Cultura de Organoides 3D Intestinais de Leitões a partir de Criptas Epiteliais Criopreservadas e Estabelecimento de Monocamadas Celulares

Nosso protocolo fornece ferramentas para o estudo do epitélio intestinal de suínos para pesquisas veterinárias e biomédicas. Organoides intestinais de suínos podem ser usados para estudar o transporte de nutrientes, a função de barreira e as interações hospedeiro-micróbio. Através da preservação de criptas epiteliais intestinais de suínos permitem criar um grande estoque de células-tronco que posteriormente podem ser usadas para cultura de organoides em monocamadas 3D ou 2D.

Esse protocolo é detalhado para o jejuno, mas também pode ser usado para outros segmentos intestinais, como duodeno, íleo e cólon. Para começar, descongele rapidamente um frasco contendo 900 criptas congeladas em banho-maria a 37 graus Celsius. Transfira a solução da cripta para um tubo cônico de 15 mililitros.

Centrifugar a 300 x g durante cinco minutos à temperatura ambiente e retirar o sobrenadante. Adicionar 150 microlitros da matriz extracelular ou MEC com uma ponta resfriada para obter uma concentração final de 150 criptas por 25 microlitros de MEC. Pipetar para cima e para baixo 10 vezes para obter uma suspensão homogênea de criptas na MEC.

Semeando seis poços com uma gota de 25 microlitros por poço em uma placa pré-aquecida de 48 poços. Incubar por 30 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para polimerização da MEC. Adicionar 250 microlitros por poço de cultura de meio à temperatura ambiente e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Troque o meio de cultura a cada dois ou três dias. Para passar organoides 3D derivados de criptas congeladas 10 dias após a semeadura, remova o meio de cultura e adicione 250 microlitros de PBS pré-aquecido a 37 graus Celsius. Após a incubação, substituir o PBS por 250 microlitros de reagente de dissociação enzimática pré-aquecido suplementado com 10 inibidor de rocha micromolar a 37 graus Celsius em cada poço.

Separar os organoides na MEC raspando com pipeta P-1000 e homogeneizar cuidadosamente por pipetagem cinco vezes. Incubar durante cinco minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono antes de dissociar as células pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Adicione 500 microlitros de DMEMc em cada poço contendo células dissociadas e puxe até 12 poços em um tubo cônico de 15 mililitros contendo três mililitros de DMEMc frio.

Centrifugar a 500 x g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em um mililitro de DMEMc frio. Conte as células com uma diluição de um a dois em azul de tripano com um contador de células.

Centrifugar o volume necessário da solução celular para ter 3000 células vivas por cúpula. Ressuspender o pellet com 17 microlitros de DMEMc frio por 3000 células vivas no gelo. Ajuste o volume ao número necessário de poços.

Adicione lentamente 33 microlitros de ECM frio por 3000 células vivas. Ajuste o volume ao número necessário de poços e homogeneize sem fazer bolhas. Em seguida, veja os poços com 50 microlitros da suspensão da célula ECM por poço em uma placa pré-aquecida de 24 poços e incube por 30 minutos para polimerização da MEC.

Adicione 500 microlitros do meio de cultura por poço. Em seguida, incube e troque o meio de cultura a cada dois ou três dias. Para revestir a pastilha de cultura, prepare a solução de revestimento contendo colágeno IV diluído a 50 microgramas por mililitro em PBS frio.

Adicionar 150 microlitros da solução de revestimento diluída a cada pastilha de cultura celular e incubar durante a noite ou durante três horas. Cinco dias após a bivisão, desprender os organoides com a MEC raspando-os com uma pipeta P-1000. Homogeneizado cuidadosamente por pipetagem no meio de cultura e transferido para um tubo cônico de 15 mililitros contendo cinco mililitros de DMEMc frio sobre gelo.

Centrifugar os organoides recolhidos a 500 x g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em um mililitro de reagente de dissociação enzimática pré-aquecido suplementado com 10 inibidor de ROCK micromolares. Pipetar para cima e para baixo 10 vezes para iniciar a dissociação dos organoides.

Incubar por cinco minutos em banho-maria de 37 graus Celsius para digestão enzimática. Interrompa mecanicamente os organoides pipetando 10 vezes e adicione quatro mililitros de DMEMc gelado. Centrifugar e descartar o sobrenadante antes de ressuspender o pellet de células organoides em um mililitro de DMEMc.

Contar as células em azul de tripano com um contador de células e calcular o volume necessário para semear 2,5 vezes 10 até a quinta célula por inserção de cultura. Centrifugar o volume necessário da suspensão celular correspondente a 2,5 vezes 10 das quintas células por inserção de cultura. Durante a centrifugação, aspirar cuidadosamente a solução de revestimento das pastilhas de cultura e deixá-la secar sob o capô sem a tampa por cinco minutos.

Após a centrifugação, descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet no volume necessário de meio 2D suplementado com inibidor de ROCK 10 micromolares. Seme 200 microlitros da suspensão celular na membrana permeável revestida. Adicionar 500 microlitros do meio 2D suplementado com 10 inibidor de ROCK micromolar ao compartimento inferior e incubar.

Uma alta densidade de células deve ser observada na membrana. Um dia após a semeadura, substituir o meio épico e basal por meios 2D frescos sem o inibidor de ROCK. Mude a mídia todos os dias.

A monocamada torna-se confluente um dia após a semeadura e pode ser usada para seus experimentos. Neste estudo, criptas epiteliais foram obtidas do intestino de suínos e criopreservadas para armazenamento em nitrogênio líquido a longo prazo. Após o descongelamento, as células-tronco das criptas foram semeadas na MEC.

Os organoides foram observados dentro de três a quatro dias e rapidamente cresceram e desenvolveram estruturas em brotamento. Aproximadamente 10 dias após o descongelamento, foi realizada a passagem dos organoides para ampliação da cultura. Para uma ótima manutenção da cultura, os organoides utilizados para embalagem devem apresentar lúmen claro e vazio e bordas bem definidas, sem restos pretos no lúmen, como observado em organoides maduros.

As células se ligam e formam uma monocamada totalmente confluente dentro de um dia, o que é confirmado pela alta resistência elétrica transepitelial, ou TEER, de cerca de 700 cúpulas de centímetros quadrados. O TEER permanece alto por três dias. A coloração de actina indica que o lado apical das células epiteliais está orientado para o lúmen em organoides 3D.

As células organoides semeadas em inserções de cultura formam uma camada única confluente de células epiteliais com o lado apical orientado para o compartimento superior. A coloração de ocludina revela a presença de tight junctions na face apical das células epiteliais em organoides 3D e em monocamadas celulares. É importante lembrar que os organoides usados para semear monocamadas celulares devem aparecer claros com um lúmen vazio sem detritos pretos correspondendo a um acúmulo de células mortas.

Monocamadas de organoides intestinais de suínos podem ser usadas para testar os efeitos de metabólitos ou micróbios sobre a função de barreira epitelial usando ensaios funcionais, imagens e análise de expressão gênica.