Name: Preparação de ilhotas fetais de primatas não humanos congelados para sequenciamento combinado de RNA de núcleo único e sequenciamento ATAC e metabolômica em massa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T12:40:00.000+00:00
Duration: 3 min 39 s
Description: Aprenda a isolar núcleos de ilhotas pancreáticas de primatas não humanos congelados para sequenciamento combinado de RNA e ATAC, preservando frações citosólicas para metabolômica. Este protocolo permite análises genômicas e metabólicas simultâneas do mesmo material.

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<meta charset="utf8"></head><body>Do RNA aos metabólitos: perfil multiômico de ilhotas fetais de primatas não humanos

<ol><li>Christensen, A. A., Gannon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta+cell+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Diab+Rep%22%5BJournal%5D)">The beta cell in type 2 diabetes.</a> Curr Diab Rep. 19 (9), 81(2019).</li>
<li>Elsakr, J. M., Gannon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+programming+of+the+pancreatic+islet+by%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental programming of the pancreatic islet by.</a> Trends Dev Biol. 10, 79-95 (2017).</li>
<li>Salzberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+and+lifestyle+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Prim+Care%22%5BJournal%5D)">Risk factors and lifestyle interventions.</a> Prim Care. 49 (2), 201-212 (2022).</li>
<li>Pound, L. D., Kievit, P., Grove, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+non-human+primate+as+a+model+for+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Endocrinol+Diabetes+Obes%22%5BJournal%5D)">The non-human primate as a model for type 2 diabetes.</a> Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 21 (2), 89-94 (2014).</li>
<li>Kang, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+RNA+sequencing+of+human+pancreatic+islets+identifies+novel+gene+sets+and+distinguishes+%CE%B2-cell+subpopulations+with+dynamic+transcriptome+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus RNA sequencing of human pancreatic islets identifies novel gene sets and distinguishes β-cell subpopulations with dynamic transcriptome profiles.</a> Genome Med. 15 (1), 30(2023).</li>
<li>Basile, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+single-nucleus+RNA-sequencing+to+interrogate+transcriptomic+profiles+of+archived+human+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Using single-nucleus RNA-sequencing to interrogate transcriptomic profiles of archived human pancreatic islets.</a> Genome Med. 13 (1), 128(2021).</li>
<li>Cabé, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-quality+brain+and+bone+marrow+nuclei+preparation+for+single+nuclei+multiome+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High-quality brain and bone marrow nuclei preparation for single nuclei multiome assays.</a> J Vis Exp. (202), e65715(2023).</li>
<li>Nuclei from embryonic mouse brain for single cell multiome ATAC + gex sequencing. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com">https://www.10xgenomics.com</a> (2022).</li>
<li>Elsakr, J. M., Deeter, C., Ricciardi, V., Gannon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+non-human+primate+pancreatic+islet+oxygen+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of non-human primate pancreatic islet oxygen consumption.</a> J Vis Exp. (154), e60696(2019).</li>
<li>Chromium next gem single cell multiome ATAC + gene expression reagent kits user guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com">https://www.10xgenomics.com</a> (2022).</li>
<li>Maruyama, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+aqueous+metabolites+from+cultured+adherent+cells+for+metabolomic+analysis+by+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Extraction of aqueous metabolites from cultured adherent cells for metabolomic analysis by capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> J Vis Exp. (148), e59551(2019).</li>
<li>Ooga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+anatomy+of+an+animal+model+revealing+homeostatic+imbalances+in+dyslipidaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Metabolomic anatomy of an animal model revealing homeostatic imbalances in dyslipidaemia.</a> Mol Biosyst. 7 (4), 1217-1223 (2011).</li>
<li>Ohashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depiction+of+metabolome+changes+in+histidine-starved+Escherichia+coli+by+CE-TOFMS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Depiction of metabolome changes in histidine-starved Escherichia coli by CE-TOFMS.</a> Mol Biosyst. 4 (2), 135-147 (2008).</li>
<li>Chiou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+chromatin+accessibility+identifies+pancreatic+islet+cell+type%E2%80%93+and+state-specific+regulatory+programs+of+diabetes+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell chromatin accessibility identifies pancreatic islet cell type– and state-specific regulatory programs of diabetes risk.</a> Nat Genetics. 53 (4), 455-466 (2021).</li>
<li>Pang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metaboanalyst+6.0%3A+Towards+a+unified+platform+for+metabolomics+data+processing%2C+analysis+and+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Metaboanalyst 6.0: Towards a unified platform for metabolomics data processing, analysis and interpretation.</a> Nucleic Acids Res. , 253(2024).</li>
<li>Willency, J. A., Lin, Y., Pirro, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+metabolomics+in+human+and+animal+biofluids+and+tissues+using+liquid+chromatography+coupled+with+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted metabolomics in human and animal biofluids and tissues using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry.</a> STAR Protoc. 5 (1), 102884(2024).</li>
