Imagem 4-Dimensional da Morfogense da Copa Óptica de Zebrafish

Este protocolo descreve uma abordagem para rotulagem e imagem multidimensional de zebrafish desenvolvimento precoce dos olhos. Descrevemos rotulagem, incorporação e imagens quadridimensionais (4D) usando microscopia confocal de varredura a laser, e considerações para otimizar a aquisição de conjuntos de dados para dissecção de mecanismos de morfogênese de copo óptico.

Nossa compreensão da morfogênese ocular vem de estudos anteriores de tecido fixo. No entanto, esses estudos careciam de dinâmica celular e tecidual. Usando imagens de lapso de tempo, somos capazes de capturar todo esse processo para visualização e análise.

Nosso método que aproveita o desenvolvimento externo na clareza óptica dos embriões de zebrafish, que facilitam a imagem ao vivo, e usa microscopia confocal de varredura a laser que está prontamente disponível na maioria dos campi de pesquisa. Os pesquisadores novos neste método devem esperar alguma tentativa e erro antes de obter um conjunto de dados utilizável. Muitos passos, especialmente as injeções e incorporação, devem ir bem para o sucesso, por isso tenha paciência.

Uma vez que o zebrafish comece a procriar, enquanto espera de 15 a 20 minutos para garantir que os ovos se tornem fertilizados, use uma pipeta P10 e pontas de microliter P10 para trás carregar uma agulha de micro injeção capilar de vidro puxada com 2,5 a 5 microliters da diluição de RNA de interesse. Quando os ovos estiverem prontos, use uma pipeta de transferência e um microscópio dissecando para carregar cuidadosamente os ovos no molde de injeção, usando fórceps para rolar os embriões de tal forma que a única célula seja visível conforme necessário. Em seguida, injete todos os embriões no estágio de uma célula, visando a célula e não a gema para garantir uma rotulagem uniforme do embrião em desenvolvimento.

Em cerca de 11 horas após a fertilização, coloque uma alíquota de um a cinco mililitros de 1,6% de derretimento baixo em meio E3 em um bloco de calor de 42 graus Celsius e use um microscópio de fluorescência para testar embriões injetados com sucesso com um brilho geral de floresnce. Conte os somites para encenar adequadamente os embriões. Em 11 horas após a fertilização, três somitas devem ser observadas.

Uma amostra ideal terá fortes sinais EGFP e mCherry e estará no estágio correto de desenvolvimento. Antes de montar, coloque os embriões em um prato revestido de ágar e use fórceps para remover o acorde de cada embrião. Quando todos os embriões forem desnudados, use uma pipeta de rolo de vidro para aspirar um embrião.

Ejete o máximo de E3 possível para que o embrião fique na ponta da pipeta Pasteur de vidro e solte o embrião no tubo de agarose do bloco de calor. Deixe os embriões afundarem na agarose por alguns segundos antes de aspirar um pequeno volume de agarose junto com o embrião, tomando cuidado para que o embrião permaneça na ponta da pipeta. Ejete o embrião e agarose em uma gota de agarose em um prato de fundo de vidro e use rapidamente, mas cuidadosamente, fórceps para orientar o lado dorsal do embrião para baixo antes que a gota agarose endureça.

Depois de montar de 10 a 12 embriões da mesma maneira, adicione agarose suficiente para cobrir completamente o fundo do prato envolvendo todas as gotículas em um único disco de agarose. Quando a agarose endureceu, a camada E3 sobre a agarose para manter as amostras hidratadas. Depois de definir o microscópio confocal de varredura a laser para os parâmetros apropriados para a imagem de lapso de tempo, reveste liberalmente a parte inferior do vidro com meio de imersão correspondente ao índice de refração da água, tomando cuidado para evitar bolhas de ar, e aplique uma pequena gota de meio de imersão ao objetivo de água 40X.

Fixar a placa de fundo de vidro na inserção do palco e adicionar meio E3 adicional para manter os embriões úmidos durante a noite. Use argila de modelagem para selar a tampa de plástico sobre o prato e elevar o objetivo de fazer contato com o prato. Sob a posição do software de microscópio, clique em adicionar para salvar as informações XYZ da primeira amostra a serem lapsadas por tempo e selecione uma amostra com uma fluorescência forte e montagem ideal.

Na guia localizar, procure a próxima amostra e clique na posição e adicione para selecionar a amostra conforme demonstrado. Quando todas as amostras tiverem sido selecionadas, destaque a primeira posição e clique em mover-se para. Ao digitalizar continuamente, foreça a vesícula óptica dentro do quadro, deixando amplo espaço nas regiões anterior e distal em relação à vesícula óptica e cérebro.

Para atribuir a primeira e última fatias Z, selecione definir primeiro e definir por último enquanto se move através da direção Z com o botão de foco fino, mantendo um número total de fatia de cerca de 63 para acomodar o crescimento do copo óptico. Inclua espaço extra no lado ventral do vesículo óptico para permitir espaço para crescimento. Uma vez que as primeira e últimas fatias Z tenham sido definidas, clique em C para mover-se para o centro da pilha Z e ajustar a potência do laser e ganhar para ambos os lasers.

Quando a potência e o ganho do laser tiverem sido definidos, pare a varredura e clique em atualizar as informações de posição. Para passar para a próxima posição, clique na posição dois. Uma vez definidas as primeiras e últimas fatias Z como demonstrado, abra a direção da série temporal e defina o número de ciclos para 300 e o intervalo de tempo para 2,5 minutos.

Depois de revisar as configurações para ter certeza de que tudo está finalizado, clique em começar o lapso de tempo e confirme que a primeira rodada de imagem é capturada corretamente antes de permitir que o lapso de tempo seja executado durante a noite. A injeção direta na célula única é necessária para uma rotulagem uniforme e uma fluorescência robusta. Após sua imersão em agarose, os embriões devem ser espaçados uniformemente por todo o prato.

Se os embriões forem encenados corretamente, suficientemente fluorescentes e adequadamente montados, permanecerão no quadro de imagem durante o lapso de tempo, permitindo que todo o órgão seja imageado. Amostras que não são orientadas ao longo do eixo dorsal, como as horizontais ou diagonais, crescerão fora do quadro de imagem à medida que o lapso de tempo prossegue e não podem ser usadas para análises posteriores. Um embrião que é sobre-girado resultará em um lapso de tempo mais posterior.

Um embrião que é sub-girado permitirá apenas o tecido mais anterior ser observado. Além disso, amostras que são montadas com relação à orientação do quadro são mais propensas a produzir um lapso de tempo bem sucedido. Este viés em direção ao lado ventral fornece espaço extra para o crescimento do tecido na direção ventral, resultando em um lapso de tempo ideal.

Quando esses critérios não forem atendidos, o lapso de tempo não capturará mais todo o volume 3D do tecido à medida que se desenvolve e não pode ser usado para análises posteriores. Esses conjuntos de dados ricos em informações podem ser analisados de muitas maneiras, incluindo rastreamento de células 4D com quantificações de velocidade e trajetória celular, medições de volume de células e tecidos e visualizações 3 e 4D.