Name: O isolamento de regiões específicas genômico e identificação de moléculas pela Associated enChIP (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Aprenda a técnica enChIP para isolar regiões genômicas específicas e identificar proteínas e RNAs associados. Este método permite estudar regulação transcricional e epigenética com alta especificidade.

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação para a Ciência Takeda (TF); a Fundação Asahi Glass; o Memorial Foundation Uehara (HF); o Kurata Memorial Hitachi Ciência e Fundação de Tecnologia (FT e IC); Conceda-in-Aid para Jovens Cientistas (B) (# 25830131), Grant-in-Aid para a Investigação Científica (C) (# 15K06895) (TF); e um Grant-in-Aid para a Investigação Científica em &#39;Ciclo de transcrição&#39; áreas inovadoras (# 25118512 &amp; # 15H01354), Grant-in-Aid para a Investigação Científica (B) (# 15H04329), Grant-in-Aid para a Investigação exploratória ( # 26650059) e &#39;Genome Suporte&#39; (# 221S0002) (HF) do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão.

1. Projeto de Engineered moléculas de DNA-binding Reconhecendo o alvo Locus <ol><li> Para enChIP usando complexos CRISPR, use a ferramenta web CRISPRdirect (http://crispr.dbcls.jp) para identificar sequências alvo gRNA candidato na região genômica de interesse descrito como anteriormente 18. Esta ferramenta da web retorna locais genómicos 23 pb da forma 5&#39;-N 20 NGG-3 &#39;, na região de alvo. </li><li> Sintetizar um gBlock incluindo a sequência de promotor U6 e a sequência de 5&#39;-N 20 em 5&#39;-N 20 NGG-3 &#39;, utilizando serviços comerciais (ver Figura 2) 19,20. Para fins de subclonagem, incluem sítios de enzimas de restrição adequados fora do gBlock. </li><li> Inserir o gBlock num vector apropriado tal como previamente descrito 16. Vários vetores retrovirais para gBlocks estão disponíveis (ver Materiais). </li><li> Para enChIP utilizando proteínas TAL, projetar proteínas TAL reconhecendo a target loci. Gerar plasmídeos que codificam proteínas TAL usando serviços comerciais. Gerar vectores de expressão que contêm as proteínas fundidas TAL com uma ou mais marcas, tais como 3 × marcar como previamente descrito 15. </li></ol> 2. Criação de Células para Análise enChIP <ol><li> Express 3 × FLAG-dCas9 e o gRNA (procedimento baseia-CRISPR) ou 3 × FLAG-Tal (à base de proteínas procedimento TAL) nas células a serem analisadas conforme descrito anteriormente 14-17. <ol><li> Use transfecção transiente, se a eficiência de transfecção é alta. Um vector de expressão contendo 3 × FLAG-dCas9 e o promotor CMV está disponível (ver Materiais). </li><li> Considerar a criação de transformantes estáveis ​​usando métodos convencionais, se a eficiência de transfecção transitória é baixa. Para além dos vectores retrovirais acima mencionados para gBlock, vectores retrovirais de 3 × FLAG-dCas9 estão disponíveis (ver Materiais). </li></ol></li><li&gt; Confirmar a expressão da 3xFLAG-dCas9 ou proteína 3xFLAG-TAL nas células transfectadas por análise de imunotransferência utilizando um anticorpo anti-FLAG (Ab) tal como descrito anteriormente 14-17. Nota: A expressão destas proteínas marcadas também podem ser confirmadas por coloração intracelular com anti-FLAG-FITC e uma análise de FACS subsequente. Um protocolo para a coloração intracelular pode ser baixado do nosso homepage (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html). </li><li> Confirmar a expressão do gRNA pela norma técnica de RT-PCR. </li><li> Para a identificação quantitativa de proteínas que interagem com a região genômica de interesse, considere o uso de uma rotulagem isótopo estável por aminoácidos em cultura de células (SILAC) análise combinada com enChIP (enChIP-SILAC). Nota: Os Meios para a análise SILAC podem ser adquiridos de fornecedores comerciais. SILAC é poderosa para detectar interacções específicas. <ol><li> Células de cultura em SILAC meio pesado. Prepare células cultuvermelho em meio luz SILAC como controle negativo. Utilize pelo menos 5 × 10 7 células para cada meio SILAC (leve ou pesada). Para a rotulagem eficiente, adicione tanto L-Lisina-2HCl, 13 C 6 e L-Arginina-HCl, 13 C 6, 15 N 4 na mídia SILAC pesados. Nota: Pelo menos cinco divisões celulares são necessárias para proteínas de etiquetas. <ol><li> Por exemplo, células de cultura humanas fibrossarcoma HT1080 que expressam estavelmente 3xFLAG-dCas9 e um gRNA a 37 ° C e 5% de CO 2 em meio DMEM durante SILAC e soro fetal de bovino dialisado com Lisina-2HCl mais L-arginina-HCl (média de luz) ou 13 C 6 L-Lisina-2HCl mais 13 C 6 15 N 4 L-Arginina-HCl (meio-pesado) (veja Materiais) 16. Adicionam-se 50 mg de leve ou pesada de L-Lisina-2HCl e L-Arginina-HCl em 500 ml de meio. </li><li> Células Trypsinize e replate antes de se tornarem confluentes, de modo que as células manter growt exponencialh. