Name: Elevado-throughput Screening para herança à base de proteínas no S. cerevisiae (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Aprenda a realizar triagem de alta vazão para herança à base de proteínas em Saccharomyces cerevisiae. Este método permite identificar proteínas que induzem memória fenotípica duradoura, contribuindo para o estudo da biologia de príons.

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Agradecemos a Sohini Chakrabortee, de Sandra Jones, de David Garcia, de Bhupinder Bhullar, de Amelia Chang, de Richard She e de Susan Lindquist por sua assistência no desenvolvimento de ensaios utilizados no presente livro, bem como os revisores para seus comentários pensativos.

<ol><li>Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions%2C+protein+homeostasis%2C+and+phenotypic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity.</a> Trends Cell Biol. 20 (3), 125-133 (2010).</li>
<li>Byers, J. S., Jarosz, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pernicious+pathogens+or+expedient+elements+of+inheritance%3A+the+significance+of+yeast+prions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Pernicious pathogens or expedient elements of inheritance: the significance of yeast prions.</a> PLoS Pathog. 10 (4), 1003992(2014).</li>
<li>Jarosz, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-kingdom+chemical+communication+drives+a+heritable%2C+mutually+beneficial+prion-based+transformation+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cross-kingdom chemical communication drives a heritable, mutually beneficial prion-based transformation of metabolism.</a> Cell. 158 (5), 1083-1093 (2014).</li>
<li>True, H. L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+prion+provides+a+mechanism+for+genetic+variation+and+phenotypic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity.</a> Nature. 407 (6803), 477-483 (2000).</li>
<li>Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+prion%2C+Mod5%2C+promotes+acquired+drug+resistance+and+cell+survival+under+environmental+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress.</a> Science. 336 (6079), 355-359 (2012).</li>
<li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146 (3), 448-461 (2011).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+polymerization+underlies+signal+transduction+in+antiviral+immune+defense+and+inflammasome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation.</a> Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).</li>
<li>Majumdar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+amyloid-like+oligomers+of+Drosophila+Orb2+in+the+persistence+of+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Critical role of amyloid-like oligomers of Drosophila Orb2 in the persistence of memory.</a> Cell. 148 (3), 515-529 (2012).</li>
<li>Khan, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloidogenic+Oligomerization+Transforms+Drosophila+Orb2+from+a+Translation+Repressor+to+an+Activator%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Amyloidogenic Oligomerization Transforms Drosophila Orb2 from a Translation Repressor to an Activator.</a> Cell. 163 (6), 1468-1483 (2015).</li>
<li>Fioriti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Persistence+of+Hippocampal-Based+Memory+Requires+Protein+Synthesis+Mediated+by+the+Prion-like+Protein+CPEB3%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Persistence of Hippocampal-Based Memory Requires Protein Synthesis Mediated by the Prion-like Protein CPEB3.</a> Neuron. 86 (6), 1433-1448 (2015).</li>
<li>Derkatch, I. L., Bradley, M. E., Hong, J. Y., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+affect+the+appearance+of+other+prions%3A+the+story+of+%5BPIN%28%2B%29%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prions affect the appearance of other prions: the story of [PIN(+)].</a> Cell. 106 (2), 171-182 (2001).</li>
<li>Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+survey+identifies+prions+and+illuminates+sequence+features+of+prionogenic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins.</a> Cell. 137 (1), 146-158 (2009).</li>
<li>Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+chaperone+protein+Hsp104+in+propagation+of+the+yeast+prion-like+factor+%5Bpsi%2B%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+].</a> Science. 268 (5212), 880-884 (1995).</li>
<li>Patino, M. M., Liu, J. J., Glover, J. R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Support+for+the+prion+hypothesis+for+inheritance+of+a+phenotypic+trait+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast.</a> Science. 273 (5275), 622-626 (1996).</li>
<li>Wickner, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BURE3%5D+as+an+altered+URE2+protein%3A+evidence+for+a+prion+analog+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">[URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 264 (5158), 566-569 (1994).</li>
<li>Sondheimer, N., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rnq1%3A+an+epigenetic+modifier+of+protein+function+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast.</a> Mol Cell. 5 (1), 163-172 (2000).</li>
<li>Balbirnie, M., Grothe, R., Eisenberg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+amyloid-forming+peptide+from+the+yeast+prion+Sup35+reveals+a+dehydrated+beta-sheet+structure+for+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An amyloid-forming peptide from the yeast prion Sup35 reveals a dehydrated beta-sheet structure for amyloid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2375-2380 (2001).</li>
<li>Glover, J. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9182769">Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae.</a> Cell. 89 (5), 811-819 (1997).</li>
<li>King, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-inducing+domain+2-114+of+yeast+Sup35+protein+transforms+in+vitro+into+amyloid-like+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6618-6622 (1997).</li>
<li>Shorter, J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp104+catalyzes+formation+and+elimination+of+self-replicating+Sup35+prion+conformers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers.</a> Science. 304 (5678), 1793-1797 (2004).</li>
<li>Ferreira, P. C., Ness, F., Edwards, S. R., Cox, B. S., Tuite, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elimination+of+the+yeast+%5BPSI%2B%5D+prion+by+guanidine+hydrochloride+is+the+result+of+Hsp104+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The elimination of the yeast [PSI+] prion by guanidine hydrochloride is the result of Hsp104 inactivation.</a> Mol Microbiol. 40 (6), 1357-1369 (2001).</li>