<li>Behnke, J. -S., Urner, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+mass+spectrometry+detergents+for+membrane+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Emergence of mass spectrometry detergents for membrane proteomics.</a> Anal Bioanal Chem. 415 (18), 3897-3909 (2023).</li>
<li>Ouimet, C. M., D'amico, C. I., Kennedy, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+capillary+electrophoresis+and+the+implications+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Advances in capillary electrophoresis and the implications for drug discovery.</a> Expert Opin Drug Discov. 12 (2), 213-224 (2017).</li>
<li>Alexandrov, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+metabolomics+and+imaging+mass+spectrometry+in+the+age+of+artificial+intelligence%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Data+Sci%22%5BJournal%5D)">Spatial metabolomics and imaging mass spectrometry in the age of artificial intelligence.</a> Annu Rev Biomed Data Sci. 3, 61-87 (2020).</li>
<li>Ewald, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web-based+multi-omics+integration+using+the+analyst+software+suite%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Web-based multi-omics integration using the analyst software suite.</a> Nat Protoc. 19, 1467-1497 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Injetor de cânula de cérebro de rato 33 G</td><td>Protech International</td><td>8IC315IS5SPC</td><td>Para canulação de ducto e inflação de pâncreas</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Fisher</td><td>15-140-122</td><td>Para mídia RT</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Millipore/Sigma</td><td>F4135-500ML</td><td>Para mídia RT</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-875-135</td><td>Para mídia RT</td></tr><tr><td>Colagenase P</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11213865001</td><td>Para digestão do pâncreas</td></tr><tr><td>Bovine Dnase I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11284932001</td><td>Para meio RT e isolamento</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher</td><td>D16-1</td><td>A concentração final será de 2,8 mM</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Fisher</td><td>C4901-500G</td><td>A concentração final será de 0,5 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>Final a concentração será de 10 mM</td></tr><tr><td>de Albumina de Soro Bovino (BSA) Fração 5</td><td>Research Products International</td><td>A30075100</td><td>A concentração final será de 0,5 mg/mL</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle</td><td>Medium Gibco</td><td>11966025</td><td>Para colher ilhotas</td></tr><tr><td>20x Nuclei Buffer</td><td>10X Genomics</td><td>2000153/2000207</td><td></td></tr><tr><td>Digitonina (5%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2006</td><td>A digitonina pode precisar ser aquecida a 65 &graus; C para dissolver precipitado branco</td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (30 &micro; M)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Stock Solution (10%)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma Aldrich</td><td>i8896</td><td>Prepare um estoque de 10% usando a solução</td></tr> de <tr><td>cloridrato de Trizma de água MilliQ, pH 7,5</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2319-1L</td><td></td></tr><tr><td>Solução de cloreto de sódio, 5 M</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6546-1L</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Cloreto de Magnésio, 1 M</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Protetor Sigma Inibidor de Rnase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Research Products International</td><td>D11000-5.0</td><td></td></tr><tr><td>Pilões de pellets descartáveis sem Rnase</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-141-368</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Biorreagentes Fisher</td><td>BP337-500</td><td>Prepare um stock a 20% utilizando MilliQ água</td></tr><tr><td>sem nuclease</td><td>Promega</td><td>PR-P1193</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Tubes (5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30108310</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials (1,5 mL)</td><td>VWR</td><td>20170-225</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click Tubes (0,6 mL)</td><td>Denville</td><td>C-2177</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue (0,4%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T-10282</td><td></td></tr><tr><td>Corrediças de contagem de células de câmara dupla</td> Sistema de água ultrapura <td>Bio-Rad</td><td>1450011</td><td></td></tr><tr><td>MiiliQ</td><td>Millipore/Sigma</td><td>7003/05/10/15</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de corte de 5 kDa</td><td>HMT Metabolome Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Padrões internos</td><td>HMT Metabolome Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P10, P20, P200 e P1000 Pipetas</td><td>Eppendorf</td><td>2231000602</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de Pipeta, 10 &micro; L</td><td>VWR</td><td>76322-528</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de Pipeta, 1000 &micro; L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21-236-2A</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de Pipeta, 20 &micro; L</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-404</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de Pipeta, 200 &micro; L</td><td>USA Scientific</td><td>1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de Contraste de Fase</td><td>Olympus</td><td>BX41-PH-B</td><td></td></tr><tr><td>Contador de Células Automatizado Countess II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (1x)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-30R Centrífuga</td><td>Beckman-Coulter</td><td>B06315</td><td></td></tr><tr><td>RNase-ZAP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2020</td><td></td></tr></tbody></table>

