Name: Cultura de Organoides 3D Intestinais de Leitões a partir de Criptas Epiteliais Criopreservadas e Estabelecimento de Monocamadas Celulares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:03:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Aprenda a cultivar organoides intestinais 3D de leitões a partir de criptas epiteliais criopreservadas e estabeleça monocamadas celulares para estudar transporte de nutrientes, função de barreira e interações hospedeiro-microbioma.

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Este trabalho foi apoiado pelo Institut Carnot France Futur Elevage (projeto "OrganoPig") e pelo INRAE HOLOFLUX (projeto "Holopig"). Os autores agradecem às instalações centrais de Genotoul (TRI). Agradecemos a Christelle Knudsen (GenPhySE, INRAE, Toulouse) pela revisão cuidadosa.

<ol><li>Peterson, L. W., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+cells%3A+regulators+of+barrier+function+and+immune+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 141-153 (2014).</li>
<li>In, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mini-guts%3A+new+insights+into+intestinal+physiology+and+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Beaumont, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids+in+farm+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids in farm animals.</a> Veterinary Research. 52 (1), 33(2021).</li>
<li>Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+identification+and+stem+cell+culture+in+a+porcine+model+for+the+study+of+intestinal+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration.</a> PLoS One. 8 (6), 66465(2013).</li>
<li>Holthaus, D., Delgado-Betancourt, E., Aebischer, T., Seeber, F., Klotz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harmonization+of+protocols+for+multi-species+organoid+platforms+to+study+the+intestinal+biology+of+toxoplasma+gondii+and+other+protozoan+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Harmonization of protocols for multi-species organoid platforms to study the intestinal biology of toxoplasma gondii and other protozoan infections.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 610368(2021).</li>
<li>Powell, R. H., Behnke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WRN+conditioned+media+is+sufficient+for+in+vitro+propagation+of+intestinal+organoids+from+large+farm+and+small+companion+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals.</a> Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+intestinal+enteroids%3A+a+new+model+for+studying+enteric+coronavirus+porcine+epidemic+diarrhea+virus+infection+and+the+host+innate+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Porcine intestinal enteroids: a new model for studying enteric coronavirus porcine epidemic diarrhea virus infection and the host innate response.</a> Journal of Virology. 93 (5), 01682(2019).</li>
<li>vander Hee, B., Madsen, O., Vervoort, J., Smidt, H., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congruence+of+transcription+programs+in+adult+stem+cell-derived+jejunum+organoids+and+original+tissue+during+long-term+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Congruence of transcription programs in adult stem cell-derived jejunum organoids and original tissue during long-term culture.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 375(2020).</li>
<li>Barnett, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+colonoids+and+enteroids+keep+the+memory+of+their+origin+during+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Porcine colonoids and enteroids keep the memory of their origin during regeneration.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (5), 794-805 (2021).</li>
<li>Mussard, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phenotype+of+the+gut+region+is+more+stably+retained+than+developmental+stage+in+piglet+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The phenotype of the gut region is more stably retained than developmental stage in piglet intestinal organoids.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983031(2022).</li>
<li>Zhu, M., Qin, Y. -C., Gao, C. -Q., Yan, H. -C., Wang, X. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((l-Glutamate+drives+porcine+intestinal+epithelial+renewal+by+increasing+stem+cell+activity+via+upregulation+of+the+EGFR-ERK-mTORC1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Food+%26+Function%22%5BJournal%5D)">l-Glutamate drives porcine intestinal epithelial renewal by increasing stem cell activity via upregulation of the EGFR-ERK-mTORC1 pathway.</a> Food & Function. 11 (3), 2714-2724 (2020).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+vitamin+A+affects+growth+performance%2C+intestinal+development%2C+and+functions+in+weaned+piglets+by+affecting+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Dietary vitamin A affects growth performance, intestinal development, and functions in weaned piglets by affecting intestinal stem cells.</a> Journal of Animal Science. 98 (2), (2020).</li>
<li>Derricott, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+3D+intestinal+epithelium+model+for+livestock+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species.</a> Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).</li>
<li>Khalil, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+culture+system+for+adult+porcine+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">A novel culture system for adult porcine intestinal crypts.</a> Cell and Tissue Research. 365 (1), 123-134 (2016).</li>
<li>Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+three-dimensional+culture+of+equine+intestinal+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells.</a> Equine Veterinary Journal. 50 (2), 241-248 (2018).</li>
<li>Tsai, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+cryogenic+preservation+of+human+biopsy+specimens+and+subsequent+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).</li>
<li>Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+intestinal+organoid+model+of+non-invasive+enteric+pathogen-epithelial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions.</a> Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+porcine+intestinal+organoids%3A+an+apical-out+organoid+model+for+swine+enteric+virus+infection+and+immune+response+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations.</a> Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).</li>
<li>Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+primary+mouse+intestinal+epithelial+cell+monolayer+culture+system+to+evaluate+factors+that+modulate+IgA+transcytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis.</a> Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).</li>