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. A ligação cruzada de células com formaldeído <ol><li> Para as células em cultura em suspensão, de transferência de 2 x 10 7 células que expressam proteínas 3xFLAG-Tal ou 3xFLAG-dCas9 mais gRNA e suspender em 30 ml de meio de cultura regular em um tubo de centrífuga de 50 ml. Quando são usadas mais células, aumentar os volumes e as quantidades de reagentes proporcionalmente. Para as experiências de SILAC, misturar as células cultivadas em meio pesado ou médio da luz (5 x 10 7 células cada) e dividir o total de 1 x 10 células em 8 5 tubos contendo 2 x 10 7 células. </li><li> Adicionar 810 ul de 37% de formaldeído a 30 ml de suspensão celular (concentração final 1%) e incuba-se a 37 ° C durante 5 min. Para as células aderentes, fixar directamente as células em placas de cultura pela adição de 810 ul de 37% de formaldeído a 30 ml de meio de cultura. </li><li> Pare a reticulação por adição de 3,1 ml de 1,25 M de solução de glicina (127 mM de concentração final), eincubar à TA durante 10 min. </li><li> Recolher as células por centrifugação (300 x g durante 5 min a 4 ° C). Cuidadosamente descarte o sobrenadante incluindo formaldeído e armazená-lo em um frasco adequado de lixo. <ol><li> Para as células aderentes, separar as células com um raspador de células e colheita em um tubo de 50 ml, e recolher as células, tal como descrito neste passo. </li><li> Para as experiências de SILAC, misturar as células isoladas em cultura em meio pesado ou meio de luz (5 x 10 7 células cada), dividir o total de 1 x 10 8 células em 5 tubos contendo 2 x 10 7 células, e recolher as células tal como descrito no presente passo. </li></ol></li><li> Lava-se a pelete de células com 30 ml de PBS duas vezes por tubo. Cuidadosamente descarte o sobrenadante incluindo formaldeído e armazená-lo em um recipiente adequado de resíduos bottle.Handle o formaldeído de acordo com as diretrizes de segurança de produtos químicos. As células fixadas podem ser congeladas e armazenadas a -80 ° C. </li></ol> 4. Preparação da Cromatina (por 2 x 107 células) <ol><li> Suspender as células fixadas em 10 ml de tampão de lise celular (Tris 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM, 0,5% de IGEPAL CA-630, e 1 × inibidores da protease) e incubar em gelo durante 10 min. </li><li> Centrifugar a amostra (830 x g a 4 ° C durante 8 min) e o sobrenadante cuidadosamente descartar. </li><li> Suspende-se o sedimento em 10 ml de tampão de lise nuclear (Tris 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM, NaCl 0,5 M, 1% de Triton X-100, desoxicolato de sódio a 0,5%, 0,5% lauroilsarcosina, e inibidores da protease 1x). Incubar em gelo durante 10 min e agitar no vortex todos os 2-3 minutos. </li><li> Centrifugar a amostra (830 × g a 4 ° C durante 8 min) e o sobrenadante cuidadosamente descartar. </li><li> Lava-se a pelete em 10 ml de PBS. O sedimento (fracção cromatina) pode ser armazenada a -80 ° C, após o congelamento imediato em azoto líquido. </li></ol> 5. Sonication de cromatina (por 2 x 10 7 células) <ol><li> Suspender a fracção cromatina em 800 ul detampão de lise modificada 3 (Tris 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM, NaCl 150 mM, desoxicolato de sódio a 0,1%, 0,1% SDS e inibidores de protease 1x) e transferir para um tubo de 1,5 ml. </li><li> Sonicar a cromatina utilizando um sonicador (ver Materiais) e as seguintes condições: a saída: 3; dever: 100% (contínua); e tempo: livre. Realizar 10-18 ciclos de ultra-sons durante 10 segundos e arrefecimento em gelo durante 20 seg. Para evitar o aquecimento excessivo, incubar as amostras em gelo durante 2 minutos a cada 5-6 ciclos. Para evitar a formação de espuma, manter a posição da ponta da sonda de ultra-sons de 0,5 cm acima do fundo do tubo. </li><li> Centrifugar a amostra a (16000 x g a 4 ° C durante 10 min) e transferir o sobrenadante para um tubo de 1,5 ml. A cromatina sonicado pode ser armazenado a -80 ° C, após o congelamento imediato em azoto líquido. </li></ol> 6. Avaliação da cromatina Fragmentação <ol><li> Misturar 10 ul da cromatina fragmentada com 85 ul de água destilada. </li><li> Adicione 4 ulde NaCl 5 M e incuba-se a 65 ° CO / N. </li><li> Adicionar 1 mL de 10 mg / ml de RNase A e incubar a 37 ° C durante 45 min. </li><li> Adicionar 2 ul de EDTA 0,5 M (pH 8,0), 4 pi de 1 M de Tris (pH 6,8), e 1 uL de 20 mg / ml de Proteinase K, e, em seguida, incuba-se a 45 ° C durante 1,5 h. </li><li> Separada de 10 ul da amostra por electroforese em um gel de agarose a 1% que não contém corantes de coloração tais como SYBR verde. </li><li> Corar o gel para avaliar a distribuição dos comprimentos da cromatina fragmentada. Condições que geram um comprimento médio de 0,5-2 kpb (gama de 0,2-4 kpb) são recomendados. </li><li> Purifica-se o ADN das amostras restantes por extracção com fenol-clorofórmio ou utilizando um kit de extracção de ADN (ver Materiais). O ADN purificado pode ser utilizado como o ADN de entrada para estimar os rendimentos de análises enChIP (ver 8.11). </li></ol> 7. Preparação de Dynabeads conjugado com anticorpos (por 2 x 10 7 células) <ol><li> Prépare duas 1,5 ml tubos, um para pré-limpeza utilizando IgG de rato normal e outra para incubação com o anti-FLAG Ab. Adicionar 150 ul de proteína G-conjugado esferas magnéticas (ver Materiais) para cada tubo. </li><li> Colocar os tubos em um carrinho ímã e esperar por 3 min. Descartar o sobrenadante por pipetagem. </li><li> Suspender as pérolas em 1 ml de PBS contendo 0,01% de Tween-20 (PBS-T). Colocar os tubos em um suporte magnético e esperar por 2 min. Desprezar o sobrenadante por pipetagem, em seguida, repita o passo. </li><li> Suspender as pérolas em 1 ml de PBS-T contendo 0,1% de BSA. </li><li> Adiciona-se 15 ug de IgG de rato normal ou anti-FLAG Ab e girar a 4 ° CO / N. </li><li> Spin down brevemente, em seguida, colocar os tubos em um carrinho ímã e esperar por 3 min. Descartar o sobrenadante por pipetagem. </li><li> Suspender as pérolas em 1 ml de PBS-T. Inverta as várias vezes de amostra e girar rapidamente. Colocar os tubos em um carrinho ímã e esperar por 3 min, em seguida, descartar o sobrenadante por pipetagem. Repita a lavagemmais duas vezes com PBS-T (um total de três passos de lavagem). </li></ol> 8. imunoprecipitação da cromatina (por 2 x 10 7 células) <ol><li> Misture a cromatina fragmentada preparado em 5.3) (aproximadamente 800 ul) com um quinto do volume (aproximadamente 200 ul) de tampão de lise modificada contendo 3 5% de Triton