O isolamento de regiões específicas genômico e identificação de moléculas pela Associated enChIP
20 de janeiro de 2016
A identificação de moléculas associadas a regiões genômicas específicas de interesse é necessária para entender os mecanismos de regulação das funções dessas regiões. Este protocolo descreve procedimentos para realizar imunoprecipitação de cromatina mediada por molécula de ligação ao DNA (enChIP) projetada para identificação de proteínas e RNAs associados a uma região genômica específica.
O objetivo geral deste procedimento é isolar uma região genômica específica retendo interações moleculares para identificação de moléculas que interagem com a região genômica. Este método pode ajudar a responder a perguntas nos campos das funções genômicas, como transcrição e regulação epigenética. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a identificação direta de moléculas que interagem com uma região genômica específica.
Demonstrando o procedimento estará Toshitsugu Fujita, professor assistente do meu laboratório. Seguindo o protocolo de texto, projete as moléculas de ligação ao DNA de interesse. Isso envolve gerar a sequência gBlock de interesse e inseri-la em um retrovírus, por exemplo, para produzir o RNA guia complexado com três FLAG-dCas9.
Alternativamente, três proteínas FLAG-TAL reconhecendo a sequência alvo podem ser geradas. Em seguida, seguindo o protocolo de texto, infecte as células com o retrovírus preparado. Confirme a expressão das moléculas de ligação ao DNA projetadas e estabeleça a linha celular.
Agora, prossiga reticulando as células com formaldeído. Suspenda 20 milhões de células transfectadas em 30 mililitros de meio de cultura regular e adicione 810 microlitros de formaldeído a 37% para uma concentração final de 1% Incube a mistura por cinco minutos a 37 graus Celsius. Após cinco minutos, mate a reação de reticulação adicionando 3,1 mililitros de glicina 1,25 molar.
Deixe as células descansarem em temperatura ambiente por 10 minutos antes de prosseguir. Em seguida, centrifugue o tubo celular a 300 G por cinco minutos em uma centrífuga refrigerada. Rejeitar cuidadosamente o sobrenadante e lavar o sedimento em 30 mililitros de PBS por mistura e centrifugação.
Faça duas lavagens PBS. Se necessário, o pellet lavado de células fixas pode ser armazenado a 80 graus Celsius negativos. Continuando, colete a cromatina das células.
Suspenda-os em 10 mililitros de tampão de lise e incube-os no gelo por 10 minutos. Em seguida, usando uma centrífuga refrigerada, colete as células e descarte o sobrenadante com cuidado. Agora, suspenda o pellet celular em tampão de lise nuclear e incube-o no gelo por 10 minutos.
A cada poucos minutos durante a incubação, um breve vórtice da mistura. Novamente, colete as células por centrifugação. Agora, lave o pellet com 10 mililitros de PBS e remova a solução de lavagem com outra centrifugação.
Isso produz a fração de cromatina e, se desejado, pode ser congelada rapidamente e armazenada a 80 graus Celsius negativos. Prossiga suspendendo o pellet de cromatina em 800 microlitros de tampão de lise modificado três e transfira a suspensão para um tubo menor de 1,5 mililitro. Agora, ligue uma sonda de sonicação no nível três com serviço contínuo.
Para fragmentar a cromatina, alterne manualmente entre 10 segundos de sonicação e 20 segundos no gelo. A cada 5º ou 6º ciclo, estenda a fase de gelo para dois minutos para que a amostra não superaqueça. Execute este ciclo de sonicação 10 a 18 vezes, mantendo a ponta da sonda fora do fundo do tubo para evitar a formação de espuma na amostra.
Após a sonicação, colete a amostra com centrifugação refrigerada rápida. Em seguida, transferir o sobrenadante que contém a cromatina fragmentada para um novo tubo e rejeitar o sedimento. Veja o protocolo de texto sobre como avaliar a fragmentação.