<li>vander Hee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+procedures+for+generating+an+enhanced%2C+near+physiological+2D+culture+system+from+porcine+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids.</a> Stem Cell Research. 28, 165-171 (2018).</li>
<li>Hoffmann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoid-based+2D+monolayers+mimic+physiological+and+pathophysiological+properties+of+the+pig+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoid-based 2D monolayers mimic physiological and pathophysiological properties of the pig intestine.</a> PLoS One. 16 (8), 0256143(2021).</li>
<li>Vermeire, B., Gonzalez, L. M., Jansens, R. J. J., Cox, E., Devriendt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+small+intestinal+organoids+as+a+model+to+explore+ETEC-host+interactions+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Porcine small intestinal organoids as a model to explore ETEC-host interactions in the gut.</a> Veterinary Research. 52 (1), 94(2021).</li>
<li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+evaluation+of+porcine+enteroids+as+PDCoV+infection+model+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Utility evaluation of porcine enteroids as PDCoV infection model in vitro.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 821(2020).</li>
<li>Resende, T. P., Medida, R. L., Vannucci, F. A., Saqui-Salces, M., Gebhart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+swine+enteroids+as+in+vitro+models+for+Lawsonia+intracellularis+infection1%2C2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Evaluation of swine enteroids as in vitro models for Lawsonia intracellularis infection1,2.</a> Journal of Animal Science. 98 (2), 011(2020).</li>
<li>Engevik, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+myosin+VB+gene+to+create+porcine+model+of+microvillus+inclusion+disease%2C+with+microvillus-lined+inclusions+and+alterations+in+sodium+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Editing myosin VB gene to create porcine model of microvillus inclusion disease, with microvillus-lined inclusions and alterations in sodium transporters.</a> Gastroenterology. 158 (8), 2236-2249 (2020).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
<li>Gracz, A. D., Puthoff, B. J., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+isolation%2C+and+culture+of+intestinal+epithelial+stem+cells+from+murine+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Somatic+Stem+Cells%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Identification, isolation, and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine.</a> Somatic Stem Cells: Methods and Protocols. 879, 89-107 (2012).</li>
<li>Ferrandis Vila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+fiber+sources+and+non-starch+polysaccharide-degrading+enzymes+modify+mucin+expression+and+the+immune+profile+of+the+swine+ileum%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Dietary fiber sources and non-starch polysaccharide-degrading enzymes modify mucin expression and the immune profile of the swine ileum.</a> PloS One. 13 (11), 0207196(2018).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-lambda+3+mediates+antiviral+protection+against+porcine+epidemic+diarrhea+virus+by+inducing+a+distinct+antiviral+transcript+profile+in+porcine+intestinal+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">IFN-lambda 3 mediates antiviral protection against porcine epidemic diarrhea virus by inducing a distinct antiviral transcript profile in porcine intestinal epithelia.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2394(2019).</li>
<li>VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-WRN+conditioned+medium+for+gastrointestinal+epithelial+stem+cell+culture+shows+replicable+batch-to-batch+activity+levels+across+multiple+research+teams%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams.</a> Stem Cell Research. 37, 101430(2019).</li>
<li>Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+bovine+3D+enteroid-derived+2D+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers.</a> Veterinary Research. 53 (1), 15(2022).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo descreve um método utilizado para criopreservar criptas epiteliais do intestino de leitões para o armazenamento a longo prazo e posterior cultura de organoides 3D. Este protocolo utiliza uma solução de congelamento contendo DMSO, FBS, inibidor Y27632 ROCK, DMEM e antibióticos. Outro estudo em suínos obteve organoides de criptas criopreservadas em solução de congelamento semelhante, porém sem o inibidor de ROCK15. O inibidor Y27632 ROCK foi incluído para prevenir a apoptose e manter o pool de células-tronco, uma vez que, após o descongelamento, as células epiteliais das criptas são dissociadas, o que pode levar à morte celular ('anoikis')27,28. Curiosamente, enteróides equinos foram obtidos de criptas epiteliais congeladas em meio de cultura contendo apenas DMEM e DMSO16; Este método simples ainda não foi testado para criptas epiteliais de suínos. Outros métodos foram publicados para cultivar organoides humanos e suínos a partir de tecidos congelados ou biópsias em vez de criptas epiteliais 4,17. A vantagem deste método é a capacidade de criopreservar diretamente os tecidos intestinais sem realizar o procedimento de isolamento de criptas, o que requer tempo e equipamentos de laboratório. Isso pode ser conveniente quando os tecidos precisam ser coletados longe do laboratório. No entanto, ao isolar as criptas imediatamente após o abate, grandes segmentos do intestino podem ser processados para obter um número muito alto de criptas, o que não é o caso quando se inicia a partir de pequenos fragmentos de tecido congelado. Após o descongelamento das criptas epiteliais, organoides foram observados de 3 a 4 dias pós-semeadura e divididos após 10 dias. Esta é uma taxa de crescimento mais lenta do que quando se inicia a cultura a partir de criptas epiteliais frescas, para as quais os organoides foram obtidos a partir do 1º dia pós-semeadura, e geralmente pode ser dividida por volta do dia 511. Khalil e col. também relataram um crescimento retardado de enteróides suínos quando se iniciam a partir de criptas congeladas15, sugerindo que as células-tronco podem requerer tempo para recuperar sua capacidade proliferativa. Também obtivemos um número menor de organoides quando partimos de criptas congeladas em comparação com criptas frescas, o que pode ser devido à morte de células-tronco durante o processo de congelamento. Em algumas tentativas de descongelamento de criptas (<20%), não obtivemos organoides de criptas congeladas, provavelmente devido a um procedimento de criopreservação subótimo (por exemplo, congelamento tardio após isolamento de criptas provavelmente mais de 1 h). Assim, recomendamos manter as criptas no gelo até a contagem e congelá-las o mais rápido possível.