X-100 (concentração final de 1% de Triton X-100). </li><li> Adicionar a solução da cromatina para o tubo em que contas magnéticas conjugadas com Proteína G conjugadas com IgG de ratinho normal foram preparados. Girar a 4 ° C durante 1 h. </li><li> Colocar o tubo em um carrinho ímã e esperar por 3 min. </li><li> Transferir o sobrenadante para dentro do tubo em que contas magnéticas conjugadas com Proteína G conjugadas com anti-FLAG Ab foram preparados. Girar a 4 ° CO / N. </li><li> Colocar o tubo em um carrinho ímã e esperar por 3 min. Descartar o sobrenadante por pipetagem. </li><li> Suspender as pérolas em 1 ml de tampão de baixa salinidade (20 mM de Tris (pH 8,0), EDTA a 2 mM, NaCl 150 mM, 1% de triton X-100, 0,1% de SDS, e 1x inibidores de protease) e rodar a 4 ° C durante 5 min. Colocar o tubo em um carrinho ímã e esperar por 3 min. Desprezar o sobrenadante por pipetagem e repita o passo de lavagem. </li><li> Lavam-se as esferas com tampão de alto teor salino (Tris 20 mM (pH 8,0), EDTA a 2 mM, NaCl 500 mM, 1% de Triton X-100, 0,1% de SDS, e inibidores da protease 1x) duas vezes. </li><li> Lavam-se as esferas com tampão de LiCl (10 mM de Tris (pH 8,0), EDTA 1 mM, 250 mM de LiCl, 0,5% de IGEPAL CA-630, desoxicolato de sódio a 0,5%, e inibidores de protease 1x) duas vezes. </li><li> Lavam-se as esferas com TBS-IGEPAL CA-630 (Tris 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, IGEPAL CA-inibidores 630, e 1x de protease a 0,1%) uma vez. </li><li> Suspender as pérolas em 200 ul de tampão de eluição (Tris a 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, 0,1% de IGEPAL CA-630, os inibidores da protease de 1x, e 500 ug / ml de 3 péptido × FLAG) e incubar a 37 ° C durante 20 min. Colocar o tubo em um carrinho ímã e esperar por 3 min. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 ml e repetir o Elutpasso ion. </li><li> Purifica-se o ADN a partir de pequena porção (por exemplo, 5%) do eluato por extracção com fenol-clorofórmio ou utilizando um kit de extracção de ADN (ver Materiais). O ADN purificado pode ser utilizado para a PCR com conjuntos de iniciadores específicos para estimar os rendimentos de análises enChIP por comparação com o ADN de entrada, preparada na etapa 6.7, como descrito anteriormente 14,16. </li></ol> 9. SDS-PAGE, coloração e análise de espectrometria de massa <ol><li> Misturar o eluato (400 ul) com 1 ml de 2-propanol, 50 ul de acetato de sódio 3M (pH 5,2), e 5 ul de 20 mg / ml de glicogénio. Precipitar o cromatina a -20 ° CO / N. </li><li> Centrifugar a amostra (16000 x g a 4 ° C durante 30 min) e desprezar o sobrenadante. Lavar o sedimento com 1 ml de etanol a 70% e centrifuga-se novamente (16000 x g a 4 ° C durante 10 min). Desprezar o sobrenadante completamente por pipetagem. </li><li> Suspende-se o sedimento em 40 ul de tampão de amostra 2x (Tris 125 mM (pH 6,8), 10% de 2-mercaptoethanol, SDS a 4%, sacarose a 10%, e 0,004% de azul de bromofenol). Vortex durante 5 min para dissolver o sedimento completamente, e, em seguida, incuba-se a 100 ° C durante 30 minutos para desnaturar as proteínas e inverter a reticulação. </li><li> Por SDS-PAGE, correr 40 ul da amostra no gel até o corante atinge 1 cm abaixo do poço. Nota: Normalmente, usamos 4-20% géis de gradiente, mas outros géis% pode ser usado. </li><li> Manchar o gel com Coomassie Brilliant Blue ou prata. </li><li> Corte o gel em cinco pedaços (2 mm de altura). </li><li> Realiza-se em digestão em gel e análise espectrométrica de massa, tal como descrito anteriormente 13-16. </li><li> Para as experiências de SILAC com 5 x 10 7 células cada (total de 1 x 10 8 células), suspender a pelete a partir dos cinco tubos iniciais em 40 ul de tampão de amostra 2x (não é necessário para intensificar). </li></ol> 10. A purificação de RNA e Análise de RNA-Seq <ol><li> Para purificar o ARN enChIP depois, adicionam-se 5 U / ml de ARNase Inibidor (SEe Materiais) para todas as soluções tampão, excepto tampão de lise modificada 3 e o tampão de eluição, para que adicionar 40 U / ml de RNase inibidor. </li><li> Misturar o eluato (400 ul) com 16 ul de NaCl 5 M e incuba-se a 65 ° C durante 2 horas. </li><li> Adicionar 1 ml de solução de ácido de guanidínio-fenol-base-(ver Materiais) para a amostra. Vortex durante 15 segundos e, em seguida incubar à temperatura ambiente durante 5-15 min. Centrifugar a amostra durante 15 min a 12.000 x g e RT. </li><li> Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL e adicionar 5 uL de p-bromoanisole. Vortex durante 15 segundos e, em seguida incubar à temperatura ambiente durante 3-5 minutos. Centrifugar a amostra durante 10 min a 12.000 x g e RT. </li><li> Transferir o sobrenadante (aproximadamente 1 ml) para um novo tubo de 2 mL e adicionar 1 ml de 2-propanol. Inverter o tubo e incubar à TA durante 10 min. Carregar a mistura numa coluna de um kit de purificação de RNA (ver Materiais). Centrifugar a coluna durante 1 min a 12.000 × g e RT. </li><li> lavagema coluna com 400 mL de RNA Wash Buffer em um kit de purificação de RNA (ver Materiais). </li><li> Adicionar 80 ul de ADNase I cocktail (mistura de 5 ul de DNase I (1 U / ul), 8 uL de 10 × ADNase I Tampão de Reacção, 3 ul de DNase / RNase isenta de água, e 64 ul de ARN do Tampão de Lavagem em um kit de purificação de RNA (ver Materiais)) para a coluna. Incubar a amostra a 37 ° C durante 15 min e em seguida centrifugar durante 30 segundos a 12.000 x g e RT. </li><li> Lavar a coluna com 400 mL de RNA pré-lavagem tampão em um kit de purificação de RNA (ver Materiais) duas vezes. </li><li> Elui-se o ARN com 50 ul de ADNase / ARNase isenta de água. O RNA eluído pode ser utilizado para a sequenciação de ARN. </li></ol>

