanto, devido aos seus embriões ricos em lipídios e corão rica em quitina, sua utilidade é limitada pela dificuldade de montar embriões em superfícies de vidro. Neste trabalho, introduzimos um protocolo prático que aumenta significativamente a fixação do embrião Drosophila em slides e métodos de detalhes para histoquímica bem sucedida, imunohistoquímica e hibridização in situ . O método de revestimento de slides de gelatina cromada e o método de pré-incorporação de embriões aumentam drasticamente o rendimento no estudo da proteína embrião Drosophila e da expressão de RNA. Para demonstrar essa abordagem, estudamos o DmFKBP12/Calstabin, um conhecido regulador do RyR durante o desenvolvimento embrionário precoce do Drosophila melanogaster. Identificamos o DmFKBP12 no estágio de blastoderme sinintítico e relatamos o padrão de expressão dinâmica do DmFKBP12 durante o desenvolvimento: inicialmente como uma proteína distribuída uniformemente na blastodermia sincicial, localizando preliminarmente a camada de porão do córtex durante o blastoderm celular, antes de distribuir na arquitetura neuronal e digestão primitiva durante a fase de três gemas no início da gasolação. Essa distribuição pode explicar o papel crítico que o RyR desempenha nos sistemas vitais de órgãos que se originam a partir dessas camadas: o gânglio suboesofágico e supraesofágico, o sistema nervoso ventral e o sistema musculoesquelético.

As figuras descrevem protocolos usados para superar o desafio de anexar embriões de chorão de alta lipídica e de chitina (Tabela 1) à superfície do slide de vidro para exame e experimentação. Utilizando o método de revestimento de slides de gelatina cromada mostrado na Figura 1, aumentamos a fixação de embriões de Drosophila na superfície dos slides, enquanto o método de pré-incorporação de embriões mostrado na Figura 2 permite...

Aqui, descrevemos um protocolo de detecção e localização da proteína de embrião Drosophila e RNA da coleta à pré-incorporação e incorporação, imunostaining e mRNA in situ hibridização.

Um Protocolo para Imunohistoquímica e Distribuição In-situ de RNA dentro do Embrião Drosophila Precoce