Para organoides 3D, optou-se por utilizar um meio de cultura organoide comercial formulado para humanos. De fato, relatos prévios mostraram que organoides intestinais de suínos crescem eficientemente com este meio 8,11,14,19,25,26,29,30. É de interesse que este meio de cultura esteja pronto para uso e tenha uma concentração padronizada de fatores de crescimento dentro de um lote. No entanto, esse meio de cultura é caro, sua composição não é revelada e, portanto, não é possível modular sua composição. Em contrapartida, outros estudos cultivaram organoides intestinais de suínos em meios personalizados contendo inibidores farmacológicos, fator de crescimento recombinante e/ou meios condicionados 5,6,7,21. Embora altamente flexível e mais barato, este método é demorado para a produção de meios condicionados e pode carecer de reprodutibilidade devido à potencial variabilidade na concentração de fatores de crescimento em meios condicionados. Assim, a qualidade de cada lote de meio condicionado deve ser validada pela medida do crescimento organoide ou da expressão gênica do marcador31.
Um estudo mostrou que organoides jejunais de suínos cultivados no mesmo meio de cultura organoide comercial aqui utilizado cresceram mais rapidamente e pareceram menos diferenciados, em comparação com enteroides cultivados com meios contendo fator de crescimento recombinante e/ou meios condicionados23. Um alto estado proliferativo facilita a cultura de organoides 3D, mas pode exigir a indução da diferenciação para ser mais representativa das características fisiológicas intestinais. Neste protocolo, para a passagem de organoides 3D, as células são totalmente dissociadas para contagem, permitindo controlar o número de células semeadas na MEC. Isso aumenta a reprodutibilidade do fenótipo dos organoides, que é altamente influenciado por sua densidade. Além disso, a contagem das células evita a obtenção de uma cultura muito baixa ou superlotada, o que requer a adaptação do cronograma de cultura. A maioria dos outros estudos preparou fragmentos organoides não totalmente dissociados de células isoladas e usou uma razão de diluição para a passagem. Este método é mais simples, mas pode induzir variabilidade de acordo com a densidade organoide da cultura.
Para o cultivo em monocamadas, as células organoides são semeadas em pastilhas de cultura pré-revestidas com uma fina camada de MEC, que permite a fixação das células, mas evita o crescimento de organoides em 3D. Esse protocolo utilizou colágeno tipo IV como proteína da MEC, como descrito anteriormente em suínos23. Outros estudos com monocamadas organoides de suínos utilizaram a mesma MEC derivada do tumor aqui utilizada para cultura de organoides 3D 6,8,9,21,25,30. A vantagem do uso do colágeno é a capacidade de padronizar a concentração proteica com uma composição totalmente definida, o que não é o caso da MEC derivada do tumor. Um passo crítico para o sucesso da cultura de monocamadas celulares é prestar atenção à aparência visual dos organoides precursores 3D, que devem ter bordas bem definidas e um lúmen vazio sem detritos pretos. De fato, organoides com alto nível de maturação e baixa taxa proliferativa não são uma fonte apropriada de células para cultura 2D. Assim, o momento da dissociação dos organoides 3D em células isoladas é crucial para o sucesso desta etapa.
O cultivo de monocamadas 2D a partir de células isoladas permite padronizar o número de células semeadas, o que é mais difícil quando se inicia a partir de fragmentos organoides, como realizado em alguns outros métodos. Semeamos 7,6 x 10 5 células por cm 2, o que é alto em comparação com a maioria dos outros estudos 21,22,23 em suínos que utilizaram uma densidade celular menor, variando de 0,25 x 10 5 células por cm 2 a 1,78 x 10 5 células por cm 2. A exigência de um número elevado de células organoides constitui uma limitação deste protocolo, mas nos permitiu obter rapidamente uma monocamada confluente, cobrindo totalmente a inserção da cultura após 1 dia. Em contraste, Vermeire et al.23 obtiveram confluência após 4-7 dias com menor densidade de células semeadas (de 0,25 x10 5 células/cm 2 a 0,4 x 105 células/cm2). Alguns estudos também utilizaram monocamadas de células organoides de suínos que não cobriam totalmente a superfície de cultura para infecções por vírus 8,30. Nessas condições, o lado apical das células epiteliais é acessível para tratamentos, mas monocamadas totalmente confluentes são necessárias se o objetivo for estudar a absorção de nutrientes ou a permeabilidade epitelial.
Para as monocamadas de células organoides, foi utilizado meio de cultura organoide comercial suplementado com SFB a 20%, baseado em estudo recente sobre monocamadas derivadas de enteróides bovinos32. Em nossos testes, a suplementação com 20% de SFB foi necessária para a obtenção de monocamadas totalmente confluentes, provavelmente devido à alta exigência de fator de crescimento. Ao contrário, outros estudos utilizando o mesmo meio comercial estabeleceram monocamadas sem FBS adicional 8,25,30, mas sem atingir confluência completa. Outros estudos também utilizaram a suplementação com SFB a 20% em meio personalizado para cultura de monocamadas de células organoides suínas21,22. Em nossos experimentos, o TEER é alto 1 dia após a semeadura (em torno de 700 Ω·cm 2), e permanece alto até o dia 3 (em torno de 1.500 Ω·cm2; isso é consistente com a formação de tight junctions, como indicado pela expressão de occludina. obtiveram valores TEER semelhantes ao longo de 72 h para monocamadas de células organoides do jejuno21. Eles também demonstraram que as monocamadas podem ser mantidas até o dia 12-15 com trocas diárias de meio. Em contraste, outros estudos relataram valores TEER muito mais baixos (em torno de 200 Ω·cm2) para monocamadas de células organoides de suínos 6,22. Essas diferenças entre os estudos podem estar relacionadas ao segmento intestinal estudado ou aos meios utilizados que influenciam a diferenciação epitelial.
Em conclusão, o protocolo acima para o cultivo de organoides 3D intestinais de suínos a partir de criptas epiteliais congeladas facilita a organização do trabalho de cultura. Reduz a necessidade de obter tecidos frescos de animais vivos. Também explicamos como estabelecer monocamadas celulares totalmente confluentes derivadas de organoides suínos em menos de 3 dias. Assim, nossos protocolos poderiam ser recursos úteis para cientistas que estudam o epitélio intestinal de suínos para pesquisas veterinárias ou biomédicas.