preparação de ilhotas fetais de primatas não humanos congelados para sequenciamento combinado de rna de núcleo único e sequenciamento atac e metabolômica em massa

Preparation of Frozen Non-Human Primate Fetal Islets for Combined Single Nuclei RNA-Sequencing and ATAC-Sequencing, and Bulk Metabolomics

A qualidade das saídas de sequenciamento é altamente dependente da qualidade da entrada nuclear. O blebbing nuclear e os danos à membrana nuclear externa resultarão em contaminação ambiental de RNA e DNA na análise, o que introduzirá ruído nos dados. Um extrato nuclear puro terá evidência mínima de núcleos encapsulados com componentes citoplasmáticos (Figura 2A) ou superdigestão, evidenciada por núcleos estourados (Figura 2B). Uma entrada nuclear ideal conterá núcleos intactos (Figura 2C).
Detalhes da análise de dados de sequenciamento de RNA e ATAC de núcleo único são amplamente fornecidos em outros lugares 5,14. Agrupamentos representativos de populações celulares de uma preparação nuclear fetal de NHP são ilustrados via UMAP na Figura 3A. Os dados metabolômicos são prontamente analisados usando software de código aberto, conforme descrito anteriormente15. Os espectros gerados podem ser visualizados e os metabólitos enriquecidos nas ilhotas de um feto de uma mãe alimentada com WSD podem ser comparados aos de uma mãe alimentada com CD (Figura 3B-F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66849/66849fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral do protocolo para isolamento de núcleos e fração citosólica. As ilhotas pancreáticas fetais foram armazenadas a -80 °C até o dia do ensaio. Os núcleos foram isolados e utilizados para sequenciamento de RNA e ATAC de núcleo único. A fração citosólica após a primeira lavagem do isolamento dos núcleos foi retida para eletroforese capilar-espectrometria de massa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66849/66849fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66849/66849fig02.jpg"> Figura 2: Demonstração da entrada adequada de núcleos no ensaio multiômico de núcleo único. Exemplos de (A) Núcleo encapsulado por citoplasma, (B) Núcleo em ruptura com membrana nuclear comprometida e (C) Núcleo intacto com morfologia arredondada. Barras de escala: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66849/66849fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66849/66849fig03.jpg"> Figura 3: Dados representativos da combinação de multiômica de núcleo único e metabolômica em massa. (UMA) Agrupamento UMAP de subtipos celulares dentro de ilhotas NHP fetais isoladas com base na expressão gênica. Estimativa quantitativa dos metabólitos glicolíticos, (B) fosfato de dihidroxiacetona e (C) glicerol-3-fosfato na fração citosólica de ilhotas NHP fetais isoladas quando a mãe foi alimentada com um WSD (mWSD) ou um CD (mCD). A dieta materna também pode regular diferencialmente o metabolismo por meio do (D) ciclo do ácido cítrico (2-oxoglutarato), (E) metabolismo de aminoácidos (creatina) e alterando (F) o status redox celular (glutationa) em ilhotas fetais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66849/66849fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Formulações tampão para isolamento de núcleos. Componentes detalhados de núcleos, lise, diluição de lise e tampões de lavagem são mostrados. Se necessário, diluir os reagentes até à concentração de reserva antes de preparar o tampão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66849/66849_Table%201.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

Preparação de ilhotas fetais de primatas não humanos congelados para sequenciamento combinado de RNA de núcleo único e sequenciamento ATAC e metabolômica em massa

One challenge in studies using tissue collected from multiple cohorts is avoiding batch