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</ol>

Os autores registraram uma patente sobre o enChIP (nome da patente: 'Método para isolar regiões genômicas específicas usando moléculas de ligação ao DNA que reconhecem sequências de DNA endógenas'; Número da patente: PCT/JP2013/74107). H.F. é membro do Conselho Consultivo da Addgene.

Aqui, descrevemos a purificação de regiões genômicas específicas usando moléculas de ligação ao DNA projetadas, como o sistema CRISPR e as proteínas TAL, e a identificação de proteínas e RNAs ligados a essas regiões genômicas. A ligação de moléculas de ligação ao DNA modificadas ao genoma pode afetar a estrutura da cromatina, incluindo o posicionamento do nucleossomo, e pode anular as funções genômicas, conforme descrito em experimentos de interferência CRISPR21. Para evitar esses potenciais efeitos aberrantes, propomos diretrizes específicas para a escolha de regiões genômicas alvo. Primeiro, para evitar a inibição potencial do recrutamento de RNA polimerases e fatores de transcrição, bem como a interrupção do posicionamento do nucleossomo em torno do local de início da transcrição, as regiões-alvo para análises de regiões promotoras devem estar várias centenas de pares de bases a montante de (5 'para) o local de início da transcrição. Por outro lado, ao analisar regiões genômicas com limites distintos, como intensificadores e silenciadores, as regiões genômicas que são diretamente justapostas a essas regiões podem ser direcionadas porque é menos provável que a ligação de moléculas de ligação ao DNA modificadas afete suas funções. Além disso, é melhor evitar o uso de regiões-alvo que são conservadas entre diferentes espécies, porque moléculas importantes de ligação ao DNA geralmente se ligam a regiões evolutivamente conservadas e a inibição de sua ligação pode interromper as funções das regiões genômicas alvo. Nesse sentido, é sempre necessário verificar se a função da região genômica alvo é mantida nas células estabelecidas usadas para análises de enChIP. Como vários gRNAs podem ser testados facilmente e é tedioso e caro gerar várias versões de proteínas TAL ou dedo de zinco reconhecendo diferentes regiões genômicas alvo, o enChIP usando CRISPR é mais vantajoso do que o enChIP usando outras proteínas.
Foi demonstrado que o dCas9 se liga a locais fora do alvo, embora a afinidade com esses locais possa ser mais fraca do que com os locais de destino22-25. Existem várias maneiras de gerenciar a contaminação de moléculas ligadas a esses locais fora do alvo. Primeiro, o uso de vários, pelo menos dois, gRNAs diferentes seria recomendado. Essas moléculas comumente observadas em enChIP usando gRNAs distintos seriam verdadeiros positivos. Em segundo lugar, a comparação de diferentes condições para enChIP seria eficaz para cancelar a contaminação de moléculas não específicas e moléculas ligadas a locais fora do alvo. Exemplos desses conjuntos de comparação seriam (i) estimulação (-) e (+), ou (ii) diferentes tipos de células, como células T vs. células B. Finalmente, a análise quantitativa da ligação de moléculas candidatas deve ser realizada para confirmar sua ligação específica aos locais-alvo. É preferível preparar células que expressam apenas dCas9, mas não gRNA como controle negativo.
Usando análises enChIP, fomos capazes de identificar com sucesso uma série de moléculas conhecidas e novas interagindo com regiões genômicas específicas (Tabelas 1-3) 14-17. No entanto, essa técnica não conseguiu detectar algumas outras proteínas conhecidas interagindo com essas regiões. Por exemplo, STAT1 supostamente se associa ao promotor IRF-1 após a estimulação de IFNγ8, mas nossa análise enChIP-SILAC não detectou STAT1 como uma proteína induzida a interagir com essa região genômica16. Além disso, na análise enChIP-MS dos telômeros, não detectamos proteínas shelterinas constituídas por TRF-1 e TRF-215, que demonstraram interagir com os telômeros26. Existem algumas razões potenciais para essas discrepâncias. Primeiro, a estequiometria de ligação de Stat1 ao promotor IRF-1 pode ser muito baixa. É razoável que o enChIP-MS, incluindo o enChIP-SILAC, detecte proteínas que estão mais abundantemente associadas às regiões genômicas alvo; portanto, a análise de mais células pode ser necessária para detectar essas proteínas. Aumentos nas sensibilidades dos instrumentos de EM também contribuiriam para a detecção eficiente de proteínas com baixa ligação estequiométrica. Em segundo lugar, algumas proteínas, possivelmente incluindo Stat1 e shelterinas, podem ser alvos difíceis para análises de EM. Em terceiro lugar, em nossa análise das proteínas de ligação aos telômeros15, as proteínas 3×FLAG-TAL que reconhecem os telômeros (3×FN-Tel-TAL) podem ter bloqueado a ligação de shelterinas aos telômeros de maneira competitiva.
Em contraste com a relativa dificuldade de detectar fatores de transcrição ligados a regiões genômicas específicas usando enChIP, identificamos com sucesso reguladores epigenéticos, como enzimas de modificação de histonas, usando análises enChIP. O sucesso desta técnica pode ser devido ao fato de que os reguladores epigenéticos se ligam a uma ampla gama de regiões genômicas; portanto, mais proteínas por região genômica estão disponíveis para EM. Como os reguladores epigenéticos são cada vez mais reconhecidos como alvos importantes para medicamentos contra doenças intratáveis, como o câncer, o enChIP seria uma ferramenta útil para a identificação de alvos de medicamentos epigenéticos.