O epitélio intestinal é formado por uma monocamada de células que recobre a mucosa digestiva na interface com o meio luminal. Essa posição está associada a diversas funções, como absorção de nutrientes e função de barreira, que são suportadas pela presença de células-tronco e múltiplos tipos de células epiteliais diferenciadas (absortivas, enteroendócrinas, paneth e caliciformes)1. Linhagens celulares imortalizadas tradicionalmente utilizadas para o estudo de células epiteliais apresentam grandes limitações, pois não refletem a complexidade celular do epitélio intestinal e apresentam anormalidadesgenômicas2. O desenvolvimento de organoides tridimensionais (3D) por Sato et al.3 forneceu um novo modelo para o estudo do epitélio intestinal com melhor relevância fisiológica. De fato, os organoides intestinais são derivados de células-tronco não transformadas, são compostos por vários tipos celulares e recapitulam a funcionalidade do epitélio intestinal. Os organoides intestinais estão sendo cada vez mais utilizados para compreender o desenvolvimento e as funções do epitélio intestinal e suas interações com patógenos, nutrientes, toxinas, fármacos, microbiota e seus metabólitos2.
Inicialmente desenvolvidos para humanos e camundongos, os métodos utilizados para cultivo de organoides intestinais foram recentemente adaptados para outras espécies, incluindosuínos4. Gonzales et al.5 foram os primeiros a cultivar organoides de suínos a partir do jejuno; Desde então, organoides suínos têm sido descritos para outros segmentos intestinais (duodeno, íleo e cólon)6,7,8 e demonstraram manter um fenótipo local-específico9,10,11. Organoides 3D intestinais de suínos são atualmente comumente utilizados para estudar o efeito de nutrientes 12,13 ou infecções entéricas 6,8,14.
A maioria dos estudos descreveu a cultura de organoides intestinais a partir de criptas epiteliais recém-isoladas. No entanto, isso nem sempre é viável por razões logísticas, principalmente quando se trabalha com animais de grande porte, como porcos. De fato, as instalações para animais para suínos podem ser localizadas longe do laboratório onde os organoides são cultivados, o que dificulta a organização do trabalho. Além disso, a cultura de organoides é demorada; Assim, não é prático cultivar simultaneamente múltiplas linhas organoides, por exemplo, a partir de diferentes segmentos intestinais ou vários animais. Para contornar essas questões, poucos estudos em humanos, equinos e suínos descreveram métodos para cultura de organoides a partir de tecidos intestinais congelados (ou biópsias) ou de criptas epiteliais isoladas 4,15,16,17. Esses métodos permitem a criopreservação de células-tronco epiteliais intestinais de múltiplos segmentos intestinais de um único animal, que podem ser usadas para cultivar organoides quando necessário. Além disso, isso permite uma forte redução no número de animais vivos utilizados como doadores de células-tronco, uma vez que grandes estoques de criptas criopreservadas podem ser criados (princípios do 3R). Outra vantagem deste método é o crescimento de organoides intestinais apenas a partir de animais de interesse após a obtenção de resultados fenotípicos ou genotípicos, o que é altamente custo-efetivo.
In vivo, as células epiteliais intestinais são polarizadas, com o lado apical direcionado para a luz. In vitro, em organoides 3D, o lado apical das células epiteliais também está voltado para o lúmen (ou seja, dentro dos organoides)4. Essa organização impede o acesso ao lado apical, o que é um problema ao estudar os efeitos de componentes luminais (por exemplo, nutrientes, micróbios, metabólitos) nas células epiteliais. Para contornar essa desvantagem, vários métodos têm sido desenvolvidos, como o cultivo de células organoides como monocamadas 2D, microinjeção e reversão de polaridade ("apical-out organoids")18,19. A cultura de monocamadas de células organoides vem emergindo como o sistema mais eficiente e tratável. O princípio é dissociar organoides 3D em células únicas e semeá-los em um vaso de cultura celular previamente revestido com uma fina camada de matriz extracelular (MEC)20. Nessas condições de cultura, a face apical das células epiteliais está voltada para cima, sendo, portanto, acessível a tratamentos experimentais20. A cultura de monocamadas de células organoides foi recentemente adaptada para o intestino desuínos 21,22; monocamadas celulares derivadas de organoides 3D de suínos têm sido utilizadas para múltiplas aplicações, incluindo o estudo de infecções entéricas 6,23,24,25, o transporte de nutrientes9 e a modelagem de doenças digestivas 26.
Aqui, este estudo apresenta primeiramente um protocolo detalhado para o cultivo e manutenção de organoides 3D intestinais de suínos derivados de criptas epiteliais criopreservadas (Figura 1). Em seguida, um protocolo é descrito para estabelecer monocamadas celulares a partir de organoides 3D intestinais de suínos. Os métodos aqui descritos fornecem ferramentas experimentais que podem ser usadas para estudar o epitélio intestinal de suínos quanto ao transporte de nutrientes, função de barreira e interações hospedeiro-microrganismo.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td>Armazenar em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Tubo cônico de 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 24 poços </td><td>Corning</td><td>003526</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 48 poços </td><td>Corning</td><td>003548</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de polipropileno de 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Euromedex</td><td>A6003</td><td>Armazenar a 4 graus C.</td></tr><tr><td>Centrífuga Universal 320 R</td><td>Hettich</td><td>1406</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno tipo IV da placenta humana</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>Prepare a solução de estoque a 1 mg/mL em ácido acético de acordo com a recomendação do fabricante. Alíquota (500 &micro; L) e armazene a -20 ° C. </td></tr><tr><td>CoolCell LX Recipiente de Congelamento de Células</td><td>Corning</td><td>432003</td><td>Usado para criopreservar criptas e organoides. </td></tr><tr><td>Contador de Células Automatizado Countess 3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16842556</td><td></td></tr><tr><td>Covers, 22 mm x 50 mm</td><td>VWR</td><td>630-1845</td><td></td></tr><tr><td>Cryotube ClearLine 1 mL</td><td>Linha transparente </td><td>390706</td><td>Usado para criopreservar criptas e organoides. </td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Preparar a solução-mãe a 5 mg/ml em água, de acordo com o fabricante» s recomendação. Alíquota (20 &micro; L) e armazene a -20 &graus; C </td></tr><tr><td>Ditiotreitol (TDT) </td><td>Merck</td><td>10197777001</td><td>Store a 4 °C.</td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta, suplemento GlutaMAX, piruvato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31966047</td><td>armazenar a 4 °C.</td></tr><tr><td>DMSO (Dimetil Sulfóxido)</td> <td>Corning</td><td>25-950-CQC</td><td>Armazenar em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Epredia Superfrost Plus Adhesion lâmina microscópica</td><td>VWR</td><td>631-9483 </td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td>Armazene alíquotas de 5 mL a -20 °C.</td></tr><tr><td>Filtros de Células Estéreis Fisherbrand</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td>Usado para isolamento de cripta. </td></tr><tr><td>Rotador de plataforma 3D de inclinação fixa </td><td>VWR</td><td> 97025-564 </td><td>Usado para incubações no protocolo de imunocoloração. </td></tr><tr><td>Gibco PBS, pH 7,4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010015</td><td>Store a 4 ° C.</td></tr><tr><td>Enzima Gibco TrypLE Express (1x), fenol vermelho</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605-010</td><td>Reagente de dissociação enzimática. Armazene em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>IgG anti-coelho de cabra, Alexa fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>Anticorpo secundário. Armazenar a 4 °C. Diluição de trabalho 1:1000. </td></tr><tr><td>Meio de Crescimento Organoide IntestiCult (Humano)</td><td>Tecnologia de Células-Tronco</td><td>6010</td><td>Meio de cultura organoide. Armazene a -20 ° C. Descongele o meio basal e o suplemento organoide em temperatura ambiente e misture (1: 1). Armazene a mistura a 4 & graus; C por até 1 semana. </td></tr><tr><td>Inserto com membrana PET transparente Falcon para placa 24 poços</td><td>Corning</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Nikon</td><td> Eclipse TS2</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matriz de membrana basal</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Matriz extracelular derivada de tumor usada para a cultura 3D de organoides. Matrigel polimeriza à temperatura ambiente. Use pontas resfriadas para pipetar o Matrigel. Prepare 500 &micro; L alíquotas e armazene a -20 ° C.</td></tr><tr><td>Meio de montagem para fluorescência com DAPI</td><td>Vectashield</td><td>H1250</td><td> Armazenar a 4 °C. </td></tr><tr><td>Anticorpo policlonal de oclusina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>71-1500</td><td>Anticorpo primário. Armazene a -20 ° C. Diluição de trabalho 1:200. </td></tr><tr><td>Paraformaldeído 32%</td><td>Ciência da microscopia eletrônica</td><td>15714</td><td>Prepare a solução de paraformaldeído (PFA) a 4% sob a capa química adicionando 5 mL de PFA a 32% a 35 mL de PBS. Alíquota por 10 mL e armazenar a -20 ° C.</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>Antibacteriano. Armazene alíquotas de 5 mL a -20 °C.</td></tr><tr><td>Sonda Phalloidin TRITC</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>para coloração de actina. Solução estoque de 1 mg/mL. Armazene a 4 ° C.</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-05</td><td>Agente antimicrobiano para células primárias que atuam sobre bactérias, micoplasma e fungos. Armazene a -20 ° C.</td></tr><tr><td>Inibidor de ROCK (Y27632)</td><td>ATCC</td><td>ACS-3030</td><td>Usado para manter as células-tronco. Preparar a solução-mãe a 10 mM em água estéril de acordo com a recomendação do fabricante e armazenar alíquotas (50 &micro; L) a -20 °C.</td></tr><tr><td>Mistura de agitador rotativo XL</td><td>Clear line </td><td>062646CL</td><td>Usado para isolamento de cripta. </td></tr><tr><td>Pipetas Sorológicas Stripette 10 mL</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Tecidos </td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>8787</td><td>Armazene em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Mancha azul tripano 0,4% </td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td>Armazene em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Sistema de vácuo Vacusip</td><td>Integra</td><td>159000</td><td>Usado para remover o meio de poços organoides. </td></tr></tbody></table>

