Name: Edição Gênica de Células B Primárias de Macaco Rhesus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Aprenda a editar genes em células B primárias de macaco rhesus usando CRISPR/Cas9 e rAAV6. Este método eficiente permite testes terapêuticos pré-clínicos e pode ser adaptado para outros tipos celulares.

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Gostaríamos de agradecer a Harry B. Gristick e Pamela Bjorkman por fornecerem o antígeno RC1 e a todos os laboratórios Nussenzweig e Martin para discussão crítica. Este trabalho foi apoiado pela bolsa INV-002777 da Fundação Bill e Melinda Gates (para M.C.N.) e pelo Programa de Pesquisa Intramuros do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, Institutos Nacionais de Saúde. (R.G. e M.A.M). M.C.N. é Investigador do HHMI.

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<li>Hung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+protein-secreting+plasma+cells+by+homology-directed+repair+in+primary+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells.</a> Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).</li>
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<li>Wu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+in+primary+human+B+cells+with+CRISPR-Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering in primary human B cells with CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins.</a> Journal of Immunological Methods. 457, 33-40 (2018).</li>
<li>Luo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+alpha-PD-1+antibody-expressing+long-lived+plasma+cells+by+CRISPR%2FCas9-mediated+targeted+gene+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Engineering of alpha-PD-1 antibody-expressing long-lived plasma cells by CRISPR/Cas9-mediated targeted gene integration.</a> Cell Death and Disease. 11 (11), 973(2020).</li>
<li>Laoharawee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+of+primary+human+B+cells+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Genome engineering of primary human B cells using CRISPR/Cas9.</a> Journal of Visualized Experiments. (165), e61855(2020).</li>
<li>Laoharawee, K., Johnson, M. J., Moriarity, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering+of+primary+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome engineering of primary human B cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2115, 435-444 (2020).</li>
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</ol>

Não são declarados interesses concorrentes.