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

Como um organismo com um curto período gestacional, os embriões de Drosophila melanogaster são temas de estudo privilegiados para investigar a distribuição e localização de proteínas e seus reguladores durante o desenvolvimento. No entanto, devido aos seus embriões ricos em lipídios e corão rica em quitina, sua utilidade é limitada pela dificuldade de montar embriões em superfícies de vidro. Neste trabalho, introduzimos um método prático que aumenta significativamente a fixação do embrião de Drosophila em slides e detalha nossos métodos para histoquímica bem sucedida, imunohistoquímica e hibridização in situ.Antes dos passos aqui mostrados, os slides devem ser lavados com detergente, depois enxaguados em água da torneira e água destilada antes de serem colocados no forno para secar. As lâminas secas devem absorver suavemente o dicromato de potássio por 24 horas antes de serem enxaguados e secos novamente, depois colocados em 95% de etanol por pelo menos duas horas. Durante esta etapa, você pode preparar mais slides ou a gelatina cromada de acordo com nossos métodos.A gelatina pode então ser armazenada em água de banho de 60 graus antes de ser usada. Para revestir slides, deixe cair uma pequena quantidade de gelatina em uma borda do slide. Em seguida, use outro slide de vidro para arrastar lentamente e uniformemente a gelatina através da superfície do slide para ser revestida.Isso cria uma camada fina e uniforme. Antes de ser colocado em um rack ou aparato de secagem para ser armazenado em um forno para permitir a secagem completa por mais uma noite ou 48 horas. O embrião é coletado usando uma placa de ágar de suco de uva, uma vez pronto, o prato de ágar de suco de uva pode então ser removido.Inunde a placa com PBS e escove delicadamente com uma escova macia para remover quaisquer embriões ligados. Remova o embrião contendo PBS a um tubo centrífugas de 1,5 mililitros e deixe descansar no gelo. Uma vez que o embrião seja instalado no gelo, remova suavemente o PBS sobrenatante.Tenha cuidado para não perturbar o embrião na parte inferior do tubo. Adicione 1 mL de alvejante de 50% à amostra e agite delicadamente por dois minutos. Remova o alvejante por filtragem e lave embriões em PBS três vezes.Prepare-se n-heptane. Uma vez pronto, lave os embriões do papel do filtro em n-heptane, agitando o papel do filtro suavemente na solução. Permita que os embriões se instalem na parte inferior da placa de n-heptano e colete este n-heptano em um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.Adicione um mililitro de metanol ao tubo, deixe a solução precipitar e, em seguida, aspirar o metanol de n-heptano. Lave o embrião em PBS três a cinco vezes para remover o metanol residual. Remova este PBS extra e adicione o fixador de Bouin e deixe se contentar por 30 a 60 minutos para corrigir os embriões.Remova o fixador de Bouin e lave os embriões novamente na PBS três vezes. Prepare 1,2% de agarose na PBS e mantenha aquecido em um banho de água de 60 graus e prepare os embriões para incorporar, aspirando suavemente pbs extras em que foi armazenado. Cuidado para não perturbar os embriões na parte inferior e, em seguida, aspirar o plugue de embrião na parte inferior da solução e colocar suavemente em um molde de tampa de garrafa.Aspire qualquer PBS adicional deste molde antes de adicionar gel de 1,2% agarose. Prepare uma solução de PBS para armazenar esses plugues de ágarose. Uma vez que a agarose tenha se solidificado, os plugues individuais podem então ser movidos para este PBS para armazenamento.Aqui estamos mostrando o processo de desidratação sequencial. Permitindo 15 minutos para incubação cada vez. Em seguida, retire do etanol 100% e fixe em uma solução um-para-um de etanol e xileno por mais 15 minutos.Uma vez removido desta solução um-para-um, remova em xileno puro por um minuto. Agora a amostra de tecido está pronta para ser movida para uma solução de parafina de xileno aquecida. Deixe descansar por 30 minutos antes da incorporação final em 100% de parafina.Mova-se para a primeira de 100% de parafina e descanse por duas horas. Repita este processo em suas duas e três parafinas. A amostra está agora pronta para ser movida para um molde e o molde cheio de cera para completar o processo de incorporação.Incorporação de embriões de Drosophila. Coloque seções de parafina preparadas de embriões de Drosophila em forno de 60 graus por 15 minutos. Coloque-os em uma solução 100% de xileno.Então começamos a reidratação. Coloque os slides em cada uma dessas soluções por três minutos cada. Uma vez que o slide esteja em água destilada, coloque na solução de hematoxilina por dois minutos.Uma vez concluído certifique-se