Implementação de ressecção de tumor cerebral minimamente invasiva em roedores para coleta de tecido de alta viabilidade

Este é um paradigma de ressecção de tumor cerebral que é altamente necessário em pesquisas pré-clínicas sobre terapêutica para tumores cerebrais. Permite uma ressecção padronizada através de uma abordagem minimamente invasiva, enquanto, ao mesmo tempo, também é acoplado a um sistema automatizado de preservação de tecidos. Esse protocolo permite que o animal sobreviva após a cirurgia e, assim, auxilia na compreensão das mudanças no estado da doença após a terapia no mesmo animal.

Isso ajuda em aplicações terapêuticas sequenciais e de lapso de tempo. Utilizando essa técnica, podemos avaliar a biologia da doença e planejar uma possível gestão subsequente. Isso tem implicações e oportunidades significativas na descoberta de drogas e novas terapêuticas.

Os conceitos de ressecção padronizada, uma abordagem minimamente invasiva e preservação automatizada de tecidos podem ser estendidos a outros tipos de tumores em diferentes sistemas de órgãos, como tumores hepáticos e cânceres de cabeça e pescoço. O protocolo é simples e o sistema é fácil de usar. É melhor ler o protocolo publicado, que contém todas as etapas necessárias e solução de problemas.

Comece o experimento avaliando o mouse para sedação beliscando o dedo do dedo do sol. Aplique pomada oftalmica nos olhos para evitar o ressecamento da córnea. Em seguida, coloque o mouse em uma moldura estereotática.

Remova o grampo da cirurgia anterior e desinfete a pele com ciclos alternados de um esfoliante à base de clorexidina ou betaina e álcool. Em seguida, crie uma incisão longitudinal de um centímetro ao longo da cicatriz cirúrgica anterior usando um bisturi estéril. Conecte a peça da mão MIRS ao braço estereotático através do adaptador de palco.

Para configurar a máquina MIRS, insira o cabo de alimentação no painel traseiro no recipiente do cabo de alimentação. Ligue ou desligue a energia do sistema, toggling entre zero e um. Insira uma extremidade da mangueira de nitrogênio no encaixe masculino no painel traseiro do console.

Gire a porca de conexão no sentido horário para apertá-la. Certifique-se de que a pressão de alimentação não exceda 100 PSIG e conecte a mangueira ao suprimento de nitrogênio. Sele a tampa da porta de vácuo para evitar qualquer vazamento.

Verifique se o botão de aspiração na parte frontal do console está definido em 100, que não há vazamento no sistema de aspiração, e que a pressão de fornecimento de entrada de nitrogênio está correta. Insira o conector do pedal do pé cinza em seu recipiente cinza até que ele clique. Da mesma forma, insira o conector de peça de mão azul em seu recipiente azul.

Prime cada peça de mão aspirando fluido estéril na abertura através da tubulação e peça de mão e, em seguida, para dentro do recipiente para garantir que o interior do tubo e a peça de mão sejam lubrificados. Selecione o modo para aspiração no painel frontal do console e inicie usando o pedal do pé. Insira a cânula MIRS de 23 G no orifício da rebarba a uma profundidade de 2,5 milímetros.

Inicie o processo de ressecção pressionando o pedal do pé conectado à cânula. Realize ciclos completos de ressecção usando o botão de controle na peça de mão. Após o processo de ressecção, retire a cânula MIRS de calibre 23 e adicione cinco mililitros de 1X PBS para lavar o tubo e desalojar quaisquer detritos residuais.

Em seguida, feche a ferida com um grampeador e remova o mouse do quadro estereotático. Devolva o mouse ao bloco de aquecimento para se recuperar da anestesia antes de colocá-lo de volta em sua gaiola. Após o experimento, purga a cânula com mídia gelada e ar para empurrar todo o tecido ressecado de volta para o recipiente de coleta.

Remova o recipiente de coleta do sistema e coloque uma tampa. Em seguida, coloque a ponta distal da cânula em peróxido de hidrogênio de 3% e aplique sucção para preencher a linha de sucção de volta ao recipiente de coleta de sucção. Deixe-o ficar de pé por 60 a 90 segundos e pulso intermitente ar e mídia para lavá-lo.

Mergulhe a amostra de tumor em um prato de cultura tecidual contendo meio de lise RBC por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, coloque um filtro de 70 mícrons em um tubo cônico de 50 mililitros e use um êmbolo de seringa para passar a amostra do tumor através do filtro. Com uma pipeta de transferência, use a mídia RPMI 1640 para passar as células e qualquer massa tecidual através do filtro.

Centrifugar a 428 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernatante e resuspenque cada amostra em cinco mililitros de meio RPMI 1640 preparado. Coloque as amostras em uma incubadora de shaker por 20 minutos a 200 RPM a 37 graus Celsius.

Após a incubação, centrifufique as amostras a 428 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius e descarte o supernaspe. Filtre células únicas através de um coador de células de 70 mícrons e centrífuga a 274 vezes G por três minutos a quatro graus Celsius. Realizar análise de viabilidade celular com azul trypan e hemótmetro.

A ressecção cirúrgica em camundongos que utilizam MIRS causou uma diminuição significativa da carga tumoral, conforme indicado pela redução do sinal bioluminescente médio para grupos com carga tumoral grande e pequena. Em comparação com as imagens de ressonância magnética pré-ressecção dos tumores, a cavidade de ressecção pode ser identificada nos exames pós-ressecção como uma grande área de hipointense redondo no local da inoculação do tumor. Nas seções manchadas de H&E, observou-se uma cavidade de ressecção circular clara com uma borda de produtos sanguíneos, inflamação e células tumorais residuais.

O volume de ressecção aumentou significativamente quando foram realizadas duas rotações da abertura de corte, o que permitiu a otimização do volume de ressecção conforme a carga tumoral. A comparação da sobrevida em camundongos com tumores não tratados versus camundongos submetidos à ressecção de tumores pelo MIRS mostrou um aumento na sobrevida de 16 a 22 dias no pequeno grupo tumoral. Da mesma forma, no grupo com maior carga tumoral, a sobrevida mediana aumentou de 12 para 19 dias.

Imagens leves de microscopia das amostras retiradas do sistema de preservação do tecido apareceram como células únicas com a presença de alguns pequenos pedaços de tecido no dia zero. Após sete dias, as células colhidas com MIRS apresentaram formação da neurosfera em culturas de suspensão, o que indicou seu potencial de iniciação tumoral. É importante limpar e lavar o sistema de tubos logo após o procedimento para evitar um entupimento do sistema.

Após esse procedimento, estudos de eficácia de terapêuticas e estudos sobre marcadores diagnósticos e prognósticos podem ser utilizados em animais sobreviventes após a ressecção cirúrgica com o sistema de ressecção minimamente invasivo.