Name: Triagem Genética para Identificação de Supressores Multicópia em Schizosaccharomyces pombe (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: Aprenda a realizar triagem genética de supressores multicópia em Schizosaccharomyces pombe para identificar interações genéticas com o mutante ell1. Este método revela vias biológicas conservadas.

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Este trabalho foi financiado por uma bolsa de pesquisa do Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia (Grant No. BT/PR12568/BRB/10/1369/2015) a Nimisha Sharma. Os autores agradecem ao Prof. Charles Hoffman (Boston College, EUA) pelo presente da biblioteca de cDNA de S. pombe e à Profª Susan Forsburg pelos plasmídeos de levedura.

1. Transformação da biblioteca cDNA na cepa mutante de consulta S. pombe para triagem de supressores de multicópia
NOTA: O método padrão de acetato de lítio27 foi seguido para transformar a biblioteca de cDNA de S. pombe na cepa de consulta S. pombe ell1Δ com algumas modificações:
<ol><li>Cultivar a cepa de S. pombe ell1Δ a 32 °C em uma placa de meio YE (Tabela 1) suplementada com 225 μg/mL de adenina, leucina e uracilo cada. Inocular uma alça cheia de inóculo da cepa ell1Δ da placa acima em 15-20 mL de meio YE suplementado com 225 μg/mL cada de adenina, leucina e uracila. Incubá-lo durante a noite a 32 °C com agitação (200-250 rpm).</li>
	<li>No dia seguinte, diluir a cultura noturna em 100 mL de meio YE fresco com os suplementos desejados a uma OD de 600 nm (densidade óptica a600 nm) de 0,3 e incubá-la a 32 °C com agitação a 200-250 rpm até que a OD600 nm atinja a fase intermediária.</li>
	<li>Divida a cultura de 100 mL em dois tubos de centrífuga de 50 mL, seguidos de centrifugação à temperatura ambiente por 10 min a 4.000 × g.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante e lave o pellet celular com 1 mL de água estéril, ou seja, ressuspenda as células em 1 mL de água estéril e centrifugar a 4.000 × g por 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Rejeitar o sobrenadante e lavar cada pellet celular com 1 ml de solução de 1x LiAc-TE (acetato de lítio 100 mM, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5), conforme descrito no passo 1.4.</li>
	<li>Remova o sobrenadante e ressuspenda cada pellet celular em 250 μL de 1x LiAc-TE. Use estas células competentes de S. pombe (500 μL) para transformação com o DNA de interesse. Transferir 125 μL das células competentes para quatro tubos de microcentrífuga estéreis diferentes para as etapas de transformação subsequentes.</li>
	<li>Ferva o DNA transportador de testículos de salmão ou esperma de arenque por 1 min e coloque imediatamente no gelo. Para cada transformação, adicionar 10 μL de 10 mg/mL de DNA transportador desnaturado de fita simples ao tubo de microcentrífuga contendo 125 μL das células competentes, seguido de uma mistura suave usando uma ponta de micropipeta. Subsequentemente, adicionar 50 μg da biblioteca de cDNA de S. pombe ao tubo de microcentrífuga contendo mistura de DNA portador de células competente.</li>
	<li>Incubar os tubos de microcentrífuga à temperatura ambiente durante 10 min e, em seguida, adicionar 260 μL de solução de acetato de polietilenoglicol-lítio (40% [p/v] PEG 4.000, acetato de lítio 100 mM, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5) aos tubos e misturar suavemente com a ajuda de uma ponta de micropipeta.</li>
	<li>Incubar os tubos de microcentrífuga que contêm a mistura de transformação a 32 °C durante 2 h sem agitar. Adicione 43 μL de sulfóxido de dimetilo pré-aquecido (DMSO) ao tubo de microcentrífuga e misture suavemente. Subsequentemente, expor os tubos a choques térmicos a 42 °C durante 5 min.</li>
	<li>Pellet as células a 4.000 × g durante 5 min à temperatura ambiente. Rejeitar o sobrenadante e remover a solução residual de PEG-LiAc-TE com a ajuda de uma ponta de micropipeta.</li>
	<li>Ressuspender as células em 100 μL de água estéril e placa em uma placa EMM2 (Tabela 1) (150 mm) com os suplementos necessários e 0,2 μg/mL de 4-NQO.</li>
	<li>Incubar as placas a 32 °C durante 5-6 dias para permitir que as colónias apareçam nas placas. Estrie as colônias obtidas na mesma placa média na presença de 0,2 μg/mL de 4-NQO e use para triagem adicional.</li>
	<li>Para um experimento de transformação de biblioteca, use 500 μL de células competentes (125 μL de células competentes x 4 tubos de microcentrífuga) para transformação, conforme descrito nas etapas 1.8 a 1.14 acima.</li>
	<li>Como controle, placa 1/10 da mistura de transformação em uma placa EMM2 (150 mm) com suplementos necessários, mas sem 4-NQO, para calcular o número total de clones de biblioteca obtidos após a transformaçãoda biblioteca e triagem para isolamento dos clones supressores.</li>
</ol>2. Testar e validar o resgate/supressão do fenótipo associado à cepa mutante de consulta pelo supressor putativo
NOTA: Ensaios de ponto de estresse foram realizados conforme descrito abaixo para testar e validar o resgate/supressão da sensibilidade ao estresse 4-NQO associada à deleção ell1 pelo(s) supressor(es) putativo(s).
