Elevado-throughput Screening para herança à base de proteínas no S. cerevisiae

O objetivo geral desta fenotipagem de levedura de alto rendimento é rastrear proteínas que ilícitas uma memória fenotípica duradoura de expressão passada, como um proxy para a herança baseada em proteínas. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do príon de levedura, como, por exemplo, quantas proteínas podem herança ilícita desse tipo. A principal vantagem dessa técnica é que você pode rastrear muitas proteínas e vias de maneira imparcial.

Inicie este procedimento cultivando as células de levedura apropriadas em uma placa de 96 poços a 30 graus Celsius, conforme descrito no protocolo de texto. Inspecione visualmente as culturas para confirmar se as culturas estão saturadas, as células devem ser visíveis a olho nu, no fundo de cada poço. Use um robô de manuseio de líquidos para preparar placas de 384 poços, contendo 45 microlitros do meio apropriado por poço.

Primeiro, dispense Scal-URA nos poços de uma placa de 384 poços. Em seguida, dispense Scal-URA mais o estressor de interesse nos poços de uma segunda placa, 20 milimolares de cloreto de manganês são usados como estressor neste experimento. Em terceiro lugar, dispense SD-URA, que não induzirá a expressão de plasmídeo, mais cloreto de manganês em outra placa.

Abaixe a placa de 96 poços contendo as culturas no robô de manuseio de líquidos e inocule uma matriz de um a quatro microlitros de cada poço da placa de 96 poços, em quatro poços separados de cada placa de 384 poços preenchidos com um meio diferente. Coloque imediatamente as placas com células em um empilhador de microplacas à temperatura ambiente e dióxido de carbono atmosférico. Defina o protocolo para um loop contínuo de 72 horas, medindo a densidade óptica em 600 nanômetros com o leitor de microplacas.

Após as medições de crescimento, transfira um microlitro por poço das culturas induzidas por SCal-URA que sofreram superexpressão de proteínas para novas placas de 384 poços, contendo 45 microlitros por poço de meio ST-URA que não permite a expressão proteica do plasmídeo. Em paralelo, realizar inoculações análogas de um segundo conjunto de placa de 384 poços contendo 45 microlitros por poço de ST-URA das culturas que foram cultivadas em ST-URA na presença do estressor. Coloque as placas em uma câmara umidificada e cultive as placas por 48 horas a 30 graus Celsius até a saturação.

Após 48 horas, use as placas para reinocular um microlitro por poço em placas de 384 poços contendo 45 microlitros por poço de ST-URA. Em seguida, execute uma reinoculação separada de um microlitro por poço da mesma placa de origem em uma placa separada de 384 poços contendo 45 microlitros por poço de ST-URA com o estressor. Coloque imediatamente as placas com células do microstacker à temperatura ambiente e dióxido de carbono atmosférico e defina o protocolo para um loop contínuo de 48 horas, medindo a densidade óptica em 600 nanômetros com um leitor de microplacas.

Quando as medições de crescimento estiverem concluídas, use o software do leitor de placas para exportar o tempo versus a densidade óptica em medições de 600 nanômetros como uma tabela XY. Agrupe as colunas das medições de densidade óptica para cada réplica biológica e calcule a média. Crie um gráfico XY de tempo versus densidade óptica a 600 nanômetros para gerar curvas de crescimento.

Para culturas que escolheram diferenças significativas de crescimento em resposta a um determinado estressor, dependendo da superexpressão de proteínas ancestrais, pegue um microlitro de cada réplica biológica, dilua em 10 mililitros de água e, em seguida, coloque 50 microlitros em placas contendo 5-FOA. Cresça a 30 graus Celsius por três dias. Se daí resultarem demasiadas ou poucas colónias por placa, ajustar o factor de diluição em conformidade.

100 a 200 colônias por placa é o ideal. Escolha de oito a 32 colônias únicas com palitos de dente em autoclave e fixe-as em placas de 96 poços contendo 150 microlitros de SDCSM por poço. Coloque as placas em uma câmara umidificada e cresça até a saturação por 48 a 72 horas a 30 graus Celsius.

Use essas culturas para inocular dois novos conjuntos de placas de 96 poços contendo 150 microlitros por poço de SDCSM, com e sem o estressor. Coloque as placas em um empilhador de microplacas e defina o protocolo para medir a densidade óptica em 600 nanômetros em um loop contínuo de 48 horas. Após 48 horas, analise os dados conforme mostrado anteriormente e confirme se as diferenças significativas de crescimento observadas anteriormente são mantidas após a perda de plasmídeo.

As células que mantêm os fenótipos induzidos são então testadas quanto às características clássicas da herança baseada em proteínas, conforme descrito no protocolo de texto. Esta tela de herança baseada em proteínas revelou a superexpressão transitória do quadro de leitura aberto PSP1, impulsiona uma resistência ao cloreto de manganês que foi mantida por centenas de gerações nas células, muito depois de a superexpressão ter cessado. Algoritmos de previsão de príons pontuaram o terminal final do PSP1 como moderadamente semelhante ao Prion.

Em contraste, os algoritmos não previram praticamente nenhuma característica significativa da sequência semelhante ao Príon da maioria das proteínas indutoras recuperadas na tela, conforme mostrado por esta análise representativa. Medições de crescimento de cepas e SDCSM com cloreto de manganês, normalizadas para um PSP1 sem controle ingênuo correspondente, indicaram que a inibição da desagregação HSP104 não prejudica a resistência ao cloreto de manganês dependente de PSP1, enquanto a remoção da chaperona HSP70 e do gene PSP1 elimina hereditariamente esse fenótipo. Todos os esporos de tétrades simples de cruzamentos entre cepas, abrigando o estado fenotípico dependente de PSP1 e cepas ingênuas, exibem resistência ao cloreto de manganês, indicando herança não mendeliana do fenótipo.

Uma comparação da infectividade para transformação de proteínas entre lisados simulados e PSP1 que abrigam lisados como material transmissível mostrou que mais de 53% das células virgens transformadas com PSP1 semeado receberam o fenótipo de resistência ao cloreto de manganês correspondente. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em algumas semanas, incluindo etapas de incubação e a preparação da maioria das etapas de triagem pode ser feita em menos de duas horas por dia, mesmo com um grande número de placas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de planejar exatamente o que você deseja testar com antecedência e ter em mente a escala do experimento.

Agora, isso é especialmente importante para iniciantes na técnica. Após este procedimento, outros métodos como os descritos no protocolo de texto podem ser realizados para determinar se os fenótipos observados na triagem exibem um padrão de herança verdadeiro, semelhante ao Prion. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da epigenética explorarem a amplitude da biologia do príon no serviço sacralis CI. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como projetar uma tela de alto rendimento para novas formas de herança baseada em proteínas em leveduras, de maneira imparcial e direcionada.

Não se esqueça de que certos estressores químicos, como agentes prejudiciais ao DNA, podem ser extremamente perigosos e precauções, como o uso de equipamentos de proteção individual, devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.