Os protocolos aqui apresentados fornecem um método rápido e eficiente para gerar altos rendimentos e títulos de rAAV6s como HDRTs e novos métodos para editar eficientemente células B primárias de macaco rhesus in vitro.
O protocolo de produção do rAAV6 é comparativamente simples e rápido, permitindo a produção e teste de muitas construções diferentes simultaneamente sem trabalho excessivo. Se desejado, o rAAV6 pode ser purificado usando protocolos estabelecidos, como ultracentrifugação com gradiente de iodixanol34 ou partição bifásica aquosa35 antes da troca e concentração do tampão.
Embora tenha reduzido o rendimento global, optou-se por usar apenas meio de cultura celular com soro reduzido para a purificação do rAAV6 em vez da purificação do pellet celular, uma vez que a maioria do rAAV6 é liberada no meio36, e a purificação do pellet celular adiciona mais custo e mão de obra. O uso do auxiliar adenoviral auto-inativador aumentou os rendimentos em média de 30 a 40 vezes, permitindo o teste de construtos embalados em AAV6 em um único prato de 15 cm. Embora nosso método de purificação seja básico, usando este método, obtemos relativamente pouca variação lote a lote na eficiência de edição de genes ou viabilidade celular após transdução usando várias linhagens celulares ou outras células primárias (dados não mostrados).
Desenvolvemos um protocolo de purificação de células B de macaco rhesus para obter células B primárias intocadas usando a depleção negativa de populações indesejadas. Embora não seja necessário para a edição gênica dessas células, ele fornece uma maneira de obter uma população relativamente pura de células B primárias de macaco rhesus para esta ou outras aplicações, caso outros tipos celulares interfiram nos objetivos experimentais. No entanto, a pureza vem ao custo de rendimentos globais reduzidos de células B. Notavelmente, para as culturas de células B enriquecidas e não enriquecidas, a fração de células B nas PBMC iniciais ou preparações de espleócitos é crucial. Para PBMCs em particular, recomendamos a triagem de diferentes macacos para indivíduos com uma alta porcentagem de células B no sangue periférico para obter um alto número de células B para experimentos, pois esse valor pode diferir dramaticamente entre os indivíduos27. As CMSP podem ser obtidas por sangramento regular ou leucaferese42.
O protocolo de edição gênica leva à edição gênica eficiente, tipicamente entre 60%-80% de knock-out e 5%-20% de knock-in de células B, embora tenhamos alcançado até 90% de knock-out de BCR e 40% de células B de knock-in de BCR (Figura 5 e Figura 6).
Os principais parâmetros para a edição eficiente de células B de macaco rhesus são a eficiência de corte do sgRNA, os parâmetros de eletroporação, o MOI e a qualidade da preparação de rAAV6. As eficiências de corte dos sgRNAs candidatos devem ser determinadas empiricamente para permitir a edição e o design ideais da HDRT. Os parâmetros de eletroporação aqui apresentados equilibram a eficiência com a viabilidade de obter o número total máximo de células B editadas em vez da maior porcentagem de células B editadas. Se uma porcentagem maior de células editadas for necessária, tensões aumentadas (até 1.750 V) ou comprimentos de pulso alterados (10-30 ms) são recomendados, embora mais morte celular possa ser observada. Também observamos eficiências de edição ligeiramente maiores em células B esplênicas em comparação com células B de PBMCs do mesmo indivíduo (Figura 5); no entanto, a razão subjacente para isso é atualmente desconhecida.
Observamos que a adição de DMSO a 1% após eletroporação aumentou significativamente a eficiência de edição gênica em ~40% em células B de macaco rhesus, sem afetar a viabilidade celular (Figura 6A-C), em concordância com relatos em outras células43. No entanto, a cultura prolongada em DMSO a 1% deve ser evitada e pode afetar a viabilidade celular. O DMSO pode ser completamente omitido, se desejado.
O cultivo das células em pequeno volume após eletroporação por várias horas em conjunto com o rAAV6 leva a maiores eficiências de edição, provavelmente devido à melhor transdução da HDRT pelo rAAV6 e, portanto, à maior concentração intracelular de HDRT no momento relevante em que Cas9 está ativo. Descobrimos que cultivar as células dessa forma por até 8 h não afetou a viabilidade celular, mas as eficiências de edição não aumentaram dramaticamente além de 5 h (Figura 6). Se apenas knock-out em vez de knock-in for necessário, esta etapa pode ser omitida.
Em conclusão, apresentamos protocolos abrangentes para a edição gênica de células B de macaco rhesus in vitro e a produção de rAAV6 HDRT necessária para o knock-in eficiente de construtos desejados. Esses protocolos permitem o teste rápido e custo-efetivo de muitos construtos empacotados como rAAV6 e permitem o teste pré-clínico da viabilidade e escalabilidade de terapias com células B em um modelo de primata não humano mais relevante.