<ol><li>Adicione 100-200 μL de água estéril em cada um dos diferentes poços de uma placa de microtitulação estéril de 96 poços.</li>
	<li>Pegue uma pequena quantidade de inóculo de cada uma das diferentes colônias obtidas após a transformação da biblioteca de cDNA na placa contendo 4-NQO usando um palito de dente estéril ou uma ponta de micropipeta de 20-200 μL. Adicionar o inóculo de cada uma das diferentes colónias em poços independentes separados da placa de microtitulação contendo 100-200 μL de água estéril. Homogeneizar.</li>
	<li>Spot 3 μL da suspensão celular de cada poço em placas de ágar EMM2 contendo adenina (225 μg/mL) e uracilo (225 μg/mL), mas sem leucina (o marcador auxotrófico selecionável presente no vetor plasmidial utilizado para a construção da biblioteca utilizada neste trabalho). Adicione concentrações apropriadas de 4-NQO às placas, conforme necessário.</li>
	<li>Incubar as placas a 32 °C durante 3-4 dias para permitir que as células cresçam. Identifique as colônias que mostram crescimento na presença de diferentes concentrações de 4-NQO como supressores putativos.</li>
	<li>Para validar ainda mais os supressores, cultive os supressores selecionados juntamente com cepas de controle apropriadas durante a noite a 32 °C com agitação (200-250 rpm) em meio EMM2 contendo 225 μg/mL cada de adenina e uracilo mas sem leucina.</li>
	<li>No dia seguinte, diluir as células para uma OD de 600 nm de 0,3 em meio EMM2 fresco e cultivá-las a 32 °C com agitação até a fase intermediária (aproximadamente OD600 nm de 0,6-0,8).</li>
	<li>Detectar diluições seriadas apropriadas (1:10 ou 1:5) de culturas em placas EMM2 com suplementos necessários contendo 0,4 μM 4-NQO ou 0,01% MMS. Para controle, identifique as cepas em uma placa EMM2 com os suplementos necessários, mas sem qualquer agente prejudicial ao DNA.</li>
	<li>Incubar as placas a 32 °C durante 3-5 dias para monitorizar o crescimento. NOTA: Ensaios adequados com base no fenótipo associado à cepa mutante de consulta devem ser usados para testar o resgate ou supressão do fenótipo. Por exemplo, se os supressores de um fenótipo sensível ao frio de uma cepa mutante de consulta precisarem ser identificados, o ensaio para teste e validação dos clones supressores envolveria o crescimento de transformadores a baixa temperatura.</li>
	<li>Observe as cepas mutantes transformadas com o gene de interesse de comprimento total (Spell1 neste caso) ou vetor vazio como controles positivos e negativos, respectivamente, juntamente com os transformadores da biblioteca.</li>
</ol>3. Isolamento do plasmídeo dos clones supressores de S. pombe 
NOTA: O isolamento plasmídico de S. pombe foi realizado seguindo o protocolo descrito em Fissão levedura: um manual de laboratório28 com algumas modificações.
<ol><li>Inocular uma única colónia de levedura em meio EMM2 contendo 225 μg/ml de adenina e uracilo e cultivar as células durante a noite a 32 °C com agitação a 200-250 rpm. No dia seguinte, colha 5 células O.D. (ou seja, 10 mL de cultura de O.D. 0,5) por centrifugação por 2 min a 4.000 × g à temperatura ambiente.</li>
	<li>Remova o sobrenadante e ressuspenda a pastilha celular em 0,2 mL de tampão de lise (Triton X-100 a 2%, SDS a 1%, NaCl 100 mM, Tris HCl 10 mM (pH 8,0) e EDTA 1 mM Na2).</li>
	<li>Adicionar 0,2 ml de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1) e 0,3 g de grânulos de vidro lavados com ácido ao tubo de microcentrífuga. Vórtice do tubo de microcentrífuga durante 2 min a 4 °C e incubar no gelo durante 1 min. Repita esta etapa 6x.</li>
	<li>Centrifugar o tubo a 10.000 × g durante 15 min à temperatura ambiente. Transferir a camada aquosa superior para um tubo de microcentrífuga fresco e adicionar 200 μL de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1).</li>
	<li>Centrifugar o tubo a 10.000 × g durante 10 min. Transfira a camada aquosa superior para um tubo fresco e adicione dois volumes de etanol a 100% (~400 μL) e 1/10 volume de acetato de sódio (3 M, pH 5,8) (~20 μL) ao tubo. Incubar o tubo de microcentrífuga -70 °C durante 1 h.</li>
	<li>Precipitar o ADN por centrifugação a 10 000 × g durante 15 minutos a 4 °C e remover o sobrenadante. Lave o pellet de DNA com etanol a 70% (~500 μL) e mantenha-o à temperatura ambiente para secar ao ar.</li>
	<li>Ressuspender o DNA em 20 μL de água estéril. Use 2-5 μL de DNA plasmídico para a transformação de células competentes de E. coli. NOTA: O plasmídeo também pode ser isolado de células de levedura usando qualquer um dos kits de isolamento de plasmídeos de levedura comercialmente disponíveis.</li>
</ol>4. Identificação do gene codificado pelo clone supressor
<ol><li>Transformar os plasmídeos de levedura isolados em cepas E. coli Top10 [F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG] usando o protocolo padrão29 e espalhar as células em placas LB (Caldo de Luria) com antibióticos necessários.</li>
	<li>Isolar o(s) plasmídeo(s) dos transformadores de E. coli utilizando o protocolo padrão de lise alcalina29 e seguir as combinações apropriadas de enzimas de restrição para verificar a liberação do fragmento de DNA da inserção por digestão de restrição. NOTA: O plasmídeo supressor 84 foi digerido com a enzima de restrição Bam HI e o plasmídeo supressor 104 foi digerido com as enzimas de restrição PstI/BamHI.</li>
	<li>Retransforme os plasmídeos mostrando liberação de inserção após digestão de restrição na cepa ell1 Δ para verificar sua capacidade de resgatar o fenótipo genotóxico sensível ao estresse da cepa ell1Δ. </li>
	<li>Selecione os clones plasmídicos que apresentam supressão da sensibilidade ao estresse genotóxico e sequencie o fragmento de DNA de inserção presente nesses clones plasmídicos usando primers para frente e para trás específicos do vetor. NOTA: Neste estudo, foi utilizado o primer universal forward específico do promotor adh1 (5'CATTGGTCTTCCGCTCCG 3')30.</li>
	<li>Para identificar o gene responsável pela supressão, alinhe a sequência obtida usando o blasto de nucleotídeos NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch) ou a ferramenta de alinhamento de sequência Pombase (https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core). Selecione a sequência que mostra o alinhamento máximo e identifique-a como o gene para o plasmídeo supressor de multicópia.</li>
</ol>

<ol><li>Zuk, O., Hechter, E., Sunyaev, S. R., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+of+missing+heritability%3A+Genetic+interactions+create+phantom+heritability%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The mystery of missing heritability: Genetic interactions create phantom heritability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1193-1198 (2012).</li>
<li>Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. -L. V., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+the+sources+of+missing+heritability+in+a+yeast+cross%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Finding the sources of missing heritability in a yeast cross.</a> Nature. 494 (7436), 234-237 (2013).</li>
<li>Bloom, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interactions+contribute+less+than+additive+effects+to+quantitative+trait+variation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genetic interactions contribute less than additive effects to quantitative trait variation in yeast.</a> Nature Communications. 6 (1), 8712(2015).</li>
