Name: Explantas tumorais derivadas do paciente como uma plataforma pré-clínico viva para prever a resistência a medicamentos em pacientes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprenda a usar explantes tumorais derivados do paciente para testes pré-clínicos de drogas em câncer. Este método preserva a arquitetura 3D do tumor e permite predições precisas de resposta ao tratamento.

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Agradecemos aos cirurgiões e patologistas dos Hospitais Universitários de Leicester NHS Trust por fornecer tecido tumoral ressecado cirúrgico. Agradecemos também à instalação de Histologia dentro dos Serviços de Biotecnologia Core por ajudar no processamento e secção de tecidos FFPE e Kees Straatman pelo apoio com o uso do Vectra Polaris. Esta pesquisa foi apoiada e financiada pelo Consórcio Explant composto por quatro parceiros: A Universidade de Leicester, a Unidade de Toxicologia da MRC, o Cancer Research UK Therapeutic Discovery Laboratories e o LifeArc. Apoio adicional foi fornecido pelo CRUK-NIHR Leicester Experimental Cancer Medicine Centre (C10604/A25151). O financiamento para GM, CD e NA foi fornecido pelo Programa Catalisador do Câncer de Mama Now (2017NOVPCC1066), que é apoiado por financiamento da Pfizer.

Nada para revelar

Este artigo descreve os métodos de geração, tratamento medicamentoso e análise de PDEs e destaca as vantagens da plataforma como um sistema de modelo pré-clínico. A ex-cultura de um tumor recém-ressecado, que não envolve sua desconstrução, permite a retenção da arquitetura tumoral13,24 e, portanto, as interações espaciais dos componentes celulares no TME, bem como a heterogeneidade intratumoral. Este método demonstra como, utilizando um marcador específico do tum...