As células B são a base da imunidade humoral. Após ativação por antígeno cognato e sinais secundários, as células B virgens dão origem às células B do centro germinativo, às células B de memória e aos plasmócitos1. Esta última é a fonte dos anticorpos secretados que medeiam as funções protetoras da maioria das vacinas atualmente disponíveis2. Os plasmócitos têm sido descritos como fábricas de anticorpos, pois secretam grandes quantidades de anticorpos no soro - cerca de 2 ng/dia/célula3, totalizando 7-16 g/L de soro, tornando os anticorpos uma das três proteínas mais abundantes no soro4. As células B são abundantes no sangue e podem, portanto, ser facilmente obtidas e infundidas de volta em um indivíduo.
Essas características tornaram as células B um alvo dos esforços de terapia celular para editar genes o receptor de células B (BCR) e expressar anticorpos amplamente neutralizantes (bNAbs) contra o vírus da imunodeficiência humana (HIV)5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 e outras proteínas 16, 17,18,19,20,21. Tais abordagens têm mostrado potencial em inúmeros estudos in vivo em camundongos7,8,10,11,16,22. No entanto, vários obstáculos ainda precisam ser superados para a tradução clínica9,15,23, entre eles a segurança, a duração e a magnitude da eficácia terapêutica, bem como a escalonamento para animais maiores, como primatas não humanos (NHPs). De fato, os NHPs, e em particular os macacos rhesus, que têm uma longa história na pesquisa de anticorpos e HIV24,25, são o modelo mais adequado para testar esses parâmetros.
Aqui, desenvolvemos protocolos que permitem que essas questões sejam abordadas. Até o momento, poucos estudos tentaram cultivar células B de macaco rhesus ex vivo, e apenas a seleção positiva usando CD20 foi relatada para a purificação de células B de macaco rhesus26,27,28. Estabelecemos um protocolo para o isolamento de células B de macaco rhesus intocadas pela depleção negativa de outros tipos celulares. Além disso, condições de cultivo são definidas para a edição gênica direcionada de células B de macaco rhesus. Este protocolo descreve o uso de ribonucleoproteínas CRISPR/Cas9 (RNPs) e vírus adenoassociado recombinante sorotipo 6 (rAAV6) como modelo de reparo dirigido por homologia (HDRT) para editar genes de células B de macaco rhesus cultivadas. Usando este protocolo, eficiências de edição de até 40% com insertos grandes (~1,5 kb) foram alcançadas. Também apresentamos um método rápido e econômico para produzir rAAV6 usando um auxiliar adenoviral autosilenciante habilitado para tetraciclina29 para permitir o teste rápido de HDRTs nesse formato. Combinados, esses protocolos descrevem um fluxo de trabalho eficiente para a edição gênica de células B de macaco rhesus (Figura 1), permitindo a avaliação de terapias com células B em um modelo de NHP.
Para iniciar os experimentos, o material doador pode ser encomendado de fontes comerciais ou obtido por flebotomias ou esplenectomia. Neste estudo, as flebotomias e coletas de sangue foram realizadas conforme descritoanteriormente30 utilizando o anticoagulante EDTA. Para a obtenção de células B esplênicas, primárias de macaco rhesus, foram realizadas esplenectomias parciais (25%-50%) ou totais, utilizando técnicas relatadasanteriormente31. Os animais permaneceram em jejum durante a noite antes da cirurgia. Resumidamente, durante a cirurgia, o abdome foi clipado e preparado com esfoliação alternada de clorexidina e álcool isopropílico a 70% três vezes. Uma incisão (5-10 cm) foi feita no abdome para identificar e isolar o baço. A vasculatura do baço foi ligada com suturas ou pinças vasculares. A incisão foi fechada em duas camadas com pontos de polidioxanona PDS 4-0. A esplenectomia foi realizada uma única vez para um animal individual. Suspensões unicelulares foram preparadas a partir de baços de macacos por maceração através de filtros celulares. Células mononucleares de suspensões de sangue e células esplênicas foram preparadas por centrifugação por gradiente de densidade e armazenadas em nitrogênio líquido.