<li>Tong, A. H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+mapping+of+the+yeast+genetic+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global mapping of the yeast genetic interaction network.</a> Science. 303 (5659), New York, N.Y. 808-813 (2004).</li>
<li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327 (5964), New York, N.Y. 425-431 (2010).</li>
<li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+genetic+interaction+network+maps+a+wiring+diagram+of+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A global genetic interaction network maps a wiring diagram of cellular function.</a> Science. 353 (6306), New York, N.Y. (2016).</li>
<li>Mullen, J. R., Kaliraman, V., Ibrahim, S. S., Brill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+three+novel+protein+complexes+in+the+absence+of+the+Sgs1+DNA+helicase+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Requirement for three novel protein complexes in the absence of the Sgs1 DNA helicase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 157 (1), 103-118 (2001).</li>
<li>Kaplan, Y., Kupiec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+yeast+cell+cycle%2Fsplicing+factor+Cdc40+in+the+G1%2FS+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">A role for the yeast cell cycle/splicing factor Cdc40 in the G1/S transition.</a> Current Genetics. 51 (2), 123-140 (2007).</li>
<li>Carlsson, M., Hu, G. -Z., Ronne, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+dosage+effects+in+yeast+support+broader+roles+for+the+LOG1%2C+HAM1+and+DUT1+genes+in+detoxification+of+nucleotide+analogues%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Gene dosage effects in yeast support broader roles for the LOG1, HAM1 and DUT1 genes in detoxification of nucleotide analogues.</a> PLOS One. 13 (5), 0196840(2018).</li>
<li>Sopko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+pathways+and+phenotypes+by+systematic+gene+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression.</a> Molecular Cell. 21 (3), 319-330 (2006).</li>
<li>Duffy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+screens+identify+conserved+dosage+chromosome+instability+genes+in+yeast+and+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Overexpression screens identify conserved dosage chromosome instability genes in yeast and human cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 9967-9976 (2016).</li>
<li>Appling, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+approaches+to+the+study+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Genetic approaches to the study of protein-protein interactions.</a> Methods (San Diego, Calif). 19 (2), 338-349 (1999).</li>
<li>Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+and+design+of+genetic+screens%3A+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">The art and design of genetic screens: yeast.</a> Nature Reviews. Genetics. 2 (9), 659-668 (2001).</li>
<li>Kitazono, A. A., Tobe, B. T. D., Kalton, H., Diamant, N., Kron, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker-fusion+PCR+for+one-step+mutagenesis+of+essential+genes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast+%28Chichester%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Marker-fusion PCR for one-step mutagenesis of essential genes in yeast.</a> Yeast (Chichester, England). 19 (2), 141-149 (2002).</li>
<li>Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+genetic+interactions+and+networks+with+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exploring genetic interactions and networks with yeast.</a> Nature Reviews. Genetics. 8 (6), 437-449 (2007).</li>
<li>Prelich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+mechanisms%3A+themes+from+variations%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Suppression mechanisms: themes from variations.</a> Trends in Genetics. 15 (7), 261-266 (1999).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicopy+suppressors+for+novel+antibacterial+compounds+reveal+targets+and+drug+efflux+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Multicopy suppressors for novel antibacterial compounds reveal targets and drug efflux susceptibility.</a> Chemistry & Biology. 11 (10), 1423-1430 (2004).</li>
<li>Apfel, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+deformylase+as+an+antibacterial+drug+target%3A+Target+validation+and+resistance+development%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Peptide deformylase as an antibacterial drug target: Target validation and resistance development.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1058-1064 (2001).</li>
<li>Tsukahara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medicinal+genetics+approach+towards+identifying+the+molecular+target+of+a+novel+inhibitor+of+fungal+cell+wall+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Medicinal genetics approach towards identifying the molecular target of a novel inhibitor of fungal cell wall assembly.</a> Molecular Microbiology. 48 (4), 1029-1042 (2003).</li>
<li>Calabrese, D., Bille, J., Sanglard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multidrug+efflux+transporter+gene+of+the+major+facilitator+superfamily+from+Candida+albicans+%28FLU1%29+conferring+resistance+to+fluconazole%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel multidrug efflux transporter gene of the major facilitator superfamily from Candida albicans (FLU1) conferring resistance to fluconazole.</a> Microbiology. 146 (11), 2743-2754 (2000).</li>
<li>Cotrim, P. C., Garrity, L. K., Beverley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+genes+mediating+resistance+to+inhibitors+of+nucleoside+and+ergosterol+metabolism+in+leishmania+by+overexpression%2Fselection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of genes mediating resistance to inhibitors of nucleoside and ergosterol metabolism in leishmania by overexpression/selection.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (53), 37723-37730 (1999).</li>
<li>Nodake, Y., Yamasaki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+properties+of+a+macromolecular+conjugate+of+lysozyme+prepared+by+modification+with+a+monomethoxypolyethylene+glycol+derivative%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%2C+Biotechnology%2C+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Some properties of a macromolecular conjugate of lysozyme prepared by modification with a monomethoxypolyethylene glycol derivative.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 64 (4), 767-774 (2000).</li>
<li>Sunnerhagen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospects+for+functional+genomics+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Prospects for functional genomics in Schizosaccharomyces pombe.</a> Current Genetics. 42 (2), 73-84 (2002).</li>
<li>Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ancient+yeast+for+young+geneticists%3A+A+primer+on+the+Schizosaccharomyces+pombe+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system.</a> Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).</li>
<li>Sharma, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+RNA+polymerase+II-mediated+transcriptional+elongation%3A+Implications+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Regulation of RNA polymerase II-mediated transcriptional elongation: Implications in human disease.</a> IUBMB Life. 68 (9), 709-716 (2016).</li>