O desenvolvimento de agentes anticancerígenos eficazes e seguros requer modelos pré-clínicos adequados que também possam fornecer insights sobre mecanismos de ação que possam facilitar a identificação de biomarcadores preditivos e farmacodinâmicos. Heterogeneidade inter e intratumor1,2,3,4,5 e o TME6,7,8,9,10,11,12 são conhecidos por influenciar respostas anticancerígenas, e muitos modelos de câncer pré-clínico existentes, como linhas celulares, organoides e modelos de camundongos não são capazes de acomodar totalmente esses modelos cruciais de medicamentos Características. Um modelo "ideal" é aquele que pode recapitular as complexas interações espaciais de malignos com células não malignas dentro dos tumores, bem como refletir as diferenças regionais dentro dos tumores. Este artigo se concentra nos PDEs como uma plataforma emergente que pode cumprir muitos desses requisitos13.
O primeiro exemplo do uso de PDEs humanos, também conhecidos como histoculturas, remonta ao final da década de 1980, quando Hoffman et al. geraram fatias de tumores humanos recém-ressecados e os cultivaram em uma matriz de colágeno14,15. Isso envolveu o estabelecimento de um sistema de cultura 3D que preservasse a arquitetura tecidual, garantindo a manutenção de componentes estrômicos e interações celulares dentro do TME. Sem desconstruir o tumor original, Hoffman et al.16 anunciaram uma nova abordagem da pesquisa translacional, e desde então, muitos grupos otimizaram diferentes métodos de explantamento com o objetivo de preservar a integridade do tecido e gerar dados precisos de resposta a medicamentos17,18,19,20,21,22,23,24 , embora algumas diferenças entre os protocolos sejam evidentes. Butler et al. cultivaram explanações em esponjas de gelatina para ajudar a difusão de nutrientes e medicamentos através do espécime20,21,25, enquanto Majumder et al. criaram um ecossistema tumoral ao cultivar explants em cima de uma matriz composta de tumor e proteínas estrômicas na presença de soro autólogo derivado do mesmo paciente22, 23.
Mais recentemente, nosso grupo criou um protocolo pelo qual as explanações são geradas pela fragmentação de tumores em peças do tamanho de 2 - 3 mm3que são então colocadas sem componentes adicionais em membranas permeáveis na interface ar-líquido de um sistema de cultura24. Juntos, esses inúmeros estudos demonstraram que os PDEs permitem a cultura de fragmentos vivos intactos de tumores humanos que retêm a arquitetura espacial e a heterogeneidade regional dos tumores originais. Em experimentos originais, explanações ou histoculturas eram geralmente submetidas à homogeneização após o tratamento medicamentoso, após os quais vários ensaios de viabilidade foram aplicados às amostras homogeneizadas, tais como o ensaio de resposta a medicamentos de histocultura20,21, o ensaio MTT (3-(6)-2,5-difeniltetrazolium), o ensaio lactato desidrogenase, ou o ensaio baseado em resazurina26,27,28 . Os recentes avanços nas técnicas de análise de endpoint, particularmente a patologia digital, agora ampliaram o repertório de testes de ponto final e ensaios que podem ser realizados em explants29,30. Para aplicar essas novas tecnologias, em vez de homogeneização, as explicações são fixadas em formalina, incorporadas na parafina (FFPE) e depois analisadas utilizando técnicas de imunossuagem, permitindo o perfil espacial. Exemplos dessa abordagem foram documentados para câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), câncer de mama, o câncer colorretal, e as explanações de mesotelioma pelas quais a coloração imunohistoquímica para o marcador de proliferação, Ki67, e o marcador apoptótico, poli-ADP de poli-ADP (cPARP), foi usada para monitorar alterações na proliferação celular e morte celular24,31,32,33,34.
A imunofluorescência multiplexada é particularmente favorável ao perfil espacial das respostas de medicamentos em explantes no pontofinal 35. Por exemplo, é possível medir a relocalização e a distribuição espacial de classes específicas de células imunes, como macrófagos ou células T, dentro do TME após o tratamento medicamentoso13,36,37,38, e investigar se um agente terapêutico pode favorecer a transição de "tumor frio" para "tumor quente"39 . Nos últimos anos, esse grupo se concentrou na derivação de PDEs de diferentes tipos de tumores (NSCLC, câncer de mama, câncer colorretal, melanoma) e no teste de uma série de agentes anticancerígenos, incluindo quimioterapias, inibidores de pequenas moléculas e inibidores de checkpoint imunológico (ICIs). Os métodos de análise de ponto final foram otimizados para incluir imunofluorescência multiplexada para permitir o perfil espacial de biomarcadores para viabilidade, bem como biomarcadores para diferentes constituintes do TME.