<li>Caudron, F., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+super-assembly+of+Whi3+encodes+memory+of+deceptive+encounters+by+single+cells+during+yeast+courtship%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A super-assembly of Whi3 encodes memory of deceptive encounters by single cells during yeast courtship.</a> Cell. 155 (6), 1244-1257 (2013).</li>
<li>Wickner, R. B., Edskes, H. K., Shewmaker, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16793280">How to find a prion: [URE3], [PSI+] and [beta].</a> Methods. 39 (1), 3-8 (2006).</li>
<li>Chernoff, Y. O., Derkach, I. L., Inge-Vechtomov, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicopy+SUP35+gene+induces+de-novo+appearance+of+psi-like+factors+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genet%22%5BJournal%5D)">Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Curr Genet. 24 (3), 268-270 (1993).</li>
<li>Brown, J. C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heritable+switch+in+carbon+source+utilization+driven+by+an+unusual+yeast+prion%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A heritable switch in carbon source utilization driven by an unusual yeast prion.</a> Genes Dev. 23 (19), 2320-2332 (2009).</li>
<li>Coustou, V., Deleu, C., Saupe, S., Begueret, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+product+of+the+het-s+heterokaryon+incompatibility+gene+of+the+fungus+Podospora+anserina+behaves+as+a+prion+analog%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (18), 9773-9778 (1997).</li>
<li>Sopko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+pathways+and+phenotypes+by+systematic+gene+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression.</a> Mol Cell. 21 (3), 319-330 (2006).</li>
<li>Chakrabortee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+Disordered+Proteins+Drive+Emergence+and+Inheritance+of+Biological+Traits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intrinsically Disordered Proteins Drive Emergence and Inheritance of Biological Traits.</a> Cell. 167 (2), 369-381 (2016).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaching+a+complete+repository+of+sequence-verified+protein-encoding+clones+for+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae.</a> Genome Res. 17 (4), 536-543 (2007).</li>
<li>Swain, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+time+derivatives+including+cell+growth+rates+using+Gaussian+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Inferring time derivatives including cell growth rates using Gaussian processes.</a> Nat Commun. 7, 13766(2016).</li>
<li>Jarosz, D. F., Lancaster, A. K., Brown, J. C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+prion-like+element+converts+wild+fungi+from+metabolic+specialists+to+generalists%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved prion-like element converts wild fungi from metabolic specialists to generalists.</a> Cell. 158 (5), 1072-1082 (2014).</li>
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<li>Gietz, D., St Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+high+efficiency+transformation+of+intact+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells.</a> Nucleic Acids Res. 20 (6), 1425(1992).</li>
<li>Formosa, T., Nittis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppressors+of+the+temperature+sensitivity+of+DNA+polymerase+alpha+mutations+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Suppressors of the temperature sensitivity of DNA polymerase alpha mutations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Gen Genet. 257 (4), 461-468 (1998).</li>
<li>Christiano, R., Nagaraj, N., Frohlich, F., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+proteome+turnover+analyses+of+the+Yeasts+S.+cerevisiae+and+S.+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Global proteome turnover analyses of the Yeasts S. cerevisiae and S. pombe.</a> Cell Rep. 9 (5), 1959-1965 (2014).</li>
<li>Lancaster, A. K., Nutter-Upham, A., Lindquist, S., King, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLAAC%3A+a+web+and+command-line+application+to+identify+proteins+with+prion-like+amino+acid+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">PLAAC: a web and command-line application to identify proteins with prion-like amino acid composition.</a> Bioinformatics. 30 (17), 2501-2502 (2014).</li>
<li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> J Vis Exp. (17), (2008).</li>
<li>Rogoza, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Mendelian+determinant+%5BISP%2B%5D+in+yeast+is+a+nuclear-residing+prion+form+of+the+global+transcriptional+regulator+Sfp1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfp1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10573-10577 (2010).</li>
<li>Shorter, J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+as+adaptive+conduits+of+memory+and+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Prions as adaptive conduits of memory and inheritance.</a> Nat Rev Genet. 6 (6), 435-450 (2005).</li>
<li>Tanaka, M., Chien, P., Naber, N., Cooke, R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+variations+in+an+infectious+protein+determine+prion+strain+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences.</a> Nature. 428 (6980), 323-328 (2004).</li>
<li>Tanaka, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+protein+transformation+protocol+for+introducing+prions+into+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">An efficient protein transformation protocol for introducing prions into yeast.</a> Methods Enzymol. 412, 185-200 (2006).</li>
<li>Roberts, B. T., Wickner, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+activity%3A+a+prion+that+propagates+by+covalent+autoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Heritable activity: a prion that propagates by covalent autoactivation.</a> Genes Dev. 17 (17), 2083-2087 (2003).</li>
<li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Lim, H. N., Shraiman, B. I., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistability+in+the+lactose+utilization+network+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multistability in the lactose utilization network of Escherichia coli.</a> Nature. 427 (6976), 737-740 (2004).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Os primeiros príons de levedura foram identificados por seus fenótipos incomuns e complexos padrões de herança. As características dos priões foram então usadas para construir algoritmos e ferramentas computacionais para triagem de proteínas príon adicionais. O método descrito aqui, em contraste, é experimental e baseia-se na transitória superexpressão para criar uma duradoura mudança-a estável estado-codificado na conformação da proteína. No entanto, se a eficiência de "semeadura" montagem do prião pela superexpressão p...