cultura de organoides 3d intestinais de leitões a partir de criptas epiteliais criopreservadas e estabelecimento de monocamadas celulares

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Os organoides intestinais estão sendo cada vez mais usados para estudar o epitélio intestinal para modelagem de doenças digestivas, ou para investigar interações com drogas, nutrientes, metabólitos, patógenos e a microbiota. Métodos para cultivar organoides intestinais estão agora disponíveis para várias espécies, incluindo porcos, que é uma espécie de grande interesse tanto como animal de criação quanto como modelo translacional para humanos, por exemplo, para estudar doenças zoonóticas. Aqui, descrevemos em profundidade um procedimento usado para cultivar organoides 3D intestinais de suínos a partir de criptas epiteliais congeladas. O protocolo descreve como criopreservar criptas epiteliais do intestino de suínos e os procedimentos subsequentes para cultura de organoides intestinais 3D. As principais vantagens deste método são (i) a dissociação temporal do isolamento de criptas da cultura de organoides 3D, (ii) a preparação de grandes estoques de criptas criopreservadas derivadas de múltiplos segmentos intestinais e de vários animais ao mesmo tempo e, portanto, (iii) a redução da necessidade de coletar amostras de tecidos frescos de animais vivos. Também detalhamos um protocolo para estabelecer monocamadas celulares derivadas de organoides 3D para permitir o acesso ao lado apical das células epiteliais, que é o local de interações com nutrientes, micróbios ou drogas. De modo geral, os protocolos aqui descritos são um recurso útil para o estudo do epitélio intestinal de suínos em pesquisas veterinárias e biomédicas.