A identificação de moléculas associadas com as regiões genómicas específicas de interesse é necessária para compreender os mecanismos de regulação das funções genómicas, tais como transcrição e regulação epigenética. Embora tenham sido desenvolvidas várias técnicas para análise bioquímica de regiões genômicas específicas 1-7, eles não são amplamente utilizados nesta fase por causa de seus problemas intrínsecos, tais como aplicação limitada (por exemplo, apenas para-elevado número de cópias ou loci loci com repetições) e muito tempo e esforço necessário. Para realizar a análise bioquímica de regiões genômicas específicas facilmente, nós desenvolvemos duas tecnologias específicas do locus de cromatina imunoprecipitação (chip), nomeadamente insercional chip (Ichip) 8-13 e engenharia mediada por molécula de ligação a DNA ChIP (enChIP) 14-17 . Em Ichip, um lugar de interesse é marcado por sequências de reconhecimento de inserção de uma proteína de ligação de DNA exógeno, como LexA. O locus é então isolado através de purificação por afinidade, utilizando a proteína de ligação de ADN marcado. Em enChIP, modificadas moléculas de ligação a ADN, tais como proteínas de dedos de zinco, proteínas (Tal) de activador do tipo de transcrição, e agrupados regularmente interspaced repetições palindrï¿½icas curtas (CRISPR) complexos, são utilizados para marcar um local de interesse (Figura 1). Subsequentemente, a região genómica que é isolado através de purificação por afinidade das moléculas de ligação de ADN marcados. Uma das vantagens de enChIP sobre ichip é que a inserção de sequências de reconhecimento de uma proteína de ligação do ADN exógeno não é necessário. Segmentação de loci CRISPR usando complexos que consistem em uma forma cataliticamente inactivo de Cas9 (dCas9) e um guia de RNA (gRNA) é muito mais fácil do que a segmentação dessas regiões por iChip ou enChIP utilizando proteínas TAL e zinc-finger. Aqui, descrevemos um protocolo passo-a-passo para enChIP combinada com a espectrometria de massa e sequenciação de RNA (RNA-Seq) para identificar lócus associa-proteínas e RNAs ted, respectivamente.

<table><tbody><tr><td>Serviço de síntese gBlock</td><td>Life</td><td>Technologies Gene Synthesis por GeneArt</td><td></td></tr><tr><td>Serviço de síntese gBlock</td><td>IDT (Integrated DNA Technologies)</td><td>gBlocks Fragmentos de</td><td></td>genes</tr><tr><td>pSIR-neo</td><td>Addgene</td><td>51128</td><td></td></tr><tr><td>pSIR-GFP</td><td>Addgene</td><td>51134</td><td></td></tr><tr><td>pSIR-DsRed-Express2</td><td>Addgene</td><td>51135</td><td></td></tr><tr><td>pSIR-hCD2</td><td>Addgene</td><td>51143</td><td></td></tr><tr><td>Serviço de síntese de TAL</td><td>Life Technologies</td><td>GeneArt Precision TALs</td><td></td></tr><tr><td>3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1</td><td>Addgene</td><td>47948</td><td></td></tr><tr><td>3&times; FLAG-dCas9/pMXs-puro</td><td>Addgene</td><td>51240</td><td></td></tr><tr><td>3&times; FLAG-dCas9/pMXs-IG</td><td>Addgene</td><td>51258</td><td></td></tr><tr><td>3&times; FLAG-dCas9/pMXs-I2</td><td>Addgene</td><td>51259</td><td></td></tr><tr><td>3&vezes; FLAG-dCas9 / pMXs-neo</td><td>Addgene</td><td>51260</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG M2 Ab</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG conjugado com FIT M2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4049</td><td></td></tr><tr><td>Meio DMEM para SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89985</td><td>Outro meio pode ser adquirido na Life</td></tr><tr><td>Technologies FBS dialisado para SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89986</td><td></td></tr><tr><td>L-Lisina-2HCl para SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89987</td><td>Para</td></tr><tr><td>L-Arginina-HCl de meio leve para SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89989</td><td>Para</td></tr><tr><td>L-Lisina-2HCl de meio leve, 13C6 para SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89988</td><td>Para</td></tr><tr><td>L-Arginina-HCl de meio pesado, 13C6, 15N4 para SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89990</td><td>Para meio pesado</td></tr><tr><td>Completo, mini, </td><td>Roche Diagnostics</td> sem EDTA <td>4693159</td><td></td></tr><tr><td>Disruptor Ultrassônico UD-201</td><td>Tomy Seiko</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChIP DNA Clean & Concentrador</td><td>Zymo Research</td><td>D5205</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads-Protein G</td><td>Life Technologies</td><td>DB10004</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Plus RNase Inibidor</td><td>Promega</td><td>N2611</td><td></td></tr><tr><td>Isogen II</td><td>Nippon Gene</td><td>311-07361</td><td></td></tr><tr><td>Kit Miniprep de RNA Direto-zol</td><td>Zymo Research</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Um componente de um sistema nanoLC-MS/MS para análise</td></tr> MS <tr><td>nanoLC</td><td>Advance, Michrom Bioresources</td><td></td><td>Um componente de um sistema nanoLC-MS/MS para análise</td></tr> MS <tr><td>Amostrador automático HTC-PAL</td><td>CTC Analytics</td><td></td><td>Um componente de um sistema nanoLC-MS/MS para análise MS</td></tr></tbody></table>

o isolamento de regiões específicas genômico e identificação de moléculas pela associated enchip