Sistemas biológicos frequentemente experimentam flutuações transientes em abundância de proteína. Se estes têm um impacto duradouro na formação do fenótipo de um organismo ou das futuras gerações permanece obscuro. As instâncias mais conhecidas desta biologia envolvem uma rara classe de proteínas, príons, que dirige o surgimento de traços hereditários sem modificação do genoma. Em vez disso, essas partículas de fectious teinaceous e em protransmitem fenótipos através de alterações auto-perpetuar a proteína conformação1,2. Este tipo de herança foi descoberto a causa dos padrões de herança incomum de uma doença neurodegenerativa devastadora. No entanto, estudos em organismos variando de fungos para mamíferos3,4,5,6,7,8,9,10 desde então têm revelado que elementos de prião podem conferir valor adaptativo. Não obstante, os príons têm sido vistos como um fascinante mas rara esquisitice biológica.
Esta sabedoria prevalecente é realizada em parte porque a caracterização de herança baseada em proteína longa foi restringida por um pequeno conjunto de exemplos. Esforços recentes de rastreio sistemático tem alargado esta imagem significativamente identificando vários novo bona fide priões11 e quase duas dúzias de proteína domínios12 com a capacidade de conversão conformacional de príon-como combustível. No entanto, porque essas abordagens têm geralmente focada em preconceitos de sequência de aminoácido forte, os príons que foram descobertos compartilham as propriedades bioquímicas dos fundadores fermento priões [PSI+]13,14, [URE3]15e [RNQ+]11,16. Estes incluem: 1) modulares domínios que são ricas em tempo poliméricos trechos da asparagina (N) e glutamina (Q), 2) montagem em um amiloide [PRIÃO+] conformação17,18,19e 3) completa dependência de disaggregase Hsp104 função de propagação fiel de mãe para filha13,20,21. De fato, muitos bona fide príons, incluindo [GAR+], [Het-s] e mesmo o original do prião (PrPSc), iria ser desperdiçada sob tais critérios rigorosos. Talvez mais importante, eles seria incapazes de capturar qualquer romance, mecanismos de herança baseada em proteína22. Assim, a verdadeira amplitude biológica de tais fenômenos pode ser muito mais comum na natureza do que anteriormente se supunha.
Para investigar esta questão, utilizou-se uma estratégia de alta produtividade, proteoma-largo. Uma marca registrada de todos os príons, incluindo PrPSc, [GAR+], e [Het-s], é que a superexpressão transitória das proteínas causais fortemente aumenta a taxa de prião aquisição15,23,24,25,26. Tiramos vantagem desse recurso que sistematicamente perguntar, em toda a levedura ORFeome, se Estados estáveis à base de proteínas, epigenéticos podem ser iniciados, transitoriamente, induzindo a superexpressão de proteínas individuais. É sabido que superexpressão da proteína pode alterar fenótipos27. No entanto, proteínas príon são incomuns porque sua superprodução temporária produz uma mudança no fenótipo é hereditária para muitas centenas de gerações após a superexpressão inicial. Anteriormente, tiramos proveito desse recurso, bem como os padrões de herança incomum de elementos genéticos à base de proteínas, identificar dezenas de proteínas que são capazes de hereditariedade religação fenotípicas paisagens sem alterar o genoma de28. Embora algumas identificadas proteínas anteriormente eram conhecidos como priões, a maioria eram não, ressaltando o poder desta abordagem para descobrir novas formas de herança à base de proteínas.