Seguindo o protocolo descrito acima, criptas epiteliais são obtidas do intestino de suínos e criopreservadas para armazenamento em nitrogênio líquido a longo prazo (Figura 1 e Figura 2A). Após o descongelamento, as células-tronco das criptas são semeadas na MEC (Figura 2B). A estrutura da cripta é geralmente perdida após esta etapa, devido à desintegração da estrutura da cripta no ECM. Os organoides podem ser observados dentro de 3-4 dias, e então crescem rapidamente e desenvolvem estruturas em brotamento (Figura 2B). Obtivemos organoides após o descongelamento de criptas congeladas em &gt;80% das tentativas. Aproximadamente 10 dias após o descongelamento (de acordo com a taxa de crescimento dos organoides), é realizada a passagem dos organoides para expansão da cultura (Figura 3). Os organoides crescem mais rapidamente após a secundarização, e apresentam morfologias diversas, com alguns organoides císticos e a maioria de brotantes. Para uma ótima manutenção da cultura, os organoides utilizados para a passagem devem apresentar lúmen claro e vazio e bordas bem definidas (exemplos indicados por setas verdes) sem restos pretos no lúmen (indicados por setas vermelhas), como observado em organoides maduros (Figura 3). Descobrimos que os detritos de células pretas começam a se acumular por volta do 6º dia pós-passagem. Assim, recomenda-se dividir ou congelar os organoides no dia 4-5 pós-passagem.
O estágio de maturidade dos organoides também é um ponto importante na obtenção de monocamadas celulares. Organoides com maturidade avançada (indicada pela presença de restos de células pretas no lúmen) não são ideais para semear monocamadas. Costumamos dissociar organoides 3D 4 dias após a passagem para coletar células para cultura 2D. Aproximadamente um a três poços de organoides 3D cultivados a 3.000 células por cúpula de 50 μL da MEC são necessários para semear uma pastilha de cultura com 2,5 x 105 células. As células se ligam e formam uma monocamada totalmente confluente em 1 dia (Figura 4A), o que é confirmado pelo TEER alto de cerca de 700 Ω·cm2 (Figura 4B). No entanto, as bordas celulares são difíceis de visualizar por microscopia de campo claro neste momento inicial, provavelmente devido a um baixo nível de diferenciação. O TEER permanece elevado por 3 dias (Figura 4B).
A coloração de actina indica que a face apical das células epiteliais está orientada para o lúmen em organoides 3D (Figura 5A). As células organoides semeadas em cultura inserem uma única camada confluente de células epiteliais, com o lado apical orientado para o compartimento superior (Figura 4B,C). A coloração oclusal revela a presença de tight junctions na face apical das células epiteliais em organoides 3D e em monocamadas celulares (Figura 5A-C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig01.jpg"> Figura 1: Representação esquemática dos métodos utilizados para cultura de organoides 3D e monocamadas celulares derivadas de organoides. As criptas epiteliais são isoladas do intestino do leitão. Essas criptas podem i) ser usadas imediatamente para cultura de organoides 3D ou ii) ser congeladas e armazenadas em um biobanco em nitrogênio líquido. Criptas criopreservadas podem ser descongeladas e usadas para cultivar organoides 3D. A cultura organoide 3D pode ser mantida com bipartição sucessiva, ou congelada e armazenada no biobanco. Monocamadas celulares podem ser obtidas a partir da cultura organoide 3D para permitir o acesso ao lado apical das células e estudar a função de barreira epitelial. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig02v2.jpg"> Figura 2: Cultura de organoides 3D intestinais de suínos a partir de criptas epiteliais criopreservadas. (A) Imagem microscópica representativa de criptas jejunais recém-isoladas. (B) Imagens microscópicas representativas de organoides 3D obtidas após o descongelamento das criptas jejunais. Os organoides foram cultivados em uma cúpula de 25 μL de MEC em uma placa de 48 poços. A figura mostra imagens dos organoides 3D aos 4, 7, 8, 9 e 10 dias pós-semeadura. A barra de escala representa 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig03v2.jpg"> Figura 3: Morfologia de organoides 3D intestinais de suínos derivados de criptas epiteliais criopreservadas após a primeira passagem. Imagens microscópicas representativas mostrando o desenvolvimento de organoides derivados de criptas criptas criopreservadas do jejuno após a primeira passagem do dia 4 para o dia 7. As setas verdes indicam organoides claros apropriados para a passagem ou semeadura de monocamadas. As setas vermelhas indicam organoides maduros não adequados para dividir ou semear monocamadas; Assim, poços devem ser utilizados antes da aparição desta morfologia. A barra de escala representa 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig04v2.jpg"> Figura 4: Características das monocamadas celulares derivadas de organoides 3D intestinais de suínos . (A) Imagens microscópicas representativas da morfologia da monocamada ao longo de 3 dias. As células organoides do jejuno foram semeadas a 2,5 x 10,55 células em pastilhas de cultura de células de 0,33cm2 revestidas com colágeno IV a 50 ng/mL. A barra de escala representa 500 μm. (B) Resistência elétrica transepitelial (TEER) de monocamadas de células organoides durante 3 dias. Pontos conectados por uma linha correspondem ao mesmo poço em momentos diferentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig05v2.jpg"> Figura 5: Imagem de organoides do jejuno de suínos cultivados em 3D ou 2D. Microscopia confocal de (A) organoides 3D 5 dias após a divisão e (B,C) monocamadas de células organoides 3 dias após a semeadura (B: secção XZ; C: seção XY). DNA (azul) foi corado com DAPI. Actina (vermelho) foi corada com faloidina. A ocludina (verde) foi corada com anticorpo policlonal. Setas brancas indicam ocludina localizada na junção apertada. A barra de escala representa 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Neste trabalho, descrevemos um protocolo de cultivo de organoides 3D intestinais de suínos a partir de criptas epiteliais criopreservadas. Descrevemos também um método para estabelecer monocamadas celulares derivadas de organoides 3D, permitindo o acesso ao lado apical de células epiteliais.