<li>Sweta, K., Dabas, P., Jain, K., Sharma, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino-terminal+domain+of+ELL+transcription+elongation+factor+is+essential+for+ELL+function+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The amino-terminal domain of ELL transcription elongation factor is essential for ELL function in Schizosaccharomyces pombe.</a> Microbiology. 163 (11), Reading, England. 1641-1653 (2017).</li>
<li>Murray, J. M., Watson, A. T., Carr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Schizosaccharomyces+pombe%3A+Lithium+acetate%2Fdimethyl+sulfoxide+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transformation of Schizosaccharomyces pombe: Lithium acetate/dimethyl sulfoxide procedure.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (4), 090969(2016).</li>
<li>Hagan, I., Carr, A. M., Grallert, A., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHagan%2C+I+%22Fission+yeast%3A+a+laboratory+manual%22">Fission yeast: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2016).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+transformation+of+competent+E.+coli+using+calcium+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation and transformation of competent E. coli using calcium chloride.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), 3932(2006).</li>
<li>Janoo, R. T., Neely, L. A., Braun, B. R., Whitehall, S. K., Hoffman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulators+of+the+Schizosaccharomyces+pombefbp1+gene+include+two+redundant+Tup1p-like+corepressors+and+the+CCAAT+binding+factor+activation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulators of the Schizosaccharomyces pombefbp1 gene include two redundant Tup1p-like corepressors and the CCAAT binding factor activation complex.</a> Genetics. 157 (3), 1205-1215 (2001).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+plasmid+DNA+by+alkaline+lysis+with+SDS%3A+Maxipreparation%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of plasmid DNA by alkaline lysis with SDS: Maxipreparation.</a> CSH Protocols. 2006 (1), 4090(2006).</li>
<li>Choi, E., Lee, K., Song, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+rax2p+in+the+polarized+growth+of+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">Function of rax2p in the polarized growth of fission yeast.</a> Molecules and Cells. 22 (2), 146-153 (2006).</li>
<li>Eisenreichova, A., Różycki, B., Boura, E., Humpolickova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osh6+revisited%3A+Control+of+PS+transport+by+the+concerted+actions+of+PI4P+and+Sac1+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Osh6 revisited: Control of PS transport by the concerted actions of PI4P and Sac1 phosphatase.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 747601(2021).</li>
<li>Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast as a model organism.</a> Science. 277 (5330), New York, N.Y. 1259-1260 (1997).</li>
<li>Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeasts+Saccharomyces+cerevisiae+and+Schizosaccharomyces+pombe%3A+models+for+cell+biology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Gravitational+and+Space+Biology+Bulletin%3A+Publication+of+the+American+Society+for+Gravitational+and+Space+Biology%22%5BJournal%5D)">The yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe: models for cell biology research.</a> Gravitational and Space Biology Bulletin: Publication of the American Society for Gravitational and Space Biology. 18 (2), 3-9 (2005).</li>
<li>Botstein, D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast%3A+an+experimental+organism+for+21st+Century+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Yeast: an experimental organism for 21st Century biology.</a> Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).</li>
<li>Jones, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+library+for+comprehensive+overexpression+screens+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature Methods. 5 (3), 239-241 (2008).</li>
<li>Kitada, K., Johnson, A. L., Johnston, L. H., Sugino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicopy+suppressor+gene+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+G1+cell+cycle+mutant+gene+dbf4+encodes+a+protein+kinase+and+is+identified+as+CDC5%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">A multicopy suppressor gene of the Saccharomyces cerevisiae G1 cell cycle mutant gene dbf4 encodes a protein kinase and is identified as CDC5.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (7), 4445-4457 (1993).</li>
<li>Melnykov, A. V., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMelnykov%2C+AV+%22MCH4+is+a+multicopy+suppressor+of+glycine+toxicity+in+Saccharomyces+cerevisiae%22">MCH4 is a multicopy suppressor of glycine toxicity in Saccharomyces cerevisiae</a>. , 653444(2019).</li>
<li>Kosodo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicopy+suppressors+of+the+sly1+temperature-sensitive+mutation+in+the+ER-Golgi+vesicular+transport+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Multicopy suppressors of the sly1 temperature-sensitive mutation in the ER-Golgi vesicular transport in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 18 (11), 1003-1014 (2001).</li>
<li>Nakamura, T., Takahashi, S., Takagi, H., Shima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicopy+suppression+of+oxidant-sensitive+eos1+mutation+by+IZH2+in+Saccharomyces+cerevisiae+and+the+involvement+of+Eos1+in+zinc+homeostasis%3A+Eos1+involvement+in+zinc+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Multicopy suppression of oxidant-sensitive eos1 mutation by IZH2 in Saccharomyces cerevisiae and the involvement of Eos1 in zinc homeostasis: Eos1 involvement in zinc homeostasis.</a> FEMS Yeast Research. 10 (3), 259-269 (2010).</li>
<li>Hernández-López, M. J., García-Marqués, S., Randez-Gil, F., Prieto, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicopy+suppression+screening+of+Saccharomyces+cerevisiae+identifies+the+ubiquitination+machinery+as+a+main+target+for+improving+growth+at+low+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multicopy suppression screening of Saccharomyces cerevisiae identifies the ubiquitination machinery as a main target for improving growth at low temperatures.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (21), 7517-7525 (2011).</li>
<li>Sweta, K., Sharma, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interaction+between+ELL+transcription+elongation+factor+and+Epe1+reveals+the+role+of+Epe1+in+the+regulation+of+transcription+outside+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Functional interaction between ELL transcription elongation factor and Epe1 reveals the role of Epe1 in the regulation of transcription outside heterochromatin.</a> Molecular Microbiology. 116 (1), 80-96 (2021).</li>
<li>Kim, D. -U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+a+genome-wide+set+of+gene+deletions+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 617-623 (2010).</li>
<li>Adames, N. R., Gallegos, J. E., Peccoud, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+genetic+interaction+screens+in+the+age+of+CRISPR%2FCas%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Yeast genetic interaction screens in the age of CRISPR/Cas.</a> Current Genetics. 65 (2), 307-327 (2019).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse.