Para se preparar para a imunoprecipitação, primeiro conjugue os anticorpos para Dynabeads. Essa imunoprecipitação é dimensionada para amostras derivadas de 20 milhões de células. Adicione 1/5 do volume de tampão de lise modificado três com Triton X-100 à cromatina fragmentada para obter uma concentração final de 1% de Triton.
Em seguida, adicione a mistura às esferas magnéticas conjugadas com IgG normal de camundongo. Incube a reação por uma hora em um rotador com refrigeração. Mais tarde, atraia as esferas da solução por três minutos em um suporte magnético.
Em seguida, colete o sobrenadante. Transferir o sobrenadante para o tubo de esferas magnéticas conjugadas com anticorpos anti-FLAG. Execute esta reação de conjugação durante a noite em um rotador a quatro graus Celsius.
Na manhã seguinte, aplique um ímã no tubo por três minutos para coletar as contas. Em seguida, pipetar o sobrenadante e descartá-lo. Agora, lave as contas.
Suspenda-os em um mililitro de tampão com baixo teor de sal e incube-os por cinco minutos em um rotador a quatro graus Celsius. Após a incubação, isole a magnetização dos grânulos e descarte o sobrenadante. Repita esta etapa de lavagem com tampão com baixo teor de sal mais uma vez.
Usando a mesma técnica, execute mais duas lavagens usando tampão com alto teor de sal. Continue usando o método para lavar as esferas em tampão de cloreto de lítio duas vezes. Por fim, lave as esferas com TBS-IGEPAL CA-630 apenas uma vez.
Após as sete etapas de lavagem, suspenda as esferas em 200 microlitros de tampão de eluição e incube-as a 37 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, atraia as esferas por magnetização e colete o sobrenadante em um novo tubo. Repita esta etapa de eluição para aumentar os rendimentos.
Em seguida, purifique cerca de 5% do DNA para estimar o rendimento. Comece misturando a maior parte do eluído em uma reação de precipitação. Precipite a cromatina durante a noite a 20 graus Celsius negativos.
No dia seguinte, centrifugue a amostra e descarte o sobrenadante. Enxágue o pellet com um mililitro de etanol a 70% e repita a centrifugação por 10 minutos. Em seguida, descarte o sobrenadante e suspenda o pellet em 40 microlitros de tampão de amostra 2x.
Agora, vórtice a suspensão por cinco minutos completos. Em seguida, incube-o a 100 graus Celsius por 30 minutos para desnaturar e reverter a reticulação. Após a fervura, execute 40 microlitros da amostra em um gel SDS-PAGE.
Normalmente, um gradiente de quatro a 20% é empregado. Execute o gel até que o corante viaje um centímetro abaixo do poço. Em seguida, manche o gel e corte-o em cinco pedaços com cerca de 2 milímetros de comprimento.
Dilua a proteína dos pedaços de gel e use-a para análise de espectrometria de massa. A purificação do RNA, seguida pela análise de sequenciamento, é abordada no protocolo de texto. No geral, até 10% das regiões genômicas alvo podem ser purificadas usando enChIP.
Vistos aqui estão os rendimentos das análises direcionadas à região promotora do gene IRF-1 em comparação com o locus Sox2 não específico. Outro exemplo é o direcionamento de telômeros versus locus de satélite gama não específico. O enChIP SILAC identificou várias proteínas associadas ao promotor IRF-1 de maneira específica para o interferon gama.
As proteínas de ligação aos telômeros também foram identificadas por enChIP combinada com espectrometria de massa. O sequenciamento de RNA enChIP foi então usado para identificar os RNAs associados aos telômeros. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores nas áreas de transcrição e regulação epigenética explorarem tais mecanismos em vários sistemas biológicos.
Visão Geral
Este protocolo descreve a técnica de imunoprecipitação de cromatina mediada por moléculas de ligação ao DNA engenheiradas (enChIP) para identificar proteínas e RNAs associados a regiões genômicas específicas. Ele fornece uma metodologia detalhada para isolar interações moleculares cruciais para a compreensão das funções genômicas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Genômica
- Epigenética
- Biologia Molecular
Fundamentos
- Entender as interações moleculares com regiões genômicas é essencial para elucidar mecanismos regulatórios.