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

A identificação de moléculas associadas a regiões genômicas específicas de interesse é necessária para entender os mecanismos de regulação das funções dessas regiões. Para permitir a identificação não tendenciosa de moléculas que interagem com uma região genômica específica de interesse, desenvolvemos recentemente a técnica de imunoprecipitação de cromatina mediada por moléculas de ligação ao DNA (enChIP). Aqui, descrevemos como usar o enChIP para isolar regiões genômicas específicas e identificar as proteínas e RNAs associados. Primeiro, uma região genômica de interesse é marcada com uma proteína semelhante a um ativador de transcrição (TAL) ou um complexo de repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR) consistindo de uma forma cataliticamente inativa de Cas9 e um RNA guia. Posteriormente, a cromatina é reticulada e fragmentada por sonicação. O locus marcado é então imunoprecipitado e a reticulação é revertida. Finalmente, as proteínas ou RNAs associados à cromatina isolada são submetidos a análises de espectrometria de massa ou sequenciamento de RNA, respectivamente. Essa abordagem permite a identificação bem-sucedida de proteínas e RNAs associados a uma região genômica de interesse.

Em geral, 1-30% de regiões genómicas alvo pode ser purificado utilizando enChIP. Figura 3 inclui dados representativos mostram os rendimentos em enChIP análises de telómeros direccionamento e o promotor do interferão (IFN) reguladora factor-1 (IRF-1) gene. Como exemplos de resultados típicos, Tabela 1 lista as proteínas associadas com o IRF-1 promotor de uma forma de IFNy específico identificado por enChIP-SILAC, Tabela 2 lista as proteínas se ligam a telómeros identificados por enChIP combinada com espectrometria de massa (enChIP-MS) e Tabela 3 lista os RNAs associadas com telômeros identificados por enChIP-RNA-Seq. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53478/53478fig1.jpg" /> Figura 1. Visão geral do enChIP. enChIP usando CRISPR (A, B) e TAL (C, D, E </strong&gt;) é mostrado. Um sítio de interesse está marcado com moléculas de ligação de ADN modificadas, tais como uma proteína ou o sistema TAL CRISPR que consiste de uma forma cataliticamente inactiva de Cas9 (DCA) e a guia de ARN (gRNA). As interacções moleculares são fixadas com formaldeído ou outros agentes de reticulação, caso seja necessário. Subsequentemente, fixa cromatina é fragmentado por sonicação ou digestão enzimática. As regiões genómicas são marcados purificado por purificação de afinidade. Finalmente, a reticulação é invertida, e as moléculas interagem (regiões genômicas, RNAs e proteínas) são identificados utilizando sequenciamento próxima geração e espectrometria de massa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53478/53478fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53478/53478fig2.jpg" /> Figura 2. Seqüência de gBlock. O promotor U6 (em preto), o G nucleotídeo bntes a sequência de guia (em azul), a sequência de guia (gRNA espaçador) (em vermelho), a sequência de suporte (em verde), e uma sequência de terminador (em laranja) são mostrados. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53478/53478fig3.jpg" /> Figura 3. Rendimentos de análises enChIP representante. Insumos (A) Porcentagem para a meta de IRF-1 lócus ea Sox2 lócus não-alvo. Entradas (B) Porcentagem para os telômeros-alvo e não-alvo y-satélites. Os números foram adaptados e modificados a partir de publicações anteriores 15,16. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Categorias </td><td> Proteínas </td></tr><tr><td> Transcrição </td><td> DDX1, PARP1, CKAP4, Pescadillo homólogo, PURβ, activado RNA polimerase II activador transcricional de p15, BTF3, Myb de ligação1A proteína </td></tr><tr><td> Desacetilação Histona, componentes corepressor </td><td> RBBP4, PA2G4, TBL3 </td></tr><tr><td> Acetiltransferase </td><td> Proteína arginina metiltransferase N-1 </td></tr><tr><td> DNA topoisomerase </td><td> DNA topoisomerase 2α </td></tr><tr><td> Histones </td><td> Histona H2A.Z, H3.2 histona </td></tr></tbody></table> Tabela 1:. Exemplos de proteínas associadas com o promotor de IRF-1 humano região de uma forma de IFNy específico identificado por enChIP-SILAC A tabela foi adaptada de uma publicação anterior 16. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Categorias </td><td> Proteínas </td></tr><tr><td> Proteínas se ligam a telómeros de mamíferos </td><td> PML, RPA, CDK1, PARP1, PCBP1 </td></tr><tr><td> Telômero-binding proteínas em levedura ou outros organismos </td><td> IMP4 </td></tr><tr><td> As proteínas que interagem com o telómero de ligação proteínas [proteína de ligação dos telômeros associado] </td><td> DNA polimerase α (Pola1) [Cdc13p], ARMC6 [TRF2], CTBP1 [FoxP2-POT1], exportin-5 [terc], GNL3L [TRF1], exportin-1 [terc], 14-3-3 [terc] </td></tr><tr><td> Proteínas que localizam a heterochromatin </td><td> BEND3 </td></tr><tr><td> Proteínas reguladoras marcas epigenéticas </td><td> KDM5C </td></tr><tr><td> Proteínas cujas mutações afetam a função dos telômeros </td><td> Α DNA polimerase (Pola1), Hat1, Nup133, CDK7, DPOE1, PRDX1, TYSY, glutamato-cisteína-ligase, glutarredoxina, SMRC1 </td></tr></tbody></table> Tabela 2:. Exemplos de proteínas associadas com telômeros rato identificadas por enChIP-MS A tabela foi adapted de uma publicação anterior 15. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Categorias </td><td> RNAs </td></tr><tr><td> Componentes da telomerase </td><td> Terc, rMRP </td></tr><tr><td> Telomeric RNAs </td><td> Terras </td></tr><tr><td> scaRNAs </td><td> Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2 </td></tr><tr><td> H / ACA snoRNAs </td><td> Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a </td></tr><tr><td> C / D snoRNAs </td><td> Snord17, Snord15a, Snord118 </td></tr><tr><td> lncRNA </td><td> Neat1 </td></tr></tbody></table> Tabela 3: Exemplos de RNAs associadas com telômeros rato identificadas por enChIP-RNA-Seq A tabela foi adaptada de uma publicação anterior 17..