As leveduras têm sido amplamente utilizadas para investigar os processos biológicos básicos e as vias que são conservadas evolutivamente em organismos eucarióticos. A disponibilidade de ferramentas genéticas e genômicas, juntamente com sua amenidade a vários procedimentos bioquímicos, genéticos e moleculares, tornam as leveduras um excelente organismo modelo para a pesquisa genética34,35,36. Ao longo dos anos, várias telas genét...

Redes de interações genéticas fornecem informações funcionais sobre genes e delineiam caminhos e processos biológicos em que esses genes podem estar envolvidos in vivo. Além disso, eles também podem fornecer insights sobre como diferentes genes interagem uns com os outros, resultando em um fenótipo específico 1,2,3. Ao longo dos anos, uma variedade de telas genéticas foram projetadas por pesquisadores para responder a questões biológicas fundamentais e estudar doenças humanas. Telas para a identificação de interações genéticas podem ser realizadas de várias maneiras. Interações genéticas identificadas em diferentes telas genéticas podem representar relações mecanicistas distintas entre genes. Além disso, estudos têm revelado que um conjunto comum de interações genéticas é compartilhado por genes que codificam proteínas pertencentes à mesma via ou complexo 4,5. Assim, redes de interação genética podem ser usadas para estabelecer a organização funcional em uma célula, em que genes que compartilham os perfis mais semelhantes pertencem ao mesmo complexo ou via, esses genes que compartilham perfis um pouco menos semelhantes pertencem ao mesmo processo biológico e os genes que exibem perfis sobrepostos, mas mais diversos, refletem membros pertencentes ao mesmo compartimento celular6.
As telas de interação genética baseadas na supressão da dosagem ('supressão de cópia alta ou multicópia') são uma das abordagens comumente usadas. Essas telas podem ser realizadas por meio da transformação de uma cepa mutante de consulta com uma biblioteca genômica ou cDNA de alto número de cópias, seguida de ensaios/técnicas de seleção adequadas para identificar a supressão ou o aumento das interações genéticas 7,8,9. Para garantir uma cobertura abrangente de todo o genoma, essas telas também foram realizadas superexpressando um gene específico de interesse em uma coleção de mutantes de perda de função em todo o genoma ou superexpressando uma biblioteca genômica ou cDNA codificada por plasmídeo de alto número de cópias em um mutante de consulta de perda de função 9,10,11,12,13,14,15 . A estratégia de multicópia também poderia funcionar usando uma abordagem dominante/superexpressão usando um promotor regulável.
As principais vantagens do uso de telas baseadas em supressores são que a supressão de um fenótipo preexistente em uma cepa mutante por outro gene estabelece uma relação genética entre esses dois produtos genéticos que pode não ter sido demonstrada usando outras abordagens. Em segundo lugar, observou-se que a presença de uma mutação preexistente sensibiliza uma via particular, permitindo que componentes adicionais dessa via sejam identificados pelo isolamento de supressores, que podem não ter sido identificados por seleções genéticas mais diretas. Além disso, essa tela pode ser utilizada para identificar supressores que possuem diferentes mecanismos de supressão16. As interações supressoras geralmente ocorrem entre genes que estão funcionalmente relacionados e podem ser usados para elucidar hierarquias em vias. O mecanismo exato subjacente de supressão pode diferir com base em vários fatores, incluindo o tipo de mutação de consulta usada na tela, condições experimentais e o nível de expressão gênica. Um dos mecanismos comuns de supressão de dosagem envolve genes que codificam produtos que funcionam juntos no mesmo complexo ou em paralelo no mesmo processo celular / biológico. Os resultados de tais telas em organismos modelo mais simples, como a levedura, podem ser estendidos a organismos eucarióticos superiores, uma vez que a maioria das vias e processos biológicos fundamentais são conservados ao longo da evolução.
Essas telas genéticas também podem ser modificadas de várias maneiras para responder a diferentes questões biológicas. Por exemplo, genes ortólogos de diferentes organismos que podem suprimir o fenótipo da cepa mutante de consulta podem ser identificados. Também tem sido usado para delinear potenciais mecanismos de resistência e determinar alvos proteicos de novos compostos antibacterianos 17,18, antifúngicos 19,20, antiparasitários 21 e anticancerígenos22. Esta tela também tem sido explorada para identificar supressores da atividade de drogas farmacêuticas cujo mecanismo de ação não é conhecido. Assim, em princípio, essas telas supressoras de multicópia podem ser otimizadas e usadas em uma variedade de aplicações em diferentes organismos. Embora a maioria das telas genéticas empregadas por pesquisadores de leveduras tenha sido inicialmente desenvolvida em S. cerevisiae, S. pombe emergiu como um sistema modelo complementar para a realização de várias telas e ensaios genéticos23. Além disso, a organização genômica e os processos biológicos em S. pombe, como a ocorrência de íntrons em mais genes, a complexidade das origens da replicação do DNA, a estrutura dos centrômeros, a organização do ciclo celular e a presença da maquinaria de RNAi, mostram maior semelhança entre S. pombe e eucariotas superiores23,24, ressaltando a importância do desenho e uso de ferramentas genéticas em S. pombe. 