<table><tbody><tr><td>Tubo de 1,5 mL estéril, sem Dnase, Rnase e purogen Stellar</td><td>Scientific</td><td>T17-125</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>Pipeta sorológica de 10 mL, poliestireno, estéril, não pirogênica, livre de DNase/RNase e sem DNA humano</td><td>Corning</td><td>4488</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 15 cm</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>15 mL de polipropileno cônico Tibe</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>Pipeta sorológica de 25 mL, poliestireno, estéril, não pirogênica, livre de DNase/RNase e livre de DNA humano</td><td>Corning</td><td>4489</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>250 mL de polipropileno cônico Corning</td><td></td><td>430776</td><td>ou linha</td></tr><tr><td>celular 293AAV</td> semelhante <td>Cell Biolabs</td><td>AAV-100</td><td></td></tr><tr><td>2-B-mercapto-etanol, 55mM (1000x)</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Cultura de tecidos de 48 poços placa</td><td>Corning</td><td>3548</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>Pipeta sorológica de 5 mL, poliestireno, estéril, não pirogênica, livre de DNase/RNase e livre de DNA humano</td><td>Corning</td><td>4487</td><td>ou seringas semelhantes</td></tr> de <tr><td>5 mL com ponta Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309646</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>50 mL de polipropileno cônico tybe</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>Pipeta sorológica de 50 mL, poliestireno, estéril, não pirogênica, livre de DNase/RNase e livre de DNA humano</td><td>Corning</td><td>4490</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 6 poços</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>AAV-6 Sistema de Embalagem (plasmídeos)</td><td>Cell Biolabs</td><td>VPK-406</td><td></td></tr><tr><td>AAV6 Materiais de Referência (capsídeos completos)</td><td>Charles River</td><td>RS-AAV6-FL</td><td></td></tr><tr><td>Accu-jet S Controlador de pipeta</td><td>Marca</td><td>26350</td><td>ou controlador de pipeta similar</td></tr><tr><td>Antibiótico/Antimicótico 100x</td><td>Gibco</td><td>15260-062</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CD14 AlexaFluor647</td><td>Biolegend</td><td>301812</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CD14 biotina</td><td>BioLegend</td><td>301826</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CD16 AlexaFluor700</td><td>BD Biosciences</td><td>557920</td><td></td></tr><tr><td>biotina CD16 anti-humana</td><td>BioLegend</td><td>302004</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD20 PECy7</td><td>Biolegend</td><td>302312</td><td></td></tr><tr><td>biotina CD3 anti-humana</td><td>Thermo Fisher</td><td>APS0309</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD3 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>552127</td><td></td></tr><tr><td>biotina CD33 anti-humana</td><td>Miltenyi</td><td>130-113-347</td><td></td></tr><tr><td>biotina CD64 anti-humana</td><td>BioLegend</td><td></td><td></td>305004</tr><tr><td>biotina CD66 anti-humana</td><td>Miltenyi</td><td>130-100-143</td><td></td></tr><tr><td>biotina CD89 anti-humana</td><td>BioLegend</td><td>354112</td><td></td></tr><tr><td>biotina CD8a anti-humana</td><td>BioLegend</td><td>301004</td><td></td></tr><tr><td>anti-humana HLA-DR BV605</td><td>Biolegend</td><td>307640</td><td></td></tr><tr><td>lambda de cadeia leve Ig anti-humana APC</td><td>Biolegend</td><td>316610</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano IgM BV421</td><td>Biolegend</td><td>314516</td><td></td></tr><tr><td>anti-Human Kappa Light Chain FITC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18854</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Steris</td><td>Amsco Lab 250</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>Incubadora de CO2 de cultura celular</td><td>Fisher Scientific</td><td>51026331</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>Unidade de filtro centrífugo (Amicon Ultra - 4, 100 kDa)</td><td>Millipore</td><td>UFC810024</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5920 R</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628188</td><td>ou qualquer outra, centrífuga de balde oscilante refrigerável com insertos para placas de 96 poços, tubos de 15, 50 e 250 mL</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Cpg ODN</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-2395</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34869-500ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, Alta Glicose</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI (livre de RNase)</td> <td>New England Biolabs</td><td>M0303L</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sem cálcio, sem magnésio</td><td>Kit</td> de Eletroporação <td>Gibco 14190144</td><td></td></tr><tr><td>(Sistema de Transfecção Neon 10 &micro; L)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td>ou outros tamanhos ou kit de transfecção de 100 uL MPK 10096</td></tr><tr><td>Sistema de eletroporação (Sistema de transfecção de néon)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03 *</td><td></td></tr> <tr><td>Ficoll-PM400 (Ficoll-Paque PLUS)</td> <td>Cytiva</td><td>17144002</td><td>ou capa de</td></tr><tr><td>exaustão</td> semelhante <td>Fisher Scientific</td><td>FH3943810244</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>Glutamina 200</td><td>mM Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro Graduado 1L</td><td>Corning</td><td>3022-1L</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z375357-1EA</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Agitador Magnético de Placa Quente</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP88857200</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>Humano BAFF</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>310-13</td><td></td></tr><tr><td>Bloco Fc BD Humano</td><td>BD</td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>Humano IL-10</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>Humano IL-2</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de Seringa de Polietersulfona Hidrofílica, (Supor membrana), Estéril - 0.2 &micro; m, 25 mm&nbsp;</td><td>Pall</td><td>4612</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferina-Selênio, 100x</td><td>Gibco</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>ITR primer para a frente: GGAACCCCTAGTGATGGAGTT</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>primer ITR personalizado</td><td></td></tr><tr><td>reverso: CGGCCTCAGTGAGCGA</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>personalizado</td> Gabinete de biossegurança de fluxo laminar The <td></td></tr><tr><td></td><td>Baker Company</td><td>SG403A</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>Grande coluna de depleção magnética (LD)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>Separador Magentic (separador e suporte múltiplo MidiMACS)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-329</td><td></td></tr><tr><td>Barra de agitação magnética</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-127</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>Grânulos magnéticos de estreptavidina (Streptavidin MicroBeads)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>Kit Maxiprep</td><td>Machery-Nagel</td><td>740414.5</td><td>ou</td></tr><tr><td>similar Garrafas de Mídia 2L com tampa</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-34514-26</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>MegaCD40L</td><td>Enzo</td><td>ALX-522-110-C010</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Reação Óptica MicroAmp de 384 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>Filme Adesivo Óptico MicroAmp Fisher</td><td>Scientific</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga 5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000014</td><td>ou qualquer outra centrífuga de mesa para tubos de 1,5 mL</td></tr><tr><td>Forno de microondas</td><td>Panasonic</td><td>NN-SD987SA</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>Nikon TMS Microscópio de contraste de fase invertida</td><td>Nikon</td><td>TMS</td><td>ou qualquer outro microscópio de contraste de fase invertido para cultura de células</td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais, 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Tampão duplex sem nuclease</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>11-01-03-01</td><td></td></tr><tr><td>Água sem nuclease</td><td>Qiagen</td><td>129115</td><td></td></tr><tr><td>medidor de pH</td><td>Mettler Toledo</td><td>30019028</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>Pipetman Classic Starter Kit, 4 Pipeta Kit, P2, P20, P200, P1000 e ponteiras</td><td>Gilson</td><td>F167380</td><td>ou conjunto similar de pipetas e ponteiras</td></tr><tr><td>Pluronic F-68 10 %</td><td>Gibco</td><td>24040-032</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenoglicol 8000</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimina, Linear, MW 25000, Grau de Transfecção (PEI 25K</td><td>Polysciences</td><td>23966-100</td><td></td></tr><tr><td>Balança de Precisão</td><td>Filtros</td><td>de Pré-Separação ME4001TE</td><td>ou similares</td></tr><tr><td>(30 &micro; m)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Copo de vidro Pyrex 2 L</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-34502-13</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>Copo de vidro Pyrex 250 mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS1000250</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>qPCR Instrument</td><td>Fisher Scientific</td><td>4485691</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>Antígeno RC1 aleatoriamente biotinilado</td><td>Bjorkman lab, CalTech</td><td>in house</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>S.p. Cas9 Nuclease</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1081059</td><td></td></tr><tr><td>Scientific 1203 Banho-maria</td><td>VWR</td><td>24118</td><td>ou qualquer banho-maria definido para&nbsp; 37 &deg; C</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de Sódio 100 mM</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Unidades de Filtro Descartáveis Estéreis com Membranas PES</td><td>Thermo&nbsp; Nalgene Científico&nbsp;</td><td>567-0020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidin-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green Master Mix&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>Vetor adenoviral auto-silenciante habilitado para tetraciclina RepCap6&nbsp;</td><td>Oxgene</td><td>TESSA-RepCap6</td><td></td></tr><tr><td>Solução Azul de Tripano, 0,4%</td> <td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Purificação de Água</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZEQ7000TR</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>Zombie-NIR</td><td>Biolegend</td><td>423106</td><td></td></tr></tbody></table>