Cultura de Organoides 3D Intestinais de Leitões a partir de Criptas Epiteliais Criopreservadas e Estabelecimento de Monocamadas Celulares

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

Nosso protocolo fornece ferramentas para o estudo do epitélio intestinal de suínos para pesquisas veterinárias e biomédicas. Organoides intestinais de suínos podem ser usados para estudar o transporte de nutrientes, a função de barreira e as interações hospedeiro-micróbio. Através da preservação de criptas epiteliais intestinais de suínos permitem criar um grande estoque de células-tronco que posteriormente podem ser usadas para cultura de organoides em monocamadas 3D ou 2D.Esse protocolo é detalhado para o jejuno, mas também pode ser usado para outros segmentos intestinais, como duodeno, íleo e cólon. Para começar, descongele rapidamente um frasco contendo 900 criptas congeladas em banho-maria a 37 graus Celsius. Transfira a solução da cripta para um tubo cônico de 15 mililitros.Centrifugar a 300 x g durante cinco minutos à temperatura ambiente e retirar o sobrenadante. Adicionar 150 microlitros da matriz extracelular ou MEC com uma ponta resfriada para obter uma concentração final de 150 criptas por 25 microlitros de MEC. Pipetar para cima e para baixo 10 vezes para obter uma suspensão homogênea de criptas na MEC.Semeando seis poços com uma gota de 25 microlitros por poço em uma placa pré-aquecida de 48 poços. Incubar por 30 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para polimerização da MEC. Adicionar 250 microlitros por poço de cultura de meio à temperatura ambiente e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Troque o meio de cultura a cada dois ou três dias. Para passar organoides 3D derivados de criptas congeladas 10 dias após a semeadura, remova o meio de cultura e adicione 250 microlitros de PBS pré-aquecido a 37 graus Celsius. Após a incubação, substituir o PBS por 250 microlitros de reagente de dissociação enzimática pré-aquecido suplementado com 10 inibidor de rocha micromolar a 37 graus Celsius em cada poço.Separar os organoides na MEC raspando com pipeta P-1000 e homogeneizar cuidadosamente por pipetagem cinco vezes. Incubar durante cinco minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono antes de dissociar as células pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Adicione 500 microlitros de DMEMc em cada poço contendo células dissociadas e puxe até 12 poços em um tubo cônico de 15 mililitros contendo três mililitros de DMEMc frio.Centrifugar a 500 x g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em um mililitro de DMEMc frio. Conte as células com uma diluição de um a dois em azul de tripano com um contador de células.Centrifugar o volume necessário da solução celular para ter 3000 células vivas por cúpula. Ressuspender o pellet com 17 microlitros de DMEMc frio por 3000 células vivas no gelo. Ajuste o volume ao número necessário de poços.Adicione lentamente 33 microlitros de ECM frio por 3000 células vivas. Ajuste o volume ao número necessário de poços e homogeneize sem fazer bolhas. Em seguida, veja os poços com 50 microlitros da suspensão da célula ECM por poço em uma placa pré-aquecida de 24 poços e incube por 30 minutos para polimerização da MEC.Adicione 500 microlitros do meio de cultura por poço. Em seguida, incube e troque o meio de cultura a cada dois ou três dias. Para revestir a pastilha de cultura, prepare a solução de revestimento contendo colágeno IV diluído a 50 microgramas por mililitro em PBS frio.Adicionar 150 microlitros da solução de revestimento diluída a cada pastilha de cultura celular e incubar durante a noite ou durante três horas. Cinco dias após a bivisão, desprender os organoides com a MEC raspando-os com uma pipeta P-1000. Homogeneizado cuidadosamente por pipetagem no meio de cultura e transferido para um tubo cônico de 15 mililitros contendo cinco mililitros de DMEMc frio sobre gelo.Centrifugar os organoides recolhidos a 500 x g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em um mililitro de reagente de dissociação enzimática pré-aquecido suplementado com 10 inibidor de ROCK micromolares. Pipetar para cima e para baixo 10 vezes para iniciar a dissociação dos organoides.Incubar por cinco minutos em banho-maria de 37 graus Celsius para digestão enzimática. Interrompa mecanicamente os organoides pipetando 10 vezes e adicione quatro mililitros de DMEMc gelado. Centrifugar e descartar o sobrenadante antes de ressuspender o pellet de células organoides em um mililitro de DMEMc.Contar as células em azul de tripano com um contador de células e calcular o volume necessário para semear 2,5 vezes 10 até a quinta célula por inserção de cultura. Centrifugar o volume necessário da suspensão celular correspondente a 2,5 vezes 10 das quintas células por inserção de cultura. Durante a centrifugação, aspirar cuidadosamente a solução de revestimento das pastilhas de cultura e deixá-la secar sob o capô sem a tampa por cinco minutos.Após a centrifugação, descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet no volume necessário de meio 2D suplementado com inibidor de ROCK 10 micromolares. Seme 200 microlitros da suspensão celular na membrana permeável revestida. Adicionar 500 microlitros do meio 2D suplementado com 10 inibidor de ROCK micromolar ao compartimento inferior e incubar.Uma alta densidade de células deve ser observada na membrana. Um dia após a semeadura, substituir o meio épico e basal por meios 2D frescos sem o inibidor de ROCK. Mude a mídia todos os dias.A monocamada torna-se confluente um dia após a semeadura e pode ser usada para seus experimentos. Neste estudo, criptas epiteliais foram obtidas do intestino de suínos e criopreservadas para armazenamento em nitrogênio líquido a longo prazo. Após o descongelamento, as células-tronco das criptas foram semeadas na MEC.Os organoides foram observados dentro de três a quatro dias e rapidamente cresceram e desenvolveram estruturas em brotamento. Aproximadamente 10 dias após o descongelamento, foi realizada a passagem dos organoides para ampliação da cultura. Para uma ótima manutenção da cultura, os organoides utilizados para embalagem devem apresentar lúmen claro e vazio e bordas bem definidas, sem restos pretos no lúmen, como observado em organoides maduros.As células se ligam e formam uma monocamada totalmente confluente dentro de um dia, o que é confirmado pela alta resistência elétrica transepitelial, ou TEER, de cerca de 700 cúpulas de centímetros quadrados. O TEER permanece alto por três dias. A coloração de actina indica que o lado apical das células epiteliais está orientado para o lúmen em organoides 3D.As células organoides semeadas em inserções de cultura formam uma camada única confluente de células epiteliais com o lado apical orientado para o compartimento superior. A coloração de ocludina revela a presença de tight junctions na face apical das células epiteliais em organoides 3D e em monocamadas celulares. É importante lembrar que os organoides usados para semear monocamadas celulares devem aparecer claros com um lúmen vazio sem detritos pretos correspondendo a um acúmulo de células mortas.Monocamadas de organoides intestinais de suínos podem ser usadas para testar os efeitos de metabólitos ou micróbios sobre a função de barreira epitelial usando ensaios funcionais, imagens e análise de expressão gênica.