Este artigo descreve um protocolo para identificar interatores genéticos com base na "supressão da dosagem" de um fenótipo mutante de perda de função em S. pombe. A base deste protocolo é que é um método rápido e eficiente para rastrear uma biblioteca de cDNA superexpressando genes do tipo selvagem em um plasmídeo multicópia e / ou de um promotor forte. Este protocolo tem quatro etapas principais: transformação da biblioteca em uma cepa mutante de consulta, seleção de clones plasmídicos que suprimem o fenótipo desejado da cepa mutante de consulta, recuperação do(s) plasmídeo(s) desses clones supressores e identificação do gene responsável pela supressão do fenótipo. Como é verdade para qualquer método baseado na seleção e identificação de cDNAs de uma biblioteca, o sucesso da tela depende do uso de uma biblioteca de alta qualidade e alta complexidade, pois a tela pode recuperar apenas os clones de cDNA que estão presentes na biblioteca.
Usando este protocolo, identificamos com sucesso dois novos supressores do fenótipo genotóxico sensível ao estresse do mutante nulo S. pombe ell1. A família ELL (Eleven Nineteen Lysine Rich Leukemia) de fatores de alongamento de transcrição suprime a pausa transitória da RNA polimerase II em moldes de DNA em ensaios bioquímicos in vitro e são conservados em vários organismos, desde leveduras de fissão até humanos25. Trabalhos anteriores forneceram evidências de que um mutante nulo de S. pombe ell1 mostra sensibilidade ao estresse genotóxico na presença de óxido de 4-nitroquinolina 1 (4-NQO) e metanossulfonato de metila (MMS)26. Portanto, transformamos uma biblioteca de cDNA multicópia codificada por plasmídeo de S. pombe na consulta S. pombe ell1 mutante nulo e identificamos dois supostos clones que exibiam a capacidade de suprimir a sensibilidade ao estresse genotóxico do mutante nulo de S. pombe ell1 na presença de 4-NQO, um composto que induz lesões de DNA. O sequenciamento subsequente da inserção presente nos clones plasmídicos identificou que os genes que codificam rax2+ e osh6+ foram responsáveis por suprimir a sensibilidade ao estresse genotóxico do mutante nulo ell1 quando superexpresso no mutante nulo ell1.

<table><tbody><tr><td>4-NQO</td><td>Sigma</td><td>N8141</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético, glacial</td><td>Sigma</td><td>1371301000</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Adenina</td><td>Himedia</td><td>GRM033</td><td></td></tr><tr><td>Ágar</td><td>Himedia</td><td>GRM026</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004L</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Amônio</td><td>Himedia</td><td>MB054</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>Fermentas</td><td>ER0051</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Himedia</td><td>RM095</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Bórico</td><td>Himedia</td><td>MB007</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Cálcio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio: Álcool isoamílico 24: 1</td><td>Sigma</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Himedia</td><td>RM1023</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogênio fosfato dissódico anidro</td><td>Himedia</td><td>GRM3960</td><td></td></tr><tr><td>DNA de fita simples de testículos de salmão</td><td>Sigma</td><td>D7656</td><td></td></tr><tr><td>EDTA dissódico</td><td>Sigma</td><td>324503</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto férrico hexahidratado</td><td>Himedia</td><td>RM6353</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Amresco</td><td>188</td><td></td></tr><tr><td>Ionositol</td><td>Himedia</td><td>GRM102</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Qualigen</td><td>Q26897</td><td></td></tr><tr><td>Leucina</td><td>Himedia</td><td>GRM054</td><td></td></tr><tr><td>Acetae de lítio</td><td>Sigma</td><td>517992</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio Hexahidratado</td><td>Himedia</td><td>MB040</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Molibdico</td><td>Himedia</td><td>RM690</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Nicotínico</td><td>Himedia</td><td>CMS177</td><td></td></tr><tr><td>PEG, MW 4000</td><td>Sigma</td><td>81240</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Pentocínico</td><td>Himedia</td><td>TC159</td><td></td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Himedia</td><td>MB082</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extração de plasmídeo</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Potássio hidrogênio Pthallate</td><td>Merc</td><td>DDD7D670815</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de potássio</td><td>Himedia</td><td>RM1086</td><td></td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Fermentas</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Himedia</td><td>GRM205</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Himedia</td><td>GRM1183</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de sódio</td><td>Himedia</td><td>RM1037</td><td></td></tr><tr><td>Base livre de</td><td>Tris Himedia</td><td>MB209</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Himedia</td><td>GRM264</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura em pó</td><td>Himedia</td><td>RM668</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de zinco Heptahidratado</td><td>Merc</td><td>DJ9D692580</td><td></td></tr></tbody></table>

triagem genética para identificação de supressores multicópia em schizosaccharomyces pombe

Genetic Screen for Identification of Multicopy Suppressors in Schizosaccharomyces pombe

A identificação de interações genéticas é uma ferramenta poderosa para decifrar as funções do(s) gene(s), fornecendo insights sobre suas relações funcionais com outros genes e organização em vias e processos biológicos. Embora a maioria das telas genéticas tenha sido inicialmente desenvolvida em Saccharomyces cerevisiae, uma plataforma complementar para a realização dessas telas genéticas foi fornecida pela Schizosaccharomyces pombe. Uma das abordagens comuns usadas para identificar interações genéticas é a superexpressão de clones de uma biblioteca de plasmídeos de alto número de cópias em todo o genoma em um mutante de perda de função, seguida pela seleção de clones que suprimem o fenótipo mutante.