edição gênica de células b primárias de macaco rhesus

Gene Editing of Primary Rhesus Macaque B Cells

As células B e sua progênie são as fontes de anticorpos altamente expressos. Suas capacidades de alta expressão de proteínas, juntamente com sua abundância, fácil acesso via sangue periférico e facilidade para transferências adotivas simples, tornaram-nas um alvo atraente para abordagens de edição genética para expressar anticorpos recombinantes ou outras proteínas terapêuticas. A edição genética de células B primárias humanas e de camundongos é eficiente, e modelos de camundongos para estudos in vivo têm se mostrado promissores, mas a viabilidade e escalabilidade para modelos animais maiores até agora não foram demonstradas. Por isso, desenvolvemos um protocolo de edição in vitro de células B primárias de macaco rhesus para viabilizar tais estudos. Relatamos condições para cultura in vitro e edição gênica de células B primárias de macaco rhesus a partir de células mononucleares ou esplenócitos do sangue periférico usando CRISPR/Cas9. Para alcançar a integração direcionada de grandes (<4,5 kb), um protocolo rápido e eficiente foi incluído para preparar o sorotipo 6 do vírus adenoassociado recombinante como um modelo de reparo dirigido por homologia usando um vetor auxiliar adenoviral autosilenciador habilitado para tetraciclina. Estes protocolos possibilitam o estudo da terapêutica prospectiva de células B em macacos rhesus.