<table><tbody><tr><td>Cloridrato de guanidina</td><td>Sigma</td><td>Cat#G3272-25G</td><td>Cloreto de</td></tr><tr><td>manganês</td> químico <td>Sigma</td><td>Cat#M8054-100G</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de etídio</td> químico <td>Sigma</td><td>E1510</td><td>Ácido químico</td></tr><tr><td>5-fluoroorótico</td><td>Sigma</td><td>Cat#F5013-50MG</td><td>Químico</td></tr><tr><td>BY4741 MATa (his3&Delta; 1 leu2&Delta; 0 LYS2 met15&Delta; 0 ura3&Delta; 0)</td><td>Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998</td><td>N/A</td><td>Cepa de levedura</td></tr><tr><td>BY4741 MAT&alpha; (his3&Delta; 1 leu2&Delta; 0 lys2&Delta; 0 MET15 ura3&Delta; 0)</td><td>Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998</td><td>N/A</td><td>Levedura cepa</td></tr><tr><td>Hsp70 (K69M)&nbsp;</td><td>Jarosz et al., 2014b</td> N<td>/A</td><td>Plasmídeo</td></tr><tr><td>FLEXGene biblioteca</td><td>Hu et al., 2007</td><td>N/A</td><td>Plasmídeo biblioteca</td></tr><tr><td>Dextrose (glicose)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-3</td><td>Componente de mídia</td></tr><tr><td>Rafinose</td><td>Sigma</td><td>R0250-25G</td><td>Componente de mídia</td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP656-500</td><td>Componente de mídia</td></tr><tr><td>CSM</td><td>Sunrise Science</td><td>1001-100</td><td>Componente de mídia</td></tr><tr><td>CSM-URA</td><td>Sunrise Science</td><td>1004-100</td><td>Componente de mídia</td></tr><tr><td>CSM-LYS</td><td>Sunrise Science</td><td>1032-100</td><td>Componente de mídia</td></tr><tr><td>CSM-MET</td><td>Sunrise Science</td><td>1019-100</td><td>Componente de mídia</td></tr><tr><td>CSM-LYS-MET</td><td>Sunrise Science</td><td>1035-100 Extrato de</td> levedura <td>de componente de mídia</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td>Componente de mídia</td></tr><tr><td>peptona</td><td>Research Products International</td><td>P20240-5000</td><td>Componente de mídia</td></tr><tr><td>bacto-peptona</td><td>BD</td><td>211677</td><td>Componente de mídia</td></tr><tr><td>glicerol</td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-2</td><td>Componente de mídia</td></tr><tr><td>base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos</td><td>BD</td><td>291920</td><td>Ágar componente de mídia</td></tr><tr><td></td><td>IBI Scientific</td><td>IB49172</td><td>Componente de mídia</td></tr><tr><td>Sulfato de adenina</td><td>Sigma</td><td>A3159-25G</td><td>Componente de mídia</td></tr><tr><td>Acetato de potássio</td><td>Sigma</td><td>P1190-500G</td><td>Componente de mídia</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>Componente de mídia</td></tr><tr><td>Histidina</td><td>Sigma</td><td>H8000-100G</td><td>Componente de mídia</td></tr><tr><td>Leucina</td><td>Sigma</td><td>L8000-25G</td><td>Componente de mídia</td></tr><tr><td>Lisina</td><td>Sigma</td><td>L5501-25G</td><td>Componente de mídia</td></tr><tr><td>RNase I&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0601</td><td>Enzima</td></tr><tr><td>biotinilada DNase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1906</td><td>Enzima</td></tr><tr><td>zimolase 100T (enzima lítica de levedura)</td><td>Sunrise Science</td><td>N0766555</td><td>Enzyme</td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td>BioTek</td><td>Synergy H1</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Microplate stacker</td><td>BioTek</td><td></td><td>BioStack3</td></tr><tr><td>Equipment Plate enchimento</td><td>BiotTek</td><td>EL406</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento Robô de manuseio de líquidos</td><td>Beckman Coulter</td><td>Biomek FX</td><td>Equipment</td></tr></tbody></table>