Este artigo descreve um protocolo para a realização desta triagem genética baseada em "supressão multicópia" em S. pombe. Esta triagem ajudou a identificar o(s) supressor(es) de múltiplas cópias do fenótipo genotóxico sensível ao estresse associado à ausência do fator de alongamento de transcrição Ell1 em S. pombe. A triagem foi iniciada pela transformação da cepa mutante nula ell1 com uma biblioteca plasmídica de cDNA de alto número de cópias e seleção dos supressores em placas EMM2 contendo 4-nitroquinolina 1-óxido (4-NQO), um composto genotóxico indutor de estresse. Posteriormente, o plasmídeo foi isolado de duas colônias supressoras pré-selecionadas e digerido por enzimas de restrição para liberar o DNA inserido. Os plasmídeos que liberam um fragmento de DNA de inserção foram retransformados na cepa de deleção ell1 para confirmar a capacidade desses clones plasmídeos supressores de restaurar o crescimento do mutante de deleção ell1 na presença de 4-NQO e outros compostos genotóxicos. Os plasmídeos que apresentaram resgate do fenótipo de deleção foram sequenciados para identificar o(s) gene(s) responsável(is) pela supressão do fenótipo sensível ao estresse genotóxico associado à deleção ell1.

Triagem para sugador(es) de múltiplas cópias de sensibilidade ao estresse genotóxico associado à deleção ell1 em S. pombe Realizamos a triagem genética utilizando o protocolo descrito acima para identificar supressores multicópia do fenótipo de perda de função da cepa mutante de deleção de consulta ell1. A sensibilidade relacionada ao crescimento da cepa de deleção ell1 observada na presença do agente genotóxico 4-...

Este trabalho descreve um protocolo para uma triagem genética supressora de múltiplas cópias em Schizosaccharomyces pombe. Esta tela usa uma biblioteca de plasmídeos em todo o genoma para identificar clones supressores de um fenótipo de perda de função associado a uma cepa mutante de consulta. Novos supressores genéticos do mutante nulo ell1 foram identificados usando esta tela.

Triagem Genética para Identificação de Supressores Multicópia em Schizosaccharomyces pombe

Identification of genetic interactions is a powerful tool to decipher the functions of gene(s) by providing insights into their functional relationships ...

As telas supressoras identificam interações genéticas que lançariam luz sobre as funções do gene de interesse, bem como as vias e processos biológicos em que eles podem estar envolvidos in vivo. Esta técnica pode identificar uma relação genética entre dois produtos genéticos que podem não ter sido demonstrados usando outras abordagens. Os resultados de tais telas em leveduras podem ser estendidos a organismos eucarióticos elevados, uma vez que a maioria das vias e processos biológicos fundamentais são conservados ao longo da evolução.O sucesso do esquema depende da disponibilidade, de alta qualidade e da alta eficiência de sua transformação em células de levedura. Assim, protocolo de transformação com o plasmídeo antes de Grow the Schizosaccharomyces pombe ell1 deformação de deleção a 32 graus Celsius em placa média YE. Pegue um laço cheio de cepa mutante ell1 da placa, inocular cinco mililitros de meio YE suplementado e, em seguida, incube o frasco para injetáveis enquanto agita a 32 graus Celsius durante a noite.Após a incubação, diluir a cultura de crescimento durante a noite em 100 mililitros de meio YE fresco contendo os suplementos desejados para atingir 0,3 densidade óptica a 600 nanômetros. Incubar o meio a 32 graus Celsius enquanto agita a 200 a 550 RPM até que a densidade óptica a 600 nanômetros atinja a fase intermediária. Depois de dividir os 100 mililitros de cultura em dois tubos de centrífuga de 50 mililitros, pellet as células a 4.000 vezes G por 10 minutos à temperatura ambiente.Uma vez que o sobrenadante é descartado, ressuspenda o pellet celular em um mililitro de água estéril. Centrifugar e descartar o sobrenadante mais uma vez e, em seguida, ressuspender o pellet celular em um mililitro de acetato de lítio TE. Pellet a célula por centrifugação e ressuspender cada pellet celular em 250 microlitros de acetato de lítio TE. Em seguida, transfira 125 microlitros das células competentes em quatro tubos de microcentrífuga estéreis diferentes para as etapas subsequentes de transformação. Ferva o DNA transportador de testículos de salmão ou esperma de arenque por um minuto e coloque imediatamente o tubo no gelo.Para cada transformação, adicione 10 microlitros de DNA transportador de fita simples ao tubo de microcentrífuga contendo 125 microlitros das células competentes e misture suavemente por pipetagem. Subsequentemente, adicionar 50 microgramas da biblioteca de cDNA de Schizosaccharomyces pombe ao tubo contendo células competentes e mistura de DNA portador. Depois de incubar o tubo à temperatura ambiente durante 10 minutos, adicionar 260 microlitros de solução de acetato de polietilenoglicol-lítio e misturar por pipetagem.Incubar o tubo que contém a mistura de transformação a 32 graus Celsius durante duas horas sem agitar. Adicione 43 microlitros de sulfóxido de dimetilo pré-aquecido ao tubo e misture suavemente. Agora, exponha o tubo ao choque térmico a 42 graus Celsius por cinco minutos.Pellet as células e descartar o sobrenadante como demonstrado anteriormente e, em seguida, pipetar para fora a solução residual de acetato de polietilenoglicol lítio TA. Ressuspeite as células em 100 microlitros de água estéril e coloque-as em uma placa EMM2 contendo os suplementos necessários e 0,2 microgramas por mililitro de 4-NQO. Em seguida, permita que as colônias apareçam nas placas incubando as placas a 32 graus Celsius por cinco a seis dias.Para triagem adicional, listrar as colônias obtidas na mesma placa média na presença de 0,2 microgramas por mililitro de 4-NQO. Para um experimento de transformação de biblioteca, use 500 microlitros de células competentes para