<table><tbody><tr><td><forte>ácido acético</forte></td> <td>reagente de coloração</td> <td>Sigma</td><td>320099</td></tr><tr><td><forte>Diluente/bloco de anticorpos, 1x</forte></td><td>Perkin Elmer</td><td>ARD1001EA</td><td>Diluente/tampão de bloqueio de anticorpos</td></tr><tr><td><forte>Barnstead NANOpure Diamond</forte></td><td>Barnstead</td><td></td><td>Ultra Pure (UP) H2O máquina</td></tr><tr><td><forte> Ácido Cítrico Monohidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7129</td><td>Reagente para tampão citrato</td></tr><tr><td>Costar Placas de Cultura de Células de Poços Múltiplos</td><td>Corning Incorporated</td><td>3516</td><td>6 placa multipoços</td></tr><tr><td>DAPI Dilactato</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>100 x 17 mm Prato, Nunclon Delta</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150350</td><td>Prato de 100 mm de diâmetro para cultura de tecidos</td></tr><tr><td><forte>DMEM (1x) Meio de Eagle Modificado da Dubelcco + 4,5 g/L de D-Glicose + 110 mg/mL de Piruvato de Sódio</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>10569-010</td><td>Meio de cultura de tecidos (500 mL)</td></tr><tr><td>DPX mountant</td><td>VWR</td><td>360294H</td><td>Meio de montagem</td></tr><tr><td>DPX mountant</td><td>Merck</td><td>6522</td><td>Meio de montagem</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3609</td><td>Reagente para tampão TE</td></tr><tr><td>Eosina</td><td>CellPath</td><td>RBC-0100-00A</td><td>Reagente de coloração</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td>Para uso em cultura de tecidos médio</td></tr><tr><td><forte>37% Formaldeído</forte></td><td>Fisher (Acros)</td><td>119690010</td><td>10% Formalina</td></tr><tr><td><forte>iGenix, forno de microondas IG2095</forte></td><td>iGenix</td><td>IG2095</td><td>Microondas usado para retreival de antígeno</td></tr><tr><td><forte>Álcool metilado industrial (IMS)</forte></td><td>Genta Medical</td><td>199050</td><td>99% Álcool desnaturado industrial (IDA)</td></tr><tr><td>InForm Advanced Image Analysis Software</td><td>Akoya Biosciences</td><td>InForm</td><td></td></tr><tr><td>Leica ASP3000 Tissue Processor</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>Automated Vacuum Tissue Processor</td></tr><tr><td>Leica Arcadia H e C</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>Banho de cera incorporado</td></tr><tr><td>Leica RM2125RT</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>Micrótomo rotativo</td></tr><tr><td><forte>Manchador linear Leica ST4040</forte></td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>H& Corante E</td></tr><tr><td><forte>Hematoxilina de Mayer</forte></td><td>Sigma</td><td>GHS132-1L</td><td>Reagente de coloração</td></tr><tr><td><forte>Insertos de Cultura de Células Millicell, 30 mm, PTFE hidrofílico, 0,4 &micro; m</td><td>Merck Milipore</td><td>PICMORG50</td><td>Disco de inserção de cultura organotípica</td></tr><tr><td>Novolink Polymer Detection System</td><td>Leica Biosystems</td><td>RE7150-K</td><td>Kit de coloração DAB</td></tr><tr><td>OPAL 480</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1500001KT</td><td>Fluorophore com diluente de dimetilsulfóxido (DMSO</td></tr><tr><td>)OPAL 520</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1487001KT</td><td>Fluoróforo com diluente de dimetilsulfóxido (DMSO</td></tr><tr><td>)<forte>OPAL 570</forte></td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1488001KT</td><td>Fluoróforo com dimetilsulfóxido (DMSO) diluente</td></tr><tr><td><forte>OPAL 620</forte></td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1495001KT</td><td>Fluoróforo com dimetilsulfóxido (DMSO) diluente</td></tr><tr><td><forte>OPAL 650</forte> </td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1496001KT</td><td>Fluoróforo com diluente de dimetilsulfóxido (DMSO</td></tr><tr><td>)<forte>OPAL 690</forte></td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1497001KT</td><td>Fluoróforo com dimetilsulfóxido (DMSO) diluente</td></tr><tr><td><forte>OPAL 780 / OPALA TSA-DIG Reagente</forte></td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1501001KT</td><td>Fluoróforo com dimetilsulfóxido (DMSO) diluente e reagente TSA-DIG</td></tr><tr><td>Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x</td><td>Perkin Elmer</td><td>ARH1001EA</td><td>HRP</td></tr> <tr><td>polymerPenicilina/estreptomicina solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>11548876</td><td>Para uso em meio de cultura de tecidos</td></tr><tr><td>PhenoChart Whole Slide Contextual Viewer</td><td>Akoya Biosciences</td><td>PhenoChart</td><td>Viewer software para imagens digitalizadas</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td><td>Thermo Scientific Oxoid</td><td>BR0014G</td><td>PBS</td></tr><tr><td>1x Plus Diluente de Amplificação</td><td>Perkin Elmer</td><td>FP1498</td><td>Diluente de Fluoróforo</td></tr><tr><td>Prolong Diamond Antifade Mountant</td><td>Invitrogen</td><td>P36961</td><td>Meio de montagem</td></tr><tr><td>Slide Carrier</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Para carregar slides no Slide Carrier Hotel para escaneamento com Vectra Polaris</td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S/3160/63</td><td>10% Formalina</td></tr><tr><td><forte>Hidróxido de Sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S/4920/53</td><td>Reagente para tampão citrato</td></tr><tr><td>Tenatex Toughened Wax - Rosa (500 g)</td><td>KEMDENT</td><td>1-601</td><td>Cera dental de superfície</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; Rack de slides Shandon Sequenza para centro de imunocoloração</td><td>Fisher Scientific</td><td>10098889</td><td>Holder para slides e clipes de slides</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Plastic Coverplates</td><td>Fisher Scientific</td><td>11927774</td><td>clipes de slide</td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td>Reagente para tampão TE</td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vecta Laboratories</td><td>H-1000-10</td><td>Meio de montagem</td></tr><tr><td>Vectra Polaris Slide Scanner</td><td>Perkin Elmer</td><td>Vectra Polaris</td><td>Slide scanner</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Genta Medical</td><td>XYL050</td><td>Agente de desparafinação</td></tr></tbody></table>