A identificação de moléculas associadas a regiões genômicas específicas de interesse é necessária para entender os mecanismos de regulação das funções dessas regiões. Este protocolo descreve procedimentos para realizar imunoprecipitação de cromatina mediada por molécula de ligação ao DNA (enChIP) projetada para identificação de proteínas e RNAs associados a uma região genômica específica.

O isolamento de regiões específicas genômico e identificação de moléculas pela Associated enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar uma região genômica específica mantendo as interações moleculares, para a identificação de moléculas que interagem com a região genômica. Este método pode ajudar a responder perguntas nas áreas de funções genômicas, como transcrição e regulação epigenética. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a identificação direta de moléculas que interagem com uma região genômica específica.O procedimento será demonstrado por Toshitsugu Fujita, professor assistente do meu laboratório. Após o protocolo descrito no texto, construa as moléculas de interesse que se ligam ao DNA. Isso envolve gerar a sequência gBlock de interesse e inseri-la em um retrovírus, por exemplo, para produzir o RNA guia complexado com três FLAG-dCas9.Alternativamente, podem ser geradas três proteínas FLAG-TAL que reconhecem a sequência-alvo. Em seguida, siga o protocolo descrito para infectar as células com o retrovírus preparado. Confirme a expressão das moléculas de ligação ao DNA modificadas e estabeleça a linhagem celular.Agora, prossiga com a reticulação das células usando formaldeído. Suspenda 20 milhões de células transfectadas em 30 mililitros de meio de cultura comum e adicione 810 microlitros de formaldeído a 37% para obter uma concentração final de 1%. Incube a mistura por cinco minutos a 37 graus Celsius. Após cinco minutos, interrompa a reação de reticulação adicionando 3,1 mililitros de glicina 1,25 molar.Deixe as células em repouso à temperatura ambiente por 10 minutos antes de prosseguir. Em seguida, centrifugue o tubo de células a 300 G por cinco minutos em uma centrífuga refrigerada. Descarte cuidadosamente o sobrenadante e lave o pellet celular em 30 mililitros de PBS mediante mistura e centrifugação.Realize duas lavagens com PBS. Se necessário, o pellet lavado de células fixadas pode ser armazenado a menos 80 graus Celsius. Em seguida, colete a cromatina das células.Suspenda-os em 10 mililitros de tampão de lise e incube-os em gelo por 10 minutos. Em seguida, utilizando uma centrífuga refrigerada, recolha as células e descarte cuidadosamente o sobrenadante. Agora, suspenda o pellet celular em tampão de lise nuclear e incube-o em gelo por 10 minutos.A cada poucos minutos durante a incubação, vorteje brevemente a mistura. Novamente, recolha as células por centrifugação. Agora, lave o pellet com 10 mililitros de PBS e remova a solução de lavagem com outra centrifugação.Isso produz a fração de cromatina e, se desejado, pode ser congelada rapidamente e armazenada a menos 80 graus Celsius. Prossiga suspendendo o pellet de cromatina em 800 microlitros de tampão de lise modificado três e transfira a suspensão para um tubo menor de 1,5 mililitro. Agora, ligue a sonda de sonicação no nível três de potência com ciclo contínuo.Para fragmentar a cromatina, realize manualmente ciclos alternando 10 segundos de sonicação com 20 segundos em gelo. A cada 5º ou 6º ciclo, prolongue a fase em gelo por dois minutos para evitar o superaquecimento da amostra. Realize este ciclo de sonicação de 10 a 18 vezes, mantendo a ponta da sonda afastada do fundo do tubo para evitar a formação de espuma na amostra.Após a sonicação, colete a amostra com uma centrifugação rápida e refrigerada. Em seguida, transfira o sobrenadante contendo a cromatina fragmentada para um novo tubo e descarte o precipitado. Consulte o protocolo em texto para saber como avaliar a fragmentação.Para se preparar para a imunoprecipitação, primeiro conjugue os anticorpos aos Dynabeads. Esta imunoprecipitação é dimensionada para amostras derivadas de 20 milhões de células. Adicione um volume de 1/5 do tampão de lise modificado três com Triton X-100 à cromatina fragmentada para obter uma concentração final de 1% de Triton.Em seguida, adicione a mistura às microesferas magnéticas conjugadas com IgG de camundongo normal. Incube a reação por uma hora em um agitador rotativo com refrigeração. Posteriormente, atraia as microesferas da solução por três minutos em um suporte magnético.Em seguida, colete o sobrenadante. Transfira o sobrenadante para o tubo contendo as microesferas magnéticas conjugadas com anticorpos anti-FLAG. Incube esta reação de conjugação durante a noite em agitador rotativo a quatro graus Celsius.Na manhã seguinte, aplique um ímã ao tubo durante três minutos para recolher as microesferas. Em seguida, pipete o sobrenadante e descarte-o. Agora, lave as microesferas.Suspenda-os em um mililitro de tampão de baixa salinidade e incube por cinco minutos em um rotador a quatro graus Celsius. Após a incubação, isole as esferas por magnetização e descarte o sobrenadante. Repita esta etapa de lavagem com tampão de baixa salinidade mais uma vez.Usando a mesma técnica, realize mais duas lavagens utilizando o tampão de alto sal. Continue usando o método para lavar as microesferas no tampão de cloreto de lítio duas vezes. Por fim, lave as microesferas com TBS-IGEPAL CA-630 apenas uma vez.Após as sete etapas de lavagem, suspenda as microesferas em 200 microlitros de tampão de eluição e incube-as a 37 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, atraia as microesferas por magnetização e colete o sobrenadante em um novo tubo. Repita esta etapa de eluição para aumentar os rendimentos.Em seguida, purifique cerca de 5% do DNA para estimar o rendimento. Comece misturando a maior parte do eluato em uma reação de precipitação. Precipite a cromatina durante a noite a 20 graus Celsius negativos.No dia seguinte, centrifugue a amostra e descarte o sobrenadante. Enxágue o pellet com um mililitro de etanol 70% e repita a centrifugação por 10 minutos. Em seguida, descarte o sobrenadante e suspenda o pellet em 40 microlitros de tampão de amostra 2x.Agora, vorte a suspensão durante cinco minutos completos. Em seguida, incube-a a 100 graus Celsius por 30 minutos para desnaturar e reverter a ligação cruzada. Após a fervura, aplique 40 microlitros da amostra em um gel de SDS-PAGE.Normalmente, utiliza-se um gradiente de quatro a 20%. Execute o gel até que o corante migre um centímetro abaixo do poço. Em seguida, cora o gel e corte-o em cinco pedaços com cerca de 2 milímetros de comprimento.Dilua a proteína a partir dos fragmentos de gel e utilize-a para análise por espectrometria de massa. A purificação do RNA, seguida por análise de sequenciamento, está descrita no protocolo textual. No geral, até 10% das regiões genômicas-alvo podem ser purificadas utilizando enChIP.Observam-se aqui os rendimentos de análises direcionadas à região promotora do gene IRF-1 em comparação com o locus não específico Sox2. Outro exemplo é o direcionamento dos telômeros versus o locus não específico de satélite gama. O enChIP com SILAC identificou várias proteínas associadas ao promotor de IRF-1 de maneira específica ao interferon gama.Proteínas ligadoras de telômeros também foram identificadas por enChIP combinado com espectrometria de massas. O sequenciamento de RNA por enChIP foi então utilizado para identificar os RNAs associados aos telômeros. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores nas áreas de transcrição e regulação epigenética explorarem tais mecanismos em diversos sistemas biológicos.