Apresentamos um método de cultura e edição gênica de células B primárias de macaco rhesus usando CRISPR/Cas9 e vírus adenoassociado recombinante sorotipo 6 para o estudo de terapias com células B.

Edição Gênica de Células B Primárias de Macaco Rhesus

B cells and their progeny are the sources of highly expressed antibodies. Their high protein expression capabilities together with their abundance, easy ...

O método é relativamente simples e permite a edição gênica eficiente de células B de macaco rhesus. O método permite o teste de células B editadas por genes para fins terapêuticos em macacos rhesus. Também é adequado para pesquisa pré-clínica de terapia com células B.O método geral pode ser adaptado para outros tipos celulares. Se o procedimento for seguido corretamente, não se deve esperar dificuldades. No entanto, como a eficiência de corte de gRNA e um lote de boa qualidade de molde AAV6 recombinante são críticos.Para começar, pré-aqueça o meio de cultura de células B em banho-maria de 37 graus Celsius. Descongelar os estimulantes de células B no gelo. Preparar um tubo de tamanho adequado contendo um meio de descongelamento pré-aquecido.Descongelar um a dois frascos de esplenócitos primários de macaco rhesus ou PBMCs em banho-maria de 37 graus Celsius. Decantar os esplenócitos no tubo preparado contendo um meio de descongelamento pré-aquecido. Enxágue os criotubos para coletar todas as células.Centrifugar as células a 200 G durante 10 minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 10 mililitros de meio de descongelamento para lavagem. Repita as centrifugações três vezes para remover o meio de congelamento.Após a última centrifugação, ressuspender as células em uma estimativa de cinco vezes 10 a seis células por mililitro em meio de cultura de células B. Combinar 10 microlitros de suspensão celular com 10 microlitros de azul de tripano a 0,4% e contar as células em um hemocitômetro. Ajustar a concentração celular para três vezes 10 a seis células por mililitro com meio de cultura de células B de acordo com a contagem de células.Em seguida, adicione os estimulantes de células B às suas concentrações finais e misture. Transfira as células para uma placa de cultura celular e incube-as a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 48 horas. Após a colonização, as células devem formar uma monocamada densa e pequenos aglomerados de células podem já estar visíveis.Após cerca de dois dias, as células devem estar saudáveis, irregulares e ter formado aglomerados visivelmente maiores. Após ativar as células B, preparar os reagentes para eletroporação e transdução. Pré-aqueça o tampão duplex livre de nuclease DMSO, o tampão T e o tampão E ou E2 do kit de eletroporação à temperatura ambiente.Descongele o modelo de reparo dirigido por homologia rAAV6, ou HDRT, e os estimulantes de células B no gelo. Ressuspenda o RNA de guia único CRISPR Cas9, ou sgRNA, em 100 micromolares em tampão duplex. Reconstituir por 10 minutos à temperatura ambiente e misturar por vórtice e agitação.Coloque o sgRNA reconstituído no gelo até ser utilizado. Para eletroporação de 10 microlitros, preparar 550 microlitros de meio de cultura de células B com estimulantes e DMSO 1%. Adicionar 50 microlitros deste meio com ou sem antibióticos em uma placa de cultura celular de 48 poços.Em seguida, adicione rAAV6 HDRT ao meio nos poços, até 20% do volume do poço. Pré-aqueça o prato preparado e o meio restante em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Em seguida, para eletroporação de 10 microlitros, prepare 1,15 microlitros de ribonucleoproteína, ou RNP, misturando 0,4 microlitros de Cas9 61 micromolares com 0,75 microlitros de sgRNA 100 micromolares em tampão duplex.Incubar o RNP por 15 minutos à temperatura ambiente antes de misturá-lo com as células. Após a incubação, várias RNPs podem ser combinadas se mais de um locus for alvo simultaneamente. Em seguida, prepare as células para eletroporação.Deixe as células à temperatura ambiente para evitar choques de temperatura. Após a incubação, colher as células em um recipiente apropriado. Lave a placa com DPBS para coletar o número máximo de células.Centrifugar as células a 200 G durante 10 minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em DPBS em aproximadamente duas vezes 10 a seis células por mililitro, com base no número de células colocadas na cultura. Combinar volumes iguais de suspensão celular e azul de tripano a 0,4% e contar usando um hemocitômetro.Após centrifugar e descartar o sobrenadante, ressuspender as células em tampão T pré-aquecido a 5,55 vezes 10 a sete células por mililitro, com base na contagem celular. Configure o sistema de transfecção ligando a máquina e configurando-a para 1.350 volts, 15 milissegundos e um pulso. Coloque a estação de pipetas dentro da capela de fluxo laminar.Para cada conjunto de 10 eletroporações, prepare um tubo de transfecção com três mililitros de tampão E.Insira o tubo na estação de pipeta. Combinar 1,15 microlitros de RNP com nove microlitros de células por eletroporação. Preparar pelo menos 20% mais para evitar bolhas e incubar à temperatura ambiente por um minuto antes da eletroporação.Aspirar 10 microlitros de RNP e mistura celular na ponta de eletroporação em uma pipeta de eletroporação. Insira a pipeta carregada na estação de pipetas e inicie a eletroporação. Certifique-se de que as pontas estejam completamente livres de bolhas de ar para evitar o arranque.Ejetar imediatamente as células eletroporadas para o pequeno volume de meio pré-aquecido preparado, com ou sem rAAV6, dentro do poço 48. Adicionar amostras controle sem transfecção aos poços de cultura. Incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante quatro a seis horas.Ao final da incubação, adicionar 450 microlitros de meio de cultura de células B pré-aquecido contendo estimulantes, DMSO e com ou sem antibióticos na placa. Realizar análise de DNA genômico após 24 horas. Quantifique a eficiência de edição com a reação em cadeia da polimerase digital por gotícula, ou PCR, usando um primer fora do braço de homologia e um primer dentro da inserção.Execute PCR para amplificar o local de inserção e sequenciamento de Sanger para verificar a edição correta. Para análise dos níveis de proteína, cultivar as células por 40 a 48 horas após a eletroporação para permitir alterações na expressão proteica e realizar análise por citometria de fluxo. A produção de rAAV6 usando o auxiliar adenoviral autosilenciante habilitado para tetraciclina resultou na produção de quatro vezes 10 a 10 GC por mililitro de meio de cultura celular, superando a produção usando uma tripla transfecção livre de ajudantes em 30 a 40 vezes.A purificação opcional resultou na eliminação da maioria das células T CD3+ e das células mieloides CD14+ e CD16+, com pureza de 80 a 95% de células B CD20+ sendo rotineiramente obtidas. A edição gênica de células B primárias de macaco rhesus é mostrada aqui. Este estudo manteve alta viabilidade celular, ao mesmo tempo em que excluiu a expressão de cadeias leves em células B a 80%.A maioria das células B ainda expressou o isotipo IgM. A adição de rAAV6 que codifica o anticorpo 1485 HDRT resultou em edição gênica e expressão de superfície do anticorpo 1485 em 16 a 21% das células B, embora em uma intensidade de fluorescência menor para cadeias de anticorpos do que em células B não editadas. A adição de 1% de DMSO e incubações concentradas estendidas com o rAAV6 HDRT geralmente aumentaram a eficiência de edição.Usando este método, tipicamente cinco a 20% e até 40% de eficiência de edição foi alcançada, dependendo do macaco rhesus individual e da qualidade do lote rAAV6 HDRT. Ao realizar a eletroporação, certifique-se de ter mistura suficiente para transfecção e não haja bolhas na ponta. As células podem ser analisadas por qualquer método desejado ou uma transferência autóloga para o macaco rhesus doador pode ser realizada.

gene-editing-of-primary-rhesus-macaque-b-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Demonstramos a utilidade da multicolor citometria de fluxo para caracterização fenotípica e funcional detalhada do total, bem como subconjuntos memória de CD4 + e CD8 + T em macacos rhesus, o modelo ideal para estudos de HIV / AIDS vacina.