explantas tumorais derivadas do paciente como uma plataforma pré-clínico "viva" para prever a resistência a medicamentos em pacientes

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

A compreensão da resistência a medicamentos e o desenvolvimento de novas estratégias para sensibilizar cânceres altamente resistentes dependem da disponibilidade de modelos pré-clínicos adequados que possam prever com precisão as respostas dos pacientes. Uma das desvantagens dos modelos pré-clínicos existentes é a incapacidade de preservar contextualmente o microambiente tumoral humano (TME) e representar com precisão a heterogeneidade intratumoral, limitando assim a tradução clínica dos dados. Em contraste, representando a cultura de fragmentos vivos de tumores humanos, a plataforma de explante derivada do paciente (PDE) permite que as respostas medicamentosas sejam examinadas em um contexto tridimensional (3D) que espelha as características patológicas e arquitetônicas dos tumores originais o mais de perto possível. Relatórios anteriores com PDEs documentaram a capacidade da plataforma de distinguir quimosensitivos de tumores quimorsistantes, e foi demonstrado que essa segregação é preditiva das respostas dos pacientes às mesmas quimoterapias. Simultaneamente, os PDEs permitem a oportunidade de interrogar características moleculares, genéticas e histológicas de tumores que predizem respostas medicamentosas, identificando assim biomarcadores para estratificação do paciente, bem como novas abordagens intervencionistas para sensibilizar tumores resistentes. Este artigo relata em detalhes a metodologia do PDE, desde a coleta de amostras de pacientes até a análise de ponto final. Fornece uma descrição detalhada dos métodos de derivação e cultura explanta, destacando condições sob medida para tumores específicos, quando apropriado. Para análise de ponto final, há um foco em imunofluorescência multiplexada e imagem multiespectral para o perfil espacial de biomarcadores-chave dentro das regiões tumorais e estrômicas. Ao combinar esses métodos, é possível gerar dados quantitativos e qualitativos de resposta a medicamentos que possam estar relacionados a vários parâmetros clínicopatológicos e, portanto, potencialmente utilizados para identificação de biomarcadores.

A imagem multiespectral de seções histológicas manchadas pelo IFM permite a identificação e fenotipagem de populações celulares individuais e identificação de componentes tumorais e estroma na explanação TME (Figura 2). A imagem multiespectral é particularmente útil para a análise de tecidos com alta autofluorescência intrínseca, como tecido com alto teor de colágeno, pois permite que o sinal de autofluorescência seja desconvoluído de outros sinais e excluído da análise subsequente. A subseq...

Este artigo descreve métodos para a geração, tratamento medicamentoso e análise de explants derivados do paciente para avaliar as respostas de medicamentos tumorais em um sistema modelo pré-clínico vivo, relevante para o paciente.