de drenar o máximo possível da solução do slide. Uma vez que o slide tenha sido lavado em água destilada, então manche o escorregador em eosin por um minuto. Por fim, remova o slide da eosina e lave em água destilada.Uma vez que este slide está limpo, agora começamos nosso processo de desidratação final. Finalmente sendo colocado em 100% xileno por cinco minutos. Este processo se repete em duas novas soluções de 100% xileno e solta uma pequena quantidade de goma neutra ao longo de uma borda do slide.Pegue este deslizamento de cobertura e posicione delicadamente em uma borda do slide. Primeiro desparafinar os slides colocando em 100% xileno. Uma vez que os slides são removidos da água destilada, eles devem ser cobertos com solução de ácido 1%periódica.Em seguida, descartamos o excesso de solução e enxaguamos em água destilada. Colocando o slide diretamente em uma solução pré-aquecido. Uma vez que isso esteja completo, enxágüemos o escorregador em água destilada e, em seguida, matize a solução com cloreto de ouro de 0,2% por um a dois minutos.Em seguida, fixamos o tecido com 3% de sulfato de tio de sódio por três minutos usando água destilada. E, em seguida, contra-mancha com hematoxilina. Após a contra-mancha, a mancha pode ser lavada com qualquer tubo de água destilada, como mostrado aqui.Então passamos para o processo de desidratação. Siga isso colocando os slides diretamente em 100% de xileno e, em seguida, aplique uma pequena quantidade de goma neutra no canto do slide. Cubra delicadamente com um deslizamento de cobertura.Comece a preparar os slides como anteriormente, desparafinando e xileno. E depois em um-para-um etanol de xileno. Uma vez que os slides são desparafinados, começamos a reidratar seu tecido e, finalmente, na PBS.Coloque os slides em peróxido de hidrogênio de 0,3% feito em metanol por 10 minutos. Em seguida, os slides são cobertos com 20 mLs de solução de recuperação de destino. Os slides podem então ser colocados na caixa de coloração.Coloque a caixa do stainer em um vapor, garantindo que nenhuma solução escape e os slides ainda estejam totalmente cobertos. Observe que a tampa da caixa de manchas não deve ser totalmente fechada para que o vapor de água possa escapar durante o processo de vapor. E, em seguida, suavemente enxaguando em PBS-T três vezes.Descarte a solução em excesso e repita o processo, desta vez com PBS. Em seguida, incubamos os slides em um bloco de peróxido por cinco a 10 minutos e, em seguida, enxaguar várias vezes novamente no PBS-T e, em seguida, em PBS. Prepare o anticorpo e caia diretamente no tecido.Esses tecidos podem então ser incubados ou em temperatura ambiente por quatro horas. O anticorpo secundário deve ser incubado à temperatura ambiente por 90 minutos, que é a coloração com 5%DAB por dois a 10 minutos. Depois que a cor apropriada for obtida, enxágue em água destilada e, em seguida, contra-mancha na hematoxilina.Após esta mancha de hematoxilina, os slides podem então ser sequencialmente desidratados. Coloque os slides em 100% de xileno e deixe de molho por três minutos. Em seguida, solte pequenas quantidades de goma neutra em uma borda do slide.Uma vez colocado um chiclete, pegue a tampa do slide e coloque delicadamente de uma borda do slide. Adicione um micrograma de DNA de modelo linearizado purificado a um frasco de reação livre de RNase estéril. Em seguida, adicione o suficiente estéril RNase-free DEPC tratado água dupla destilada para fazer um volume amostral total de 13 microliters.Em seguida, centrífuga brevemente e incubar por duas horas a 37 graus Celsius. Para experimentos de proteção RNase, recomendamos incubação por 15 minutos com dois microliters de Dnase-1, livre de RNase para remover DNA modelo. Uma vez que o passo de incubação esteja completo, pare a reação adicionando dois microlitadores de 0,2 molar EDTA no pH de oito.Antes das etapas mostrarem aqui os slides foram desparaffinizados e rehidratados, de acordo com nosso protocolo previamente demonstrado. Após a reidratação incubar os slides em 0,01 mol por litro PBS em pH de 7,4 por cinco minutos cada para remover a solução fixa do tecido. Depois de enxaguar em PBS, enxágüemos em seguida com 100 milimões por litro de solução de glicina por litro por cinco minutos duas vezes para remover grupos de aldeído livre do tecido.Após esta etapa, enxágue slides com PBS por cinco minutos. Em seguida, incubar em PBS contendo 0,3% tritão X-100 por 15 minutos antes de enxaguar e, em seguida, incubar novamente com um micrograma por microliter de proteinase K.Next, fixar slides com 4% de paraformaldeído e PBS em pH de 7,2 por três minutos. Em seguida, lave os slides antes de incubar com 0,1 tampão de trietanolamina molar pH 8, contendo anidrido