Triagem Genética para Identificação de Supressores Multicópia em Schizosaccharomyces pombe

As telas supressoras identificam interações genéticas que lançariam luz sobre as funções do gene de interesse, bem como as vias e processos biológicos em que eles podem estar envolvidos in vivo. Esta técnica pode identificar uma relação genética entre dois produtos genéticos que podem não ter sido demonstrados usando outras abordagens. Os resultados de tais telas em leveduras podem ser estendidos a organismos eucarióticos elevados, uma vez que a maioria das vias e processos biológicos fundamentais são conservados ao longo da evolução.

O sucesso do esquema depende da disponibilidade, de alta qualidade e da alta eficiência de sua transformação em células de levedura. Assim, protocolo de transformação com o plasmídeo antes de Grow the Schizosaccharomyces pombe ell1 deformação de deleção a 32 graus Celsius em placa média YE. Pegue um laço cheio de cepa mutante ell1 da placa, inocular cinco mililitros de meio YE suplementado e, em seguida, incube o frasco para injetáveis enquanto agita a 32 graus Celsius durante a noite.

Após a incubação, diluir a cultura de crescimento durante a noite em 100 mililitros de meio YE fresco contendo os suplementos desejados para atingir 0,3 densidade óptica a 600 nanômetros. Incubar o meio a 32 graus Celsius enquanto agita a 200 a 550 RPM até que a densidade óptica a 600 nanômetros atinja a fase intermediária. Depois de dividir os 100 mililitros de cultura em dois tubos de centrífuga de 50 mililitros, pellet as células a 4.000 vezes G por 10 minutos à temperatura ambiente.

Uma vez que o sobrenadante é descartado, ressuspenda o pellet celular em um mililitro de água estéril. Centrifugar e descartar o sobrenadante mais uma vez e, em seguida, ressuspender o pellet celular em um mililitro de acetato de lítio TE. Pellet a célula por centrifugação e ressuspender cada pellet celular em 250 microlitros de acetato de lítio TE. Em seguida, transfira 125 microlitros das células competentes em quatro tubos de microcentrífuga estéreis diferentes para as etapas subsequentes de transformação. Ferva o DNA transportador de testículos de salmão ou esperma de arenque por um minuto e coloque imediatamente o tubo no gelo.

Para cada transformação, adicione 10 microlitros de DNA transportador de fita simples ao tubo de microcentrífuga contendo 125 microlitros das células competentes e misture suavemente por pipetagem. Subsequentemente, adicionar 50 microgramas da biblioteca de cDNA de Schizosaccharomyces pombe ao tubo contendo células competentes e mistura de DNA portador. Depois de incubar o tubo à temperatura ambiente durante 10 minutos, adicionar 260 microlitros de solução de acetato de polietilenoglicol-lítio e misturar por pipetagem.

Incubar o tubo que contém a mistura de transformação a 32 graus Celsius durante duas horas sem agitar. Adicione 43 microlitros de sulfóxido de dimetilo pré-aquecido ao tubo e misture suavemente. Agora, exponha o tubo ao choque térmico a 42 graus Celsius por cinco minutos.

Pellet as células e descartar o sobrenadante como demonstrado anteriormente e, em seguida, pipetar para fora a solução residual de acetato de polietilenoglicol lítio TA. Ressuspeite as células em 100 microlitros de água estéril e coloque-as em uma placa EMM2 contendo os suplementos necessários e 0,2 microgramas por mililitro de 4-NQO. Em seguida, permita que as colônias apareçam nas placas incubando as placas a 32 graus Celsius por cinco a seis dias.

Para triagem adicional, listrar as colônias obtidas na mesma placa média na presença de 0,2 microgramas por mililitro de 4-NQO. Para um experimento de transformação de biblioteca, use 500 microlitros de células competentes para transformação e placa 1 por 10 da mistura de transformação em placa EMM2 com suplementos necessários sem 4-NQO para calcular o número total de clones de biblioteca obtidos após a transformação e triagem para os clones supressores. Adicione 100 a 200 microlitros de água estéril a cada poço de uma placa de microtitulação estéril de 96 poços.

Usando um palito de dente estéril ou uma ponta de micropipeta de 20 a 200 microlitros, escolha uma pequena quantidade de inóculo de cada colônia obtida após a transformação da biblioteca de cDNA na placa contendo 4-NQO. Adicione o inóculo de cada uma das diferentes colônias em cada poço da placa contendo água estéril e misture bem. Identifique três microlitros da suspensão celular de cada poço em placas de ágar EMM2 e adicione concentrações apropriadas de 4-NQO às placas.

Depois de cultivar as células a 32 graus Celsius por três a quatro dias, identifique as colônias que mostram crescimento em diferentes concentrações de 4-NQO como supressores putativos. Para validar ainda mais os supressores, cultive os supressores selecionados e as cepas de controle apropriadas em meio EMM2 contendo 225 microgramas por mililitro de adenina e uracilo a 32 graus Celsius durante a noite com agitação. Após o final da incubação, diluir as células para uma densidade óptica de 0,3 em meio EMM2 fresco e cultivá-las enquanto agita a 32 graus Celsius até a fase intermediária.