Explantas tumorais derivadas do paciente como uma plataforma pré-clínico "viva" para prever a resistência a medicamentos em pacientes

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

As explantas derivadas do paciente são um método de curto prazo que fornece dados imediatos de resposta a medicamentos que podem prever com precisão os resultados dos pacientes. As plataformas PD permitem que as respostas medicamentosas sejam examinadas em um contexto 3D que espelha as características patológicas e arquitetônicas dos tumores regionais o mais próximo possível. Explantas têm o potencial de oferecer novas percepções sobre o metabolismo e mecanismo de ação de uma droga e facilitar a identificação de novos biomarcadores farmacodinâmicos.Antes de iniciar o experimento, limpe todos os equipamentos cirúrgicos com solução de 70% de espíritos metilados industriais. Encha um prato de cultura de 10 centímetros com 25 mililitros de meio fresco no gelo. Usando pinças, transfira a amostra para uma superfície de cera dentária e use duas lâminas de enxerto de pele para cortar o tecido em fragmentos de aproximadamente dois a três milímetros cúbicos.Transfira as explantas em uma antena de 10 centímetros e coloque de seis a nove pedaços do tecido em um tubo de um mililitro contendo uma solução de formalina 10% não tamponada para uma incubação de 24 horas à temperatura ambiente. Encha o número desejado de poços de uma placa de seis poços com 1,5 mililitros de meio fresco por poço. E coloque um prato de inserção de cultura organotípica em cada poço para que ele flutue em cima do meio.Coloque de seis a nove explantes em cada disco de inserção e armazene para uma incubação de 16 horas em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% para permitir a recuperação. No dia seguinte, adicione meio fresco e droga a cada poço de uma nova placa. Inclua um poço para o controle do veículo.Quando todos os tratamentos medicamentosos tiverem sido preparados, use pinças para transferir uma inserção para cada poço da nova placa de seis poços para uma incubação de 24 a 48 horas na incubadora de dióxido de carbono. Após o tratamento da droga, transfira os discos para novas seis placas de poço contendo 10% de formalina. E adicione algumas gotas de 10% de formalina ao topo de cada explanta para garantir cobertura completa com o fixador por 24 horas de incubação à temperatura ambiente.No dia seguinte, mergulhe um número apropriado de pequenas esponjas de histologia em 70% solução metilada industrial. E coloque as esponjas dentro de histologia. Quando todas as esponjas tiverem sido colocadas, transfira todas as explantas da mesma condição de tratamento medicamentoso para uma única esponja com o lado tratado da droga de cada explanta entrando em contato com o disco inserido.Coloque outra esponja presoaked em cima de cada explanta e feche o para fixar as explantas no. Em seguida, submergir as fitas em solução metilada 70% industrial antes de prosseguir com o processamento histológico. Após a varredura, realize uma análise de treinamento e carregue as varreduras contendo os selos para treinamento no software de análise adequado.Em uma visão de modo único, navegue pelas imagens e selecione as varreduras para analisar e a varredura com fluorescência intrínseca. com a fluorescência intrínseca em uma única exibição, clique no catador de autofluorescência para desenhar um segmento em uma área de tecido não manchado. Clique em editar marcadores e cores e digite os nomes dos marcadores na caixa associadas a cada fluoróforo.Clique em preparar imagens para permitir que o software subtraia a intensidade da fluorescência intrínseca de todas as imagens enviadas. Clique no passo do tecido do segmento em cima da tela para abrir a janela de treinamento de segmentação de tecidos. No painel categorias teciduais, digite o nome de cada categoria de tecido