acético de 0,25%.Você pode optar por inclinar a caixa nesta fase para garantir a cobertura completa com a solução. A caixa é preparada adicionando 20% de glicerol ou água DEPC ao fundo de uma caixa de hibridização seca. Em seguida, cubra os slides em 20 microliters de solução de pré-hibridização.DNA de esperma de salmão a uma concentração de 100 microgramas por mililitro para cada lâmina. E então incubar a 42 graus Celsius por quatro horas. Isso é feito em uma caixa umidificada pré-preparada para garantir que a solução não seque durante esse processo.Na fase pós hibridização, é muito importante que a solução de hibridização seja completamente enxaguada de suas amostras. Isso pode ser feito em lavagem consecutiva de 15 minutos a 37 graus, utilizando quatro vezes a concentração SSC, duas vezes concentração uma vez, 0,5 vezes concentração e 0,1 vezes a solução de SSC de concentração. Cada uma incubando por 15 minutos a 37 graus Celsius.Depois que isso for feito, lave com PBS três vezes por cinco minutos cada um antes de adicionar o tampão de lavagem. Tampão de lavagem deve ser enxaguado por um minuto antes dos próximos passos Certifique-se de que o tampão de lavagem esteja completamente seco dos slides antes de adicionar a próxima solução. Adicione 100 mililitros de solução de bloqueio a cada slide e incubar o slide por 30 minutos.Isso é melhor feito em um ambiente livre de luz para garantir uma boa coloração. Em seguida, incubar os slides por 30 minutos novamente em 20 mLs de solução de anticorpos. Aplique a solução de anticorpos diretamente em slides para cobertura completa do seu tecido.Uma vez concluída a incubação, aplique 100 mililitros de tampão de lavagem. Incubar por 15 minutos em condições livres de luz para remover conjugados de anticorpos sem saída. Remova o tampão de lavagem.Em seguida, aplique 20 mililitros de tampão de detecção e permissão para incubar por aproximadamente quatro minutos. Após quatro minutos, remova o tampão de detecção. Seque as lâminas para garantir que não haja solução adicional e adicione 10 mililitros de solução de substrato de cores recém-preparada.Esta reação começa em poucos minutos, mas está completa após 16 horas. Então permita incubar por esse período de tempo em uma condição livre de luz. Uma vez que as manchas desejadas onde as bandas são detectadas, lave o slide com 50 mililitros de tampão de TE para parar a reação.E então complete nosso processo de desidratação e montagem previamente mostrado para goma neutra. As figuras um e dois demonstram o método de revestimento de gelatina cromada de alumínio para seções de parafina e o método de incorporação para perfil de expressão de FKBP12 e DmFKBP12 no desenvolvimento de embriões de Drosophila. A Figura três mostra a distribuição proteica de anticorpos detectados FKBP12 nos estágios de blastoderm celular sinintífilo.A partir desses resultados histoquímicos, pode-se ver que a expressão FKBP12 é menos polarizada no blastoderme sinintítital, então começa a se localizar dentro da membrana do porão sob o epitélio do trophectoderm informa o gradiente com mais expressão encontrada nos polos anterior e posterior. A Figura quatro, que segue os estágios iniciais e tardios da relação gasosa do embrião Drosophila, mostra a proteína FKBP12 ficando restrita a certos componentes arquitetônicos do tecido embrionário primitivo. Com distribuição extracelular menor do que a observada nos estágios embrionários gastro precoces e tardios.Curiosamente, a distribuição dinâmica de proteínas acima descrita não é acompanhada por alterações correspondentes nos níveis de ressonância magnética do FKBP12, como visto na figura cinco. Indicando expressão proteica como resultado de um mecanismo molecular pós-transcrição ainda desconhecido. A sinalização mediada de cálcio pelo receptor de ryanodo é um caminho fundamental em muitos processos fisiológicos e patológicos de animais vertebrados e invertebrados.Mutações neste gene são conhecidas por causar muitos distúrbios fisiológicos que levam a doenças ou morte cardíaca precoce. No entanto, o papel desse gene no desenvolvimento precoce da Drosophila tem sido difícil de estudar. Como componente de trânsito do embrião, embrião rico em lipídios e chorão rico em quitina, dificultam estudos de proteína e expressão embrionária no desenvolvimento precoce de Drosophila.O revestimento de slides, a incorporação de embriões e as técnicas imunohistoquímicas descritas neste artigo nos permitiram estudar detalhadamente a distribuição dinâmica da proteína do receptor de ryanodo e do mRNA. Compartilhamos essas técnicas e a esperança de que elas permitam que outras pessoas estudem outras proteínas durante os estágios iniciais de desenvolvimento da Drosophila.

