O isolamento de regiões específicas genômico e identificação de moléculas pela Associated enChIP

O objetivo geral deste procedimento é isolar uma região genômica específica retendo interações moleculares para identificação de moléculas que interagem com a região genômica. Este método pode ajudar a responder a perguntas nos campos das funções genômicas, como transcrição e regulação epigenética. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a identificação direta de moléculas que interagem com uma região genômica específica.

Demonstrando o procedimento estará Toshitsugu Fujita, professor assistente do meu laboratório. Seguindo o protocolo de texto, projete as moléculas de ligação ao DNA de interesse. Isso envolve gerar a sequência gBlock de interesse e inseri-la em um retrovírus, por exemplo, para produzir o RNA guia complexado com três FLAG-dCas9.

Alternativamente, três proteínas FLAG-TAL reconhecendo a sequência alvo podem ser geradas. Em seguida, seguindo o protocolo de texto, infecte as células com o retrovírus preparado. Confirme a expressão das moléculas de ligação ao DNA projetadas e estabeleça a linha celular.

Agora, prossiga reticulando as células com formaldeído. Suspenda 20 milhões de células transfectadas em 30 mililitros de meio de cultura regular e adicione 810 microlitros de formaldeído a 37% para uma concentração final de 1% Incube a mistura por cinco minutos a 37 graus Celsius. Após cinco minutos, mate a reação de reticulação adicionando 3,1 mililitros de glicina 1,25 molar.

Deixe as células descansarem em temperatura ambiente por 10 minutos antes de prosseguir. Em seguida, centrifugue o tubo celular a 300 G por cinco minutos em uma centrífuga refrigerada. Rejeitar cuidadosamente o sobrenadante e lavar o sedimento em 30 mililitros de PBS por mistura e centrifugação.

Faça duas lavagens PBS. Se necessário, o pellet lavado de células fixas pode ser armazenado a 80 graus Celsius negativos. Continuando, colete a cromatina das células.

Suspenda-os em 10 mililitros de tampão de lise e incube-os no gelo por 10 minutos. Em seguida, usando uma centrífuga refrigerada, colete as células e descarte o sobrenadante com cuidado. Agora, suspenda o pellet celular em tampão de lise nuclear e incube-o no gelo por 10 minutos.

A cada poucos minutos durante a incubação, um breve vórtice da mistura. Novamente, colete as células por centrifugação. Agora, lave o pellet com 10 mililitros de PBS e remova a solução de lavagem com outra centrifugação.

Isso produz a fração de cromatina e, se desejado, pode ser congelada rapidamente e armazenada a 80 graus Celsius negativos. Prossiga suspendendo o pellet de cromatina em 800 microlitros de tampão de lise modificado três e transfira a suspensão para um tubo menor de 1,5 mililitro. Agora, ligue uma sonda de sonicação no nível três com serviço contínuo.

Para fragmentar a cromatina, alterne manualmente entre 10 segundos de sonicação e 20 segundos no gelo. A cada 5º ou 6º ciclo, estenda a fase de gelo para dois minutos para que a amostra não superaqueça. Execute este ciclo de sonicação 10 a 18 vezes, mantendo a ponta da sonda fora do fundo do tubo para evitar a formação de espuma na amostra.

Após a sonicação, colete a amostra com centrifugação refrigerada rápida. Em seguida, transferir o sobrenadante que contém a cromatina fragmentada para um novo tubo e rejeitar o sedimento. Veja o protocolo de texto sobre como avaliar a fragmentação.

Para se preparar para a imunoprecipitação, primeiro conjugue os anticorpos para Dynabeads. Essa imunoprecipitação é dimensionada para amostras derivadas de 20 milhões de células. Adicione 1/5 do volume de tampão de lise modificado três com Triton X-100 à cromatina fragmentada para obter uma concentração final de 1% de Triton.

Em seguida, adicione a mistura às esferas magnéticas conjugadas com IgG normal de camundongo. Incube a reação por uma hora em um rotador com refrigeração. Mais tarde, atraia as esferas da solução por três minutos em um suporte magnético.

Em seguida, colete o sobrenadante. Transferir o sobrenadante para o tubo de esferas magnéticas conjugadas com anticorpos anti-FLAG. Execute esta reação de conjugação durante a noite em um rotador a quatro graus Celsius.

Na manhã seguinte, aplique um ímã no tubo por três minutos para coletar as contas. Em seguida, pipetar o sobrenadante e descartá-lo. Agora, lave as contas.

Suspenda-os em um mililitro de tampão com baixo teor de sal e incube-os por cinco minutos em um rotador a quatro graus Celsius. Após a incubação, isole a magnetização dos grânulos e descarte o sobrenadante. Repita esta etapa de lavagem com tampão com baixo teor de sal mais uma vez.

Usando a mesma técnica, execute mais duas lavagens usando tampão com alto teor de sal. Continue usando o método para lavar as esferas em tampão de cloreto de lítio duas vezes. Por fim, lave as esferas com TBS-IGEPAL CA-630 apenas uma vez.

Após as sete etapas de lavagem, suspenda as esferas em 200 microlitros de tampão de eluição e incube-as a 37 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, atraia as esferas por magnetização e colete o sobrenadante em um novo tubo. Repita esta etapa de eluição para aumentar os rendimentos.

Em seguida, purifique cerca de 5% do DNA para estimar o rendimento. Comece misturando a maior parte do eluído em uma reação de precipitação. Precipite a cromatina durante a noite a 20 graus Celsius negativos.

No dia seguinte, centrifugue a amostra e descarte o sobrenadante. Enxágue o pellet com um mililitro de etanol a 70% e repita a centrifugação por 10 minutos. Em seguida, descarte o sobrenadante e suspenda o pellet em 40 microlitros de tampão de amostra 2x.

Agora, vórtice a suspensão por cinco minutos completos. Em seguida, incube-o a 100 graus Celsius por 30 minutos para desnaturar e reverter a reticulação. Após a fervura, execute 40 microlitros da amostra em um gel SDS-PAGE.

Normalmente, um gradiente de quatro a 20% é empregado. Execute o gel até que o corante viaje um centímetro abaixo do poço. Em seguida, manche o gel e corte-o em cinco pedaços com cerca de 2 milímetros de comprimento.

Dilua a proteína dos pedaços de gel e use-a para análise de espectrometria de massa. A purificação do RNA, seguida pela análise de sequenciamento, é abordada no protocolo de texto. No geral, até 10% das regiões genômicas alvo podem ser purificadas usando enChIP.

Vistos aqui estão os rendimentos das análises direcionadas à região promotora do gene IRF-1 em comparação com o locus Sox2 não específico. Outro exemplo é o direcionamento de telômeros versus locus de satélite gama não específico. O enChIP SILAC identificou várias proteínas associadas ao promotor IRF-1 de maneira específica para o interferon gama.

As proteínas de ligação aos telômeros também foram identificadas por enChIP combinada com espectrometria de massa. O sequenciamento de RNA enChIP foi então usado para identificar os RNAs associados aos telômeros. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores nas áreas de transcrição e regulação epigenética explorarem tais mecanismos em vários sistemas biológicos.