O isolamento de regiões específicas genômico e identificação de moléculas pela Associated enChIP

O objetivo geral deste procedimento é isolar uma região genômica específica mantendo as interações moleculares, para a identificação de moléculas que interagem com a região genômica. Este método pode ajudar a responder perguntas nas áreas de funções genômicas, como transcrição e regulação epigenética. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a identificação direta de moléculas que interagem com uma região genômica específica.

O procedimento será demonstrado por Toshitsugu Fujita, professor assistente do meu laboratório. Após o protocolo descrito no texto, construa as moléculas de interesse que se ligam ao DNA. Isso envolve gerar a sequência gBlock de interesse e inseri-la em um retrovírus, por exemplo, para produzir o RNA guia complexado com três FLAG-dCas9.

Alternativamente, podem ser geradas três proteínas FLAG-TAL que reconhecem a sequência-alvo. Em seguida, siga o protocolo descrito para infectar as células com o retrovírus preparado. Confirme a expressão das moléculas de ligação ao DNA modificadas e estabeleça a linhagem celular.

Agora, prossiga com a reticulação das células usando formaldeído. Suspenda 20 milhões de células transfectadas em 30 mililitros de meio de cultura comum e adicione 810 microlitros de formaldeído a 37% para obter uma concentração final de 1%. Incube a mistura por cinco minutos a 37 graus Celsius. Após cinco minutos, interrompa a reação de reticulação adicionando 3,1 mililitros de glicina 1,25 molar.

Deixe as células em repouso à temperatura ambiente por 10 minutos antes de prosseguir. Em seguida, centrifugue o tubo de células a 300 G por cinco minutos em uma centrífuga refrigerada. Descarte cuidadosamente o sobrenadante e lave o pellet celular em 30 mililitros de PBS mediante mistura e centrifugação.

Realize duas lavagens com PBS. Se necessário, o pellet lavado de células fixadas pode ser armazenado a menos 80 graus Celsius. Em seguida, colete a cromatina das células.

Suspenda-os em 10 mililitros de tampão de lise e incube-os em gelo por 10 minutos. Em seguida, utilizando uma centrífuga refrigerada, recolha as células e descarte cuidadosamente o sobrenadante. Agora, suspenda o pellet celular em tampão de lise nuclear e incube-o em gelo por 10 minutos.

A cada poucos minutos durante a incubação, vorteje brevemente a mistura. Novamente, recolha as células por centrifugação. Agora, lave o pellet com 10 mililitros de PBS e remova a solução de lavagem com outra centrifugação.

Isso produz a fração de cromatina e, se desejado, pode ser congelada rapidamente e armazenada a menos 80 graus Celsius. Prossiga suspendendo o pellet de cromatina em 800 microlitros de tampão de lise modificado três e transfira a suspensão para um tubo menor de 1,5 mililitro. Agora, ligue a sonda de sonicação no nível três de potência com ciclo contínuo.

Para fragmentar a cromatina, realize manualmente ciclos alternando 10 segundos de sonicação com 20 segundos em gelo. A cada 5º ou 6º ciclo, prolongue a fase em gelo por dois minutos para evitar o superaquecimento da amostra. Realize este ciclo de sonicação de 10 a 18 vezes, mantendo a ponta da sonda afastada do fundo do tubo para evitar a formação de espuma na amostra.

Após a sonicação, colete a amostra com uma centrifugação rápida e refrigerada. Em seguida, transfira o sobrenadante contendo a cromatina fragmentada para um novo tubo e descarte o precipitado. Consulte o protocolo em texto para saber como avaliar a fragmentação.

Para se preparar para a imunoprecipitação, primeiro conjugue os anticorpos aos Dynabeads. Esta imunoprecipitação é dimensionada para amostras derivadas de 20 milhões de células. Adicione um volume de 1/5 do tampão de lise modificado três com Triton X-100 à cromatina fragmentada para obter uma concentração final de 1% de Triton.

Em seguida, adicione a mistura às microesferas magnéticas conjugadas com IgG de camundongo normal. Incube a reação por uma hora em um agitador rotativo com refrigeração. Posteriormente, atraia as microesferas da solução por três minutos em um suporte magnético.

Em seguida, colete o sobrenadante. Transfira o sobrenadante para o tubo contendo as microesferas magnéticas conjugadas com anticorpos anti-FLAG. Incube esta reação de conjugação durante a noite em agitador rotativo a quatro graus Celsius.

Na manhã seguinte, aplique um ímã ao tubo durante três minutos para recolher as microesferas. Em seguida, pipete o sobrenadante e descarte-o. Agora, lave as microesferas.

Suspenda-os em um mililitro de tampão de baixa salinidade e incube por cinco minutos em um rotador a quatro graus Celsius. Após a incubação, isole as esferas por magnetização e descarte o sobrenadante. Repita esta etapa de lavagem com tampão de baixa salinidade mais uma vez.

Usando a mesma técnica, realize mais duas lavagens utilizando o tampão de alto sal. Continue usando o método para lavar as microesferas no tampão de cloreto de lítio duas vezes. Por fim, lave as microesferas com TBS-IGEPAL CA-630 apenas uma vez.

Após as sete etapas de lavagem, suspenda as microesferas em 200 microlitros de tampão de eluição e incube-as a 37 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, atraia as microesferas por magnetização e colete o sobrenadante em um novo tubo. Repita esta etapa de eluição para aumentar os rendimentos.

Em seguida, purifique cerca de 5% do DNA para estimar o rendimento. Comece misturando a maior parte do eluato em uma reação de precipitação. Precipite a cromatina durante a noite a 20 graus Celsius negativos.

No dia seguinte, centrifugue a amostra e descarte o sobrenadante. Enxágue o pellet com um mililitro de etanol 70% e repita a centrifugação por 10 minutos. Em seguida, descarte o sobrenadante e suspenda o pellet em 40 microlitros de tampão de amostra 2x.

Agora, vorte a suspensão durante cinco minutos completos. Em seguida, incube-a a 100 graus Celsius por 30 minutos para desnaturar e reverter a ligação cruzada. Após a fervura, aplique 40 microlitros da amostra em um gel de SDS-PAGE.

Normalmente, utiliza-se um gradiente de quatro a 20%. Execute o gel até que o corante migre um centímetro abaixo do poço. Em seguida, cora o gel e corte-o em cinco pedaços com cerca de 2 milímetros de comprimento.

Dilua a proteína a partir dos fragmentos de gel e utilize-a para análise por espectrometria de massa. A purificação do RNA, seguida por análise de sequenciamento, está descrita no protocolo textual. No geral, até 10% das regiões genômicas-alvo podem ser purificadas utilizando enChIP.

Observam-se aqui os rendimentos de análises direcionadas à região promotora do gene IRF-1 em comparação com o locus não específico Sox2. Outro exemplo é o direcionamento dos telômeros versus o locus não específico de satélite gama. O enChIP com SILAC identificou várias proteínas associadas ao promotor de IRF-1 de maneira específica ao interferon gama.

Proteínas ligadoras de telômeros também foram identificadas por enChIP combinado com espectrometria de massas. O sequenciamento de RNA por enChIP foi então utilizado para identificar os RNAs associados aos telômeros. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores nas áreas de transcrição e regulação epigenética explorarem tais mecanismos em diversos sistemas biológicos.