elevado-throughput screening para herança à base de proteínas no s. cerevisiae

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

A codificação da informação biológica que é acessível para as futuras gerações geralmente é conseguida através de alterações na sequência do DNA. Vida longa herança codificada em proteína conformação (ao invés de sequência) tem sido vista como mudança de paradigma mas raro. Os melhores exemplos caracterizados de tais elementos epigenéticos são príons, que possuem um comportamento de auto-montagem que pode conduzir a manifestação hereditária de novos fenótipos. Muitos príons arquetípicos exibir um marcante viés de sequência N/Q-rico e montam em uma dobra de amiloide. Estas características incomuns informaram a maioria dos esforços de rastreio para identificar novas proteínas príon. No entanto, pelo menos três priões conhecidos (incluindo o fundador prião, PrPSc) não abriga estas características bioquímicas. Portanto, desenvolvemos um método alternativo para sondar o âmbito da herança à base de proteínas com base em uma propriedade de ação das massas: o transiente superexpressão de proteínas príon aumenta a frequência em que eles adquirem uma conformação de automodelagem. Este documento descreve um método para analisar a capacidade da levedura ORFeome eliciar herança à base de proteínas. Usando essa estratégia, encontramos anteriormente que &gt; 1% de proteínas de levedura poderia abastecer o surgimento de traços biológicos que eram long-lived, estável e levantou-se mais frequentemente do que a mutação genética. Esta abordagem pode ser empregada em alto throughput em toda ORFeomes ou como um paradigma de rastreio direcionados para redes genéticas específicas ou estímulos ambientais. Assim como o avançada genéticas telas definem inúmeras vias de sinalização e de desenvolvimento, essas técnicas fornecem uma metodologia para investigar a influência da herança à base de proteínas em processos biológicos.