transformação e placa 1 por 10 da mistura de transformação em placa EMM2 com suplementos necessários sem 4-NQO para calcular o número total de clones de biblioteca obtidos após a transformação e triagem para os clones supressores. Adicione 100 a 200 microlitros de água estéril a cada poço de uma placa de microtitulação estéril de 96 poços.Usando um palito de dente estéril ou uma ponta de micropipeta de 20 a 200 microlitros, escolha uma pequena quantidade de inóculo de cada colônia obtida após a transformação da biblioteca de cDNA na placa contendo 4-NQO. Adicione o inóculo de cada uma das diferentes colônias em cada poço da placa contendo água estéril e misture bem. Identifique três microlitros da suspensão celular de cada poço em placas de ágar EMM2 e adicione concentrações apropriadas de 4-NQO às placas.Depois de cultivar as células a 32 graus Celsius por três a quatro dias, identifique as colônias que mostram crescimento em diferentes concentrações de 4-NQO como supressores putativos. Para validar ainda mais os supressores, cultive os supressores selecionados e as cepas de controle apropriadas em meio EMM2 contendo 225 microgramas por mililitro de adenina e uracilo a 32 graus Celsius durante a noite com agitação. Após o final da incubação, diluir as células para uma densidade óptica de 0,3 em meio EMM2 fresco e cultivá-las enquanto agita a 32 graus Celsius até a fase intermediária.Detectar diluições seriadas apropriadas de culturas em placas EMM2 com os suplementos necessários contendo 0,4 micromolar 4-NQO ou 0,01%MMS. Para controle, identifique as cepas em uma placa EMM2 com os suplementos necessários, mas sem qualquer agente prejudicial ao DNA. Incube as placas a 32 graus Celsius por três a cinco dias para monitorar o crescimento.Observe as cepas mutantes transformadas com o gene de comprimento total de interesse ou vetor vazio como controles positivos e negativos, respectivamente, juntamente com os transformadores de biblioteca. Inocular uma única colônia de levedura em meio EMM2 contendo 225 microgramas por mililitro de adenina e uracilo e crescer as células a 32 graus Celsius durante a noite com agitação a 200 a 250 RPM. No final da incubação, colher a cultura de 10 mililitros de densidade óptica 0,5 por centrifugação a 4.000 vezes G por dois minutos à temperatura ambiente.Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 0,2 mililitros de tampão de lise. Adicionar 0,2 mililitros de álcool isoamílico de clorofórmio fenol e 0,3 gramas de contas de vidro lavadas com ácido ao tubo de microcentrífuga. Misture o tubo por vórtice por dois minutos, seguido de incubação no gelo por um minuto.Centrifugar o tubo a 10.000 vezes G durante 15 minutos à temperatura ambiente. Transfira a camada aquosa superior para um tubo de microcentrífuga fresco e adicione 200 microlitros de álcool isoamílico de clorofórmio fenol. Depois de centrifugar novamente a 10.000 vezes G por 10 minutos, transfira a camada aquosa superior para um tubo fresco.Em seguida, adicione dois volumes de etanol a 100% e 1 por 10 volume de acetato de sódio ao tubo e incube a menos 70 graus Celsius por uma hora. Precipitar o ADN por centrifugação a 10 000 vezes G durante 15 minutos a quatro graus Celsius e remover o sobrenadante. Lave o pellet de DNA com etanol a 70% e seque ao ar livre à temperatura ambiente.Ressuscite o DNA em 20 microlitros de água estéril e use de três a cinco microlitros de DNA plasmídico para transformar células competentes de Escherichia coli. Usando o protocolo padrão, transforme os plasmídeos de levedura isolados em cepa TOP10 de Escherichia coli e espalhe as células em placas LB com antibióticos necessários. Depois de isolar o plasmídeo dos transformadores de Escherichia coli usando o protocolo padrão de lise alcalina, siga as combinações apropriadas de enzimas de restrição para verificar a liberação do fragmento de DNA inserido por digestão de restrição.Em seguida, retransforme os plasmídeos mostrando liberação de inserção após a digestão de restrição na cepa de deleção ell1 para verificar sua capacidade de resgatar o fenótipo genotóxico sensível ao estresse da cepa de deleção ell1. A cepa de pombe Schizosaccharomyces deletada por ell1 mostrou sensibilidade em relação ao 4-NQO em comparação com a cepa do tipo selvagem. Um grande número de colônias é obtido na placa sem 4-NQO.No entanto, menos transformadores foram obtidos na placa 4-NQO, pois atuam como supressores punitivos da sensibilidade 4-NQO do mutante nulo ell1. Dos 620 transformadores, 74 apresentaram crescimento em 4-NQO micromolar 0,4. Observou-se que apenas 16 dos 74 apresentaram crescimento na presença de 4-NQO 0,8-micromolar.A cepa de deleção ell1 se transformou com um vetor vazio e todos os 16 transformadores apresentaram crescimento na placa sem 4-NQO. O mutante de deleção ell1 contendo apenas o vetor vazio não apresentou crescimento em 0,8-micromolar 4-NQO e seis transformadores apresentaram crescimento em 0,8-micromolar 4-NQO, sugerindo que os clones de biblioteca presentes neles poderiam suprimir o fenótipo de estresse genotóxico do mutante nulo ell1. A digestão de restrição do plasmídeo supressor 84 e 104 liberou uma inserção de uma quilobase e 800 pares de bases, respectivamente.A reintrodução dos clones plasmídeos supressores no mutante nulo ell1 resultou na supressão da sensibilidade de crescimento associada ao 4-NQO. No entanto, na presença de MMS, os plasmídeos supressores contendo o mutante de deleção ell1 apresentaram maior crescimento do que aqueles com vetor vazio. Essas telas genéticas podem delinear potenciais mecanismos de resistência e identificar alvos proteicos de novos compostos antibacterianos, antifúngicos, antiparasitários ou anticancerígenos.Eles também podem identificar o mecanismo de ação das drogas farmacêuticas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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