culture-piglet-intestinal-3d-organoids-from-cryopreserved-epithelial

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Descrevemos um método para estabelecer enteróides humanos a partir de criptas do intestino delgado e colonóides a partir de criptas do cólon coletadas de tecido cirúrgico e biópsias. Neste artigo metodológico, apresentamos as modalidades de cultura que são essenciais para o crescimento e manutenção bem-sucedidos de enteróides e colonóides humanos.

Estabelecimento de epiteliais humanas Enteroids e Colonoids de tecido inteiro e biópsia

Aqui, apresentamos um protocolo para a cultura humana enteroid ou monocamadas de colonoid que têm a função de barreira intacta para estudar interações de epitélio-microbiota de acolhimento a nível celular e bioquímico.

Colonoid humana monocamadas para estudar interações entre epitélio Intestinal do hospedeiro, comensais e patógenos

Neste protocolo, descrevemos como gerar monótolais de cólon epitelial primário murina diretamente de criptas intestinais. Fornecemos abordagens experimentais para gerar monocamadas confluentes em filtros permeáveis, monocamadas confluentes para cura de feridas de risco e estudos bioquímicos, e monocamadas esparsas e confluentes para análise de imunofluorescência.

Geração de Monócamas Epiteliais de Cólon Primário Murine de Criptas Intestinais

Aqui apresentamos dois protocolos que permitem a modelagem de interações apical-específicas intestinais. Monocamadas intestinais derivadas de organoides e culturas de Interface Ar-Líquido (ALI) facilitam a geração de epitélio bem diferenciadas acessíveis tanto de lados luminosos quanto basolaterais, enquanto as organoides intestinais invertidas pela polaridade expõem seu lado apical e são favoráveis a ensaios de alto rendimento.

Métodos culturais para estudar interações específicas apical usando modelos organoides intestinais

Este protocolo oferece instruções detalhadas para estabelecer organoides do intestino delgado murine, isolar células linfoides tipo 1 da lamina propria do intestino delgado murina e estabelecer coculturas tridimensionais (3D) entre ambos os tipos de células para estudar interações bidirecionais entre células epiteliais intestinais e células linfoides inatas tipo 1.

Co-Cultura de Organoides Epiteliais do Intestino Delgado Murine com Células Linfoides Inatas

O presente protocolo descreve o estabelecimento de um sistema organoide colônico murino para estudar a atividade e o funcionamento das células-tronco colônicas em um modelo knockout de claudina-7.

Cultura tridimensional de criptas colônicas murinas para estudar a função das células-tronco intestinais ex vivo

Descrevemos um protocolo para isolar criptas murinas do intestino delgado e cultura de organoides intestinais 3D das criptas. Adicionalmente, descrevemos um método para gerar organoides a partir de uma única célula-tronco intestinal na ausência de um nicho celular subepitelial.

A Cultura 3D de Organoides de Criptas Intestinais Murinas e uma Única Célula-Tronco para Pesquisa de Organoides

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar organoides intestinais de ratos e usá-los em várias aplicações a jusante. Os ratos são frequentemente um modelo pré-clínico preferido, e o robusto sistema organoide intestinal preenche a necessidade de um sistema in vitro para acompanhar os estudos in vivo .

Geração e Manipulação de Organoides Intestinais em Rato

Os enteróides estão emergindo como um novo modelo para o estudo da fisiologia e fisiopatologia tecidual, desenvolvimento de drogas e medicina regenerativa. Aqui, descrevemos um sistema de cultura 2D derivado de enteróides de células primárias bovinas que permite o co-cultivo com tipos de células teciduais relevantes. Este modelo oferece uma vantagem translacional para a modelagem de pesquisa gastrointestinal.

Geração de um Sistema de Cultura Bidimensional Monocamada Derivada de Enteróides Bovinos Primários para Aplicações em Pesquisa Biomédica Translacional

Este estudo descreve um protocolo para gerar monocamadas 2D de organoides suínos derivados dos intestinos delgado e grosso. O crescimento dessas monocamadas é marcado pelo aumento dos valores de TEER, indicando integridade epitelial robusta. Além disso, essas monocamadas exibem respostas secretoras fisiológicas em experimentos de câmara de Ussing após a aplicação de forscolina.

Organoides intestinais suínos bidimensionais refletindo as propriedades fisiológicas do intestino nativo

Aprenda a cultivar organoides intestinais 3D de leitões a partir de criptas epiteliais criopreservadas e estabeleça monocamadas celulares para estudar transporte de nutrientes, função de barreira e interações hospedeiro-microbioma.

Cultura de Organoides 3D Intestinais de Leitões a partir de Criptas Epiteliais Criopreservadas e Estabelecimento de Monocamadas Celulares (Vídeo) | JoVE Journal

Cultura de Organoides 3D Intestinais de Leitões a partir de Criptas Epiteliais Criopreservadas e Estabelecimento de Monocamadas Celulares

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