Detectar diluições seriadas apropriadas de culturas em placas EMM2 com os suplementos necessários contendo 0,4 micromolar 4-NQO ou 0,01%MMS. Para controle, identifique as cepas em uma placa EMM2 com os suplementos necessários, mas sem qualquer agente prejudicial ao DNA. Incube as placas a 32 graus Celsius por três a cinco dias para monitorar o crescimento.

Observe as cepas mutantes transformadas com o gene de comprimento total de interesse ou vetor vazio como controles positivos e negativos, respectivamente, juntamente com os transformadores de biblioteca. Inocular uma única colônia de levedura em meio EMM2 contendo 225 microgramas por mililitro de adenina e uracilo e crescer as células a 32 graus Celsius durante a noite com agitação a 200 a 250 RPM. No final da incubação, colher a cultura de 10 mililitros de densidade óptica 0,5 por centrifugação a 4.000 vezes G por dois minutos à temperatura ambiente.

Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 0,2 mililitros de tampão de lise. Adicionar 0,2 mililitros de álcool isoamílico de clorofórmio fenol e 0,3 gramas de contas de vidro lavadas com ácido ao tubo de microcentrífuga. Misture o tubo por vórtice por dois minutos, seguido de incubação no gelo por um minuto.

Centrifugar o tubo a 10.000 vezes G durante 15 minutos à temperatura ambiente. Transfira a camada aquosa superior para um tubo de microcentrífuga fresco e adicione 200 microlitros de álcool isoamílico de clorofórmio fenol. Depois de centrifugar novamente a 10.000 vezes G por 10 minutos, transfira a camada aquosa superior para um tubo fresco.

Em seguida, adicione dois volumes de etanol a 100% e 1 por 10 volume de acetato de sódio ao tubo e incube a menos 70 graus Celsius por uma hora. Precipitar o ADN por centrifugação a 10 000 vezes G durante 15 minutos a quatro graus Celsius e remover o sobrenadante. Lave o pellet de DNA com etanol a 70% e seque ao ar livre à temperatura ambiente.

Ressuscite o DNA em 20 microlitros de água estéril e use de três a cinco microlitros de DNA plasmídico para transformar células competentes de Escherichia coli. Usando o protocolo padrão, transforme os plasmídeos de levedura isolados em cepa TOP10 de Escherichia coli e espalhe as células em placas LB com antibióticos necessários. Depois de isolar o plasmídeo dos transformadores de Escherichia coli usando o protocolo padrão de lise alcalina, siga as combinações apropriadas de enzimas de restrição para verificar a liberação do fragmento de DNA inserido por digestão de restrição.

Em seguida, retransforme os plasmídeos mostrando liberação de inserção após a digestão de restrição na cepa de deleção ell1 para verificar sua capacidade de resgatar o fenótipo genotóxico sensível ao estresse da cepa de deleção ell1. A cepa de pombe Schizosaccharomyces deletada por ell1 mostrou sensibilidade em relação ao 4-NQO em comparação com a cepa do tipo selvagem. Um grande número de colônias é obtido na placa sem 4-NQO.

No entanto, menos transformadores foram obtidos na placa 4-NQO, pois atuam como supressores punitivos da sensibilidade 4-NQO do mutante nulo ell1. Dos 620 transformadores, 74 apresentaram crescimento em 4-NQO micromolar 0,4. Observou-se que apenas 16 dos 74 apresentaram crescimento na presença de 4-NQO 0,8-micromolar.

A cepa de deleção ell1 se transformou com um vetor vazio e todos os 16 transformadores apresentaram crescimento na placa sem 4-NQO. O mutante de deleção ell1 contendo apenas o vetor vazio não apresentou crescimento em 0,8-micromolar 4-NQO e seis transformadores apresentaram crescimento em 0,8-micromolar 4-NQO, sugerindo que os clones de biblioteca presentes neles poderiam suprimir o fenótipo de estresse genotóxico do mutante nulo ell1. A digestão de restrição do plasmídeo supressor 84 e 104 liberou uma inserção de uma quilobase e 800 pares de bases, respectivamente.

A reintrodução dos clones plasmídeos supressores no mutante nulo ell1 resultou na supressão da sensibilidade de crescimento associada ao 4-NQO. No entanto, na presença de MMS, os plasmídeos supressores contendo o mutante de deleção ell1 apresentaram maior crescimento do que aqueles com vetor vazio. Essas telas genéticas podem delinear potenciais mecanismos de resistência e identificar alvos proteicos de novos compostos antibacterianos, antifúngicos, antiparasitários ou anticancerígenos.

Eles também podem identificar o mecanismo de ação das drogas farmacêuticas.