a-protocol-for-immunohistochemistry-rna-situ-distribution-within

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este protocolo demonstra como executar imunohistoquímica em dissecados larva Drosophila.

Drosophila larval MNJ Imunohistoquímica

Nós descrevemos o procedimento para preparar...

Visualização do Sistema Nervoso embrionárias no Whole-mount Drosophila Os embriões

Drosophila Imunohistoquímica Abdomen Pupal

Todo o Monte RNA Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; A hibridação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões

A imunocoloração é uma técnica eficaz para visualizar tipos específicos de células e proteínas dentro dos tecidos. Ao utilizar a sonicação, o protocolo descrito aqui alivia a necessidade de dissecar tecidos de Drosophila melanogaster de embriões e larvas em estágio avançado antes da imunocoloração. Fornecemos uma metodologia eficiente para a imunocoloração de larvas de montagem inteira fixadas em formaldeído.

Facilitou-Sonication Imunofluorescência Coloração de Late-estágio embrionário e larval<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos<em&gt; In Situ</em

Nós descrevemos um monte de todo o processo de hibridação in situ multi-alvo cromogénico (MC-DESEJO) em embriões de Drosophila intactas permitindo a detecção simultânea e específica de três padrões de distribuição mRNA diferentes, contrastando precipitados de cor.

Multi-alvo Chromogenic Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização para Comparando Expressão Gênica em Domínios<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões

O protocolo descrito de RNA em situ hibridização permite a detecção de RNA em toda Drosophila embriões ou tecidos dissecados. Usando placas de 96 poços da microplaca e amplificação do sinal de tyramide, transcrições podem ser detectadas no throughput, sensibilidade e alta resolução e a um custo relativamente baixo.

Alta resolução hibridação fluorescente In Situ em embriões da drosófila e tecidos usando amplificação de sinal Tyramide

Apresentado aqui é um protocolo para microinjetar e simultaneamente imaginar múltiplos embriões de Drosophila durante o desenvolvimento embrionário usando um imager de alto teor baseado em placas.

Preparação e microinjeção de embriões Drosophila para Microscopia de Células Vivas Realizadas usando um Analisador automatizado de alto teor

Este estudo apresenta um protocolo simplificado para processamento de tecidos envolvendo decapitação, fixação, criosecção, coloração de fluorescência, imunocoloração e imagem, que pode ser estendido para imagens confocais e multifotônicas. O método mantém uma eficácia comparável a dissecções complexas, ignorando a necessidade de habilidades motoras avançadas. A análise quantitativa de imagens fornece amplo potencial investigativo.

Crioseccionamento direto de cabeças de Drosophila para coloração e imunocoloração aprimoradas de fluorescência cerebral

Esses protocolos descrevem como caracterizar a organização e a função de oclusão das junções do septo plissado no epitélio embrionário de Drosophila no controle e mutante.

Experimentos de imunocoloração e penetração de corantes para definir proteínas de junção septata plissada no núcleo em epitélios embrionários de Drosophila

Aprenda imunohistoquímica e hibridização in situ em embriões de Drosophila melanogaster. Este protocolo melhora a adesão às lâminas e permite visualizar a distribuição de proteínas e RNA durante o desenvolvimento.

Um Protocolo para Imunohistoquímica e Distribuição In-situ de RNA dentro do Embrião Drosophila Precoce

Explorar mais vídeos