a ser segmentado.Clique em desenhar, para desenhar regiões em torno de grupos de células na categoria tecidual de interesse. Em seguida, mude para a próxima categoria de tecido e desenhe novas regiões. Quando todas as regiões de treinamento forem definidas, use o segmentador de tecido de trem e aguarde a precisão do treinamento para se estabelecer.Possivelmente para um valor próximo a 100% Clique segmento tudo para segmentar os tecidos. Após verificar a qualidade da segmentação tecidual, clique na segmentação celular e selecione os compartimentos celulares para o segmento. Para configurar o componente nuclear, use o controle deslizante de intensidade típico para ajustar o limiar usado para detectar os pixels nucleares.O feedback ao vivo é fornecido pela janela de visualização. Para dividir os clusters de pixels nucleares, no painel de divisão de componentes nucleares, selecione o botão que melhor descreve a qualidade de coloração dos núcleos e use a barra de controle deslizante para ajustar a sensibilidade de divisão. Em seguida, clique no segmento tudo para segmentar todas as imagens.Quando todas as imagens tiverem sido segmentadas, no painel de fenótipos, adicione a lista de fenótipos a serem detectados e insira o nome dos fenótipos na caixa de texto correspondente. Clique em editar fenótipos para selecionar uma célula específica e selecione o fenótipo correspondente no menu suspenso. Após concluir a seleção para treinamento, clique no classificador de trem para avaliar o resultado de cada fenótipo.Proceda com o fenótipo de todos, salve o projeto e clique em exportar. Selecione a guia de análise em lote e carregue o projeto no algoritmo do lote ou na caixa do projeto. Para exportar as imagens e tabelas, selecione todas as caixas nas opções de exportação, clique em adicionar slides e carregue todas as imagens contendo os selos dos lotes previamente preparados.Em seguida, clique em executar para a análise do lote inicial de um selo e exporte os dados correspondentes quando ele tiver sido adquirido. A imagem multiespectral do tecido explant NSCLC manchado para marcadores de viabilidade celular, permite a identificação e fenotipagem de populações celulares individuais, bem como a identificação de tumores e componentes estrômicos dentro do micro ambiente tumoral explant. A segmentação de tecidos e células do marcador de viabilidade celular mancha imagens multiespectrais como demonstrado, pode ser usada para quantificar a morte celular e a proliferação em explantas derivadas do paciente tratadas com drogas de interesse.Por exemplo, nesta análise, em amostras de tecidos de tumores tratados com Nivolumab, um maior número de células moribundas foram identificadas em comparação com as amostras de tumores tratados de controle. Além disso, como ilustrado, a capacidade de extrair informações espaciais a partir de dissecções manchadas, permite o cálculo das distâncias intercélulas. Explantas também podem ser usadas para perfis espaciais extensos ou citometria em massa, o que permite que centenas de biomarcadores sejam perfilado simultaneamente em resolução subsidiária, preservando a estrutura 3D da amostra.Os PDs poderiam prever a eficácia da imunoterapia. Por exemplo, poderia ser possível distinguir casos sensíveis ou resistentes aos inibidores de checkpoint imunológicos e investigar os mecanismos que sustentam essa distinção.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Aqui, nós estabelecemos um método para testar a eficácia de drogas com espécimes cirúrgicos dos tumores cerebrais, denominado "método de explante tumor". Com este método, podemos avaliar a eficácia da droga, sem quebrar o microambiente de tumores sólidos. Para validar a confiabilidade deste método, descrevemos dados representativos com nosso exemplar glioma tratadas com o agente de primeira linha atual quimioterápicos, a temozolomida.