- enChIP permite a identificação direta de moléculas interagindo com áreas genômicas específicas.
- Este método é aplicável em estudos de transcrição e regulação epigenética.
- Ele aumenta a capacidade de estudar funções genômicas complexas.
Objetivo do Estudo
- Isolar regiões genômicas específicas e identificar moléculas interagentes.
- Fornecer um método confiável para estudar a regulação transcricional e epigenética.
- Demonstrar a técnica enChIP de forma eficaz.
Métodos Utilizados
- Engenharia de moléculas de ligação ao DNA usando sequências gBlock e retrovírus.
- Cross-linking de células e isolamento da cromatina.
- Fragmentação da cromatina por sonicação.
- Realização de imunoprecipitação com anticorpos conjugados.
Principais Resultados
- Isolamento bem-sucedido de cromatina de células transfectadas.
- Identificação de proteínas e RNAs associados a regiões genômicas específicas.
- Demonstração de purificação eficaz de regiões genômicas alvo usando enChIP.
- Estimativa de rendimento por meio de análise por espectrometria de massa.
Conclusões
- enChIP é uma ferramenta poderosa para estudar interações moleculares em locais genômicos específicos.
- O método fornece insights sobre regulação transcricional e epigenética.
- Pode ser utilizado para várias aplicações em pesquisa genômica.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
enChIP enables direct, unbiased identification of proteins and RNAs interacting with specific genomic regions, supporting mechanistic de-risking in target validation. This approach enhances predictive confidence by linking genomic loci to functional molecular interactions in transcription and epigenetic regulation. It provides a scalable method for early discovery biology to inform portfolio triage and reduce late-stage biological risk.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by identifying direct molecular interactors of genomic regions of interest.
- Operational Value: Enables functional target validation through unbiased proteomic and transcriptomic profiling.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by clarifying pathway context and regulatory mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated chromatin inputs for downstream molecular interaction screening.
- Operational Value: Standardizes isolation of specific genomic regions with quantifiable yield (up to 10% purification efficiency).
- Scalability: Supports platform reuse across loci (e.g., promoters, telomeres) using TAL or CRISPR-dCas9 engineering.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links discovery-stage genomic findings to disease-relevant mechanisms via associated molecule identification.
- Translational Continuity: Enables biomarker-aligned follow-up through mass spectrometry or RNA sequencing of isolated complexes.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs preclinical target prioritization by revealing context-specific interactors (e.g., interferon gamma-specific IRF-1 associations).
Pipeline & Workflow Integration
enChIP fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, providing molecular interaction data that bridges genomic annotation and functional validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating genomic regions while preserving native molecular interactions.
- Screening: Generates assay-ready chromatin fractions for interaction profiling with chemical or genetic perturbations.
- Analytics: Enables quantitative comparison of associated molecules across conditions via mass spec or RNA-seq readouts.
- Translational Research: Connects genomic loci to phenotypic mechanisms through identified proteins and RNAs.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized capability for locus-specific interactome mapping across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in genomic function studies through direct interactor identification.
- Operational Value: Delivers reproducible, standardized isolation of tagged genomic regions using antibody-based immunoprecipitation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by validating target mechanism early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on molecular context of genomic targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning to engineer TAL or gBlock-CRISPR DNA-binding molecules.
- Needs access to sonication equipment, magnetic separation tools, and downstream analytics (mass spec, RNA-seq).
- Demands cross-team standardization for epitope tagging (e.g., FLAG) and antibody conjugation workflows.
- Must account for chromatin accessibility and epitope efficiency across diverse genomic regions and cell types.
- Practical limitation: Efficiency depends on successful tagging and expression of engineered DNA-binding molecules in target cells.