Fluxo multicolor de Citometria de Análises de resposta imune celular em macacos rhesus

Descreve-se um método para modificar geneticamente células T primárias humanas com um transgene, utilizando o...

piggyBac modificação do sistema Transposon de células T primárias Humanos

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para enumerar e caracterizar macaco rhesus células T CD8 + contra o vírus da AIDS. Este artigo é útil não só para o campo da imunologia do HIV, mas também a outras áreas de investigação biomédica, onde são conhecidas respostas de células T CD8 + de afectar a evolução da doença.

Análise de células T CD8 específicas do vírus da imunodeficiência símia + Células-T em Rhesus Macaques por Peptide-MHC-I tetrâmero coloração

Utilizando um Cas9 preassembled ribonucleoprotein complexo (RNP) é um método poderoso para edição de genoma preciso e eficiente. Aqui, destacamos a sua utilidade em uma ampla variedade de células e organismos, incluindo células humanas primárias e os dois clássicos e emergentes organismos modelo.

Maior genoma edição com Cas9 Ribonucleoprotein em diversas células e organismos

O objetivo do presente protocolo é isolar os primatas não-humanos CD34+ células de medula aprontada, gene-modificar estas células com vetores Lentivirus e preparar um produto para infusão no hospedeiro autólogo. O comprimento total do protocolo é aproximadamente 48 h.

Preparação e modificação genética de primatas não humanos tronco hematopoiéticas e células progenitoras

É apresentado aqui um protocolo para a edição eficiente do gene de CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-negociado em pilhas de mamíferos usando o electroporation do tubo.

CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteína-mediada por Gene preciso de edição por tubo Electroporation

Delineamos um protocolo de 9 dias para a transdução e expansão de células mononucleares periféricas rhesus macaque que produz células com excelente co-expressão dos genes de interesse em número suficiente para estudos de infusão da eficácia celular.

Transdução e expansão de células T primárias em nove dias com manutenção do fenótipo da memória central

Aqui fornecemos um protocolo detalhado passo a passo para a engenharia do genoma baseada em CRISPR/Cas9 das células B humanas primárias para nocaute genético (KO) e knock-in (KI) para estudar funções biológicas de genes em células B e o desenvolvimento de terapêuticas de células B.

Engenharia de Genoma de Células B Humanas Primárias Usando CRISPR/Cas9

O objetivo deste protocolo é permitir a edição perfeita do genoma C. elegans usando complexos de ribonucleoproteína montados e o marcador co-CRISPR dpy-10 para triagem. Este protocolo pode ser usado para fazer uma variedade de modificações genéticas em C. elegans incluindo inserções, exclusões, substituições genéticas e substituições de codon.

CRISPR/Cas9 Edição do Gene C. elegans rbm-3.2 utilizando o marcador de triagem co-CRISPR dpy-10 e complexos de ribonucleoproteína montados.

Este protocolo descreve o procedimento de edição do genoma em macrófagos derivados da medula óssea de camundongos usando complexos ribonucleoprotéicos Cas9-sgRNA montados in vitro e liberados por eletroporação.

Ruptura Gênica de Alta Eficiência em Macrófagos Primários Derivados da Medula Óssea Usando Complexos Eletroporados Cas9-sgRNA

A entrega de editores genômicos como RNAs é um meio particularmente potente de modificar os genomas das células primárias e linhagens celulares de mamíferos. O objetivo desse protocolo é entregar editores genômicos como mRNA em células e linhagens celulares primárias de mamíferos, seguido por sequenciamento e análise direcionados da Illumina para quantificar os resultados da edição.

Edição do Genoma em Células Primárias de Mamíferos por Eletroporação do RNA Editor

Aprenda a editar genes em células B primárias de macaco rhesus usando CRISPR/Cas9 e rAAV6. Este método eficiente permite testes terapêuticos pré-clínicos e pode ser adaptado para outros tipos celulares.

Edição Gênica de Células B Primárias de Macaco Rhesus

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