Sabe-se que a superexpressão de proteínas altera drasticamente os fenótipos celulares27. De fato, com uma abordagem inicial de triagem, centenas de novos fenótipos foram recuperados de forma reprodutível pela superexpressão de clones do ORFeoma da levedura, utilizando apenas dez agentes estressores. No entanto, os ensaios descritos acima permitem avaliar se as células mantêm quaisquer fenótipos estáveis de longo prazo após essa superexpressão. Uma proteína capaz de...

Este protocolo descreve uma metodologia de alta produtividade para a tela funcionalmente para herança à base de proteínas no S. cerevisiae.

Elevado-throughput Screening para herança à base de proteínas no S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

O objetivo geral deste fenotipagem de levedura de alto rendimento é identificar proteínas que induzam uma memória fenotípica duradoura após expressão transitória, como um indicador de herança baseada em proteínas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo dos príons de levedura, como, por exemplo, quantas proteínas são capazes de induzir esse tipo de herança. A principal vantagem desta técnica é que ela permite analisar muitas proteínas e vias de forma imparcial.Inicie este procedimento cultivando as células de levedura apropriadas em uma placa de 96 poços a 30 graus Celsius, conforme descrito no protocolo textual. Inspeccione visualmente os cultivos para confirmar que estão saturados; as células devem ser visíveis a olho nu no fundo de cada poço. Utilize um robô de manipulação líquida para preparar placas de 384 poços, contendo 45 microlitros do meio apropriado por poço.Primeiro, distribua Scal-URA nos poços de uma placa de 384 poços. Em seguida, distribua Scal-URA mais o agente estressante de interesse nos poços de uma segunda placa, sendo utilizado 20 milimolares de cloreto de manganês como agente estressante neste experimento. Em terceiro lugar, distribua SD-URA, que não induzirá a expressão do plasmídeo, mais cloreto de manganês em outra placa.Coloque a placa de 96 poços contendo os cultivos no robô de manipulação líquida e inocular uma matriz de um a quatro de um microlitro de cada poço da placa de 96 poços em quatro poços separados de cada placa de 384 poços preenchida com um meio diferente. Coloque imediatamente as placas com células em um empilhador de microplacas à temperatura ambiente e dióxido de carbono atmosférico. Configure o protocolo para um ciclo contínuo de 72 horas, medindo a densidade óptica em 600 nanômetros com o leitor de microplacas.Após as medições de crescimento, transfira um microlitro por poço das culturas SCal-URA induzidas que sofreram superexpressão proteica para novas placas de 384 poços, contendo 45 microlitros por poço de meio ST-URA que não permite a expressão proteica do plasmídeo. Em paralelo, realize inoculações análogas em um segundo conjunto de placas de 384 poços contendo 45 microlitros por poço de ST-URA, provenientes das culturas cultivadas em ST-URA na presença do agente estressante. Coloque as placas em uma câmara umidificada e incube-as por 48 horas a 30 graus Celsius até a saturação.Após 48 horas, utilize as placas para reinocular um microlitro por poço em placas de 384 poços contendo 45 microlitros por poço de ST-URA. Em seguida, realize uma reinoculação separada de um microlitro por poço da mesma placa fonte em uma placa distinta de 384 poços contendo 45 microlitros por poço de ST-URA com o agente de estresse. Coloque imediatamente as placas com as células no microempilhador à temperatura ambiente e dióxido de carbono atmosférico e configure o protocolo para um ciclo contínuo de 48 horas, medindo a densidade óptica em 600 nanômetros com um leitor de microplacas.Quando as medições de crescimento estiverem concluídas, utilize o software do leitor de placas para exportar o tempo versus densidade óptica em 600 nanômetros como uma tabela XY. Agrupe as colunas das medições de densidade óptica para cada replicata biológica e calcule a média. Crie um gráfico XY de tempo versus densidade óptica em 600 nanômetros para gerar as curvas de crescimento.Para culturas que apresentaram diferenças significativas de crescimento em resposta a um determinado