isolation-specific-genomic-regions-identification-associated

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui estamos apresentando uma imunoprecipitação da cromatina (CHIP) procedimento para análise do genoma localização das isoformas de proteínas que diferem em um domínio de ligação de histonas. Estamos aplicando-a-CHIP Seq análise para identificar os alvos da demetilase KDM5A/JARID1A/RBP2 histonas.

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Método para o isolamento e identificação de mRNAs, microRNAs e componentes proteicos de complexos de ribonucleoproteínas de extratos celulares utilizando RIP-Chip

Neste vídeo, demonstramos a técnica de imunoprecipitação da cromatina para identificar locais de ligação a proteínas em regiões específicas do DNA genômico de células precursoras de oligodendrócitos por meio da imunoprecipitação seletiva de fragmentos de cromatina ligados a proteínas. Este método ajuda a estudar a interação de várias proteínas reguladoras, incluindo fatores de transcrição envolvidos na regulação gênica.

Imunoprecipitação da cromatina para identificar locais de ligação de proteínas-alvo no DNA genômico

Este artigo vídeo descreve um método de microarray baseado in vitro para determinar os genes alvos e sítios de ligação para dois reguladores de resposta do sistema de componentes.

DNA-afinidade-purificada Método Chip (DAP-chip) para determinar genes alvos para bacteriana Dois Sistemas Regulatórios componentes

Nós descrevemos a clivagem endógena da cromatina, juntamente com a sequenciação de alto rendimento (ChEC-seq), um método ortogonal de imunoprecipitação com cromatina (ChIP) para mapear os locais de ligação de proteínas genômicas com proteínas de fusão de nucleases microcócicas (MNase).

Mapeamento genômico de interações proteína-DNA com ChEC-seq em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Apresentamos um método eficaz e reprodutível para isolar e cultura de células progenitoras neurais do tecido do cérebro embrionário e pós-natal por imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de histona 3 lisina 79 laboratório (H3K79me2) - uma marca do histone localizada dentro do domínio globular de histona 3.

Isolamento e cultivo de progenitores neurais seguido de imunoprecipitação de cromatina da marcação de dimetilação da lisina 9 da histona 3

A identificação das interações físicas entre genes e dos elementos reguladores é um desafio, mas tem sido facilitada pelos métodos de captura de conformação de cromossomo. Esta modificação no protocolo de 4C-seq atenua o viés PCR, minimizando a amplificação excessiva de modelos PCR e maximiza o mappability de leituras, incorporando um passo de digerir adição da enzima de restrição.

Identificação do elevado-throughput de sequências de genes regulatórios utilizando a próxima geração sequenciamento de conformação Circular cromossoma capturar (4C-seq)

Aqui, apresentamos um protocolo para a seleção in vitro de repressores transcricionais projetados (ETRs) com alta, longa duração, estável, eficiência de silenciamento no alvo e baixa atividade fora do alvo em todo o genoma. Esse fluxo de trabalho permite reduzir um repertório inicial e complexo de ETRs candidatos a uma lista curta, adequada para avaliação adicional em cenários terapeuticamente relevantes.

In vitro Seleção de Repressores Transcricionais Projetados para Silenciamento Epigenético Direcionado

A técnica iChip faz uso de um dispositivo de isolamento in-situ simples e barato que aumenta as taxas de descoberta de novos microrganismos do solo. Novos microrganismos podem ser usados para estudos adicionais relativos ao microbioma do solo ou descoberta de produtos naturais, entre outras aplicações.

Isolamento de microrganismos do solo usando a tecnologia iChip

Um método ChIRP baseado em UV para identificar interações diretas entre lncRNA e proteína.

Um método de ChIRP Baseado em UV para a Identificação Verificável de Proteínas que Interagem Diretamente com LncRNA: De Células Cultivadas a Testículos de Camundongos

Aprenda a técnica enChIP para isolar regiões genômicas específicas e identificar proteínas e RNAs associados. Este método permite estudar regulação transcricional e epigenética com alta especificidade.

O isolamento de regiões específicas genômico e identificação de moléculas pela Associated enChIP

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