Método para Desenvolvimento de Drogas Anti-Câncer Novel utilizando explantes Tumor de espécimes cirúrgicos

Linhas celulares de cancro estabelecidos e xenotransplantes têm sido o esteio da pesquisa do câncer para as últimas décadas. No entanto, evidências recentes sugerem que a resposta terapêutica é muito influenciada pelo microambiente de células tumorais. Portanto, foi desenvolvida uma análise ex vivo de amostras de tumor primário para fins de desenvolvimento de drogas.

Ex Vivo resposta ao tratamento de tumores primários e / ou Associated Metástases para pré-clínica e clínica de Desenvolvimento Therapeutics

Utilizando tumores derivados do paciente em um modelo pré-clínico subcutânea é uma excelente maneira de estudar a eficácia de novas terapias, a descoberta de biomarcadores preditivos, e vias resistentes aos medicamentos. Este modelo, no processo de desenvolvimento de medicamentos, é essencial para determinar o destino de muitas terapias anti-cancro novos antes da investigação clínica.

Desenvolvimento e manutenção de um tumor do paciente pré-clínica Derivado Xenoenxerto Modelo de Investigação de Novel Anti-Cancer Therapies

Para permitir a detecção altamente sensível do câncer colorretal humano divulgação células (CRC) colonizar os tecidos, mostramos aqui um protocolo para transdução eficiente de particulas de Lentivirus de proteína verde fluorescente (GFP) em células de organoides CRC PDX-derivado antes da sua injeção em ratos destinatários, com a observação microscópica de estéreo-fluorescência.

Deteção de alta sensibilidade de Micrometastases gerado pelo Organoids GFP de Lentivirus-transfectadas cultivadas de um Tumor de cólon derivado de paciente

Nós fornecemos um método para a geração, cultivo e análise sistemática de fatias de organotypic derivadas de tumores de pulmão murino. Descrevemos também como otimizar para espessura da fatia e como selecionar as concentrações de drogas para tratar a fatias de tumor.

Estabelecimento e análise do Tumor fatia Explants como um pré-requisito para o teste de diagnóstico

Os modelos paciente-derivados do xenograft (PDX) mais robustamente recapitular características moleculares e biológicas da melanoma e são mais preditivos da resposta da terapia comparada aos ensaios cultura-baseados tradicionais do tecido plástico. Aqui nós descrevemos nosso protocolo de funcionamento padrão para o estabelecimento de modelos novos de PDX e a caracterização/experimentação de modelos existentes de PDX.

Um modelo de Xenoenxerto derivado do paciente com melanoma

Aqui apresentamos um protocolo para testar a eficácia de terapias-alvo selecionadas com base na composição genômica de um tumor. O protocolo descreve a identificação e validação de rearranjos estruturais de DNA, o enxerto dos tumores dos pacientes em camundongos e as respostas de teste a medicamentos correspondentes.

Testando terapias-alvo em câncer usando análise estrutural de alteração de DNA e xenoenxertos derivados do paciente

Introduzimos um protocolo para medir a resposta de drogas em tempo real em fatias organotípicas de tecido tumoral. A estratégia experimental aqui delineada fornece uma plataforma para realizar telas de medicamentos de médio-alto consumo em fatias de tecido derivadas de tumores clínicos ou de camundongos em condições ex-vivos.

Medição da resposta de drogas em tempo real em fatias de tecido tumoral organotípico

Modelos de xenoenxerto derivados da paciente (PDX) e modelos transplantáveis de camundongos geneticamente modificados recapitulam fielmente a doença humana e são modelos preferidos para pesquisas básicas e translacionais sobre câncer de mama. Aqui, um método é descrito para transplantar ortotopicamente fragmentos de tumor de mama na almofada de gordura mamária para estudar biologia tumoral e avaliar a resposta medicamentosa.

Transplante Ortotópico de Tumores mamários como Modelos Pré-Clínicos para o Câncer de Mama

Um método é descrito para criar organoides usando xenoenxertos derivados do paciente (PDX) para triagem in vitro, resultando em pares combinados de modelos in vivo/in vitro. Os tumores PDX foram colhidos/processados em pequenos pedaços mecanicamente ou enzimáticamente, seguidos pelo método dos Clevers para cultivar organoides tumorais que foram passagem, criopreservados e caracterizados contra o PDX original.

Criando pares de modelos derivados do paciente in vivo/in vitro de PDX e Organoides Derivados de PDX para pesquisa de farmacologia do câncer

Este protocolo descreve uma avaliação padronizada da sensibilidade medicamentosa a inibidores de sinalização direcionados em modelos organoides derivados do paciente NSCLC.

Sensibilidade de perfil a terapias-alvo em organoides derivados do paciente NSCLC EGFR-Mutant

Aprenda a usar explantes tumorais derivados do paciente para testes pré-clínicos de drogas em câncer. Este método preserva a arquitetura 3D do tumor e permite predições precisas de resposta ao tratamento.

Explantas tumorais derivadas do paciente como uma plataforma pré-clínico viva para prever a resistência a medicamentos em pacientes (Vídeo) | JoVE Journal

Explantas tumorais derivadas do paciente como uma plataforma pré-clínico "viva" para prever a resistência a medicamentos em pacientes

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