estressor, dependendo da superexpressão da proteína ancestral, retire um microlitro de cada replicata biológica, dilua em 10 mililitros de água e plaque então 50 microlitros em placas contendo 5-FOA. Incube a 30 graus Celsius por três dias. Se isso resultar em excesso ou escassez de colônias por placa, ajuste o fator de diluição conforme necessário.De 100 a 200 colônias por placa é ideal. Escolha de oito a 32 colônias isoladas com palitos de dente autoclavados e transfira-as para placas de 96 poços contendo 150 microlitros de SDCSM por poço. Coloque as placas em uma câmara umidificada e incube até a saturação por 48 a 72 horas a 30 graus Celsius.Use essas culturas para inocular dois novos conjuntos de placas de 96 poços contendo 150 microlitros por poço de SDCSM, ambos com e sem o agente estressante. Coloque as placas em um empilhador de microplacas e configure o protocolo para medir a densidade óptica a 600 nanômetros em um ciclo contínuo de 48 horas. Após 48 horas, analise os dados conforme mostrado anteriormente e confirme que as diferenças significativas de crescimento observadas anteriormente são mantidas após a perda do plasmídeo.As células que mantêm os fenótipos induzidos são então testadas quanto aos marcadores clássicos de herança baseada em proteínas, conforme descrito no protocolo textual. Esta triagem de herança baseada em proteínas revelou que a superexpressão transitória do quadro de leitura aberto PSP1 induz uma resistência ao cloreto de manganês que foi mantida por centenas de gerações nas células, muito tempo após a superexpressão ter cessado. Algoritmos preditores de príons classificaram a extremidade C-terminal de PSP1 como moderadamente semelhante a príons.Em contraste, os algoritmos previram praticamente nenhuma característica de sequência com semelhança a príons significativa na maioria das proteínas indutoras recuperadas na triagem, conforme mostrado nesta análise representativa. Medidas de crescimento de linhagens e SDCSM com cloreto de manganês, normalizadas a um controle correspondente de PSP1 ingênuo sem PSP1, indicaram que a inibição da desagregase HSP104 não prejudica a resistência ao cloreto de manganês dependente de PSP1, enquanto a remoção da chaperona HSP70 e do gene PSP1 elimina herdavelmente esse fenótipo. Todos os esporos provenientes de tétrades individuais de cruzamentos entre linhagens que possuem o estado fenotípico dependente de PSP1 e linhagens ingênuas exibem resistência ao cloreto de manganês, indicando herança não mendeliana do fenótipo.Uma comparação da infectividade para transformação proteica entre lisados controle e lisados contendo PSP1 como material transmissível mostrou que mais de 53% das células ingênuas transformadas com PSP1 semeado adquiriram o fenótipo correspondente de resistência ao cloreto de manganês. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em algumas semanas, incluindo etapas de incubação, e a preparação da maioria das etapas de triagem pode ser feita em menos de duas horas por dia, mesmo com um grande número de placas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de planejar exatamente o que se deseja testar previamente e ter em mente a escala do experimento.Agora, isso é especialmente importante para iniciantes na técnica. Após seguir este procedimento, outros métodos, como os descritos no protocolo textual, podem ser realizados para determinar se os fenótipos observados na triagem exibem um padrão de herança verdadeiro, semelhante ao dos príons. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de epigenética explorarem a amplitude da biologia dos príons em *Saccharomyces cerevisiae*. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como projetar uma triagem de alto rendimento para novas formas de herança baseada em proteínas em leveduras, tanto de maneira imparcial quanto direcionada.Não se esqueça de que certos agentes estressores químicos, como substâncias que danificam o DNA, podem ser extremamente perigosos, e precauções, como o uso de equipamento de proteção individual, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

high-throughput-screening-for-protein-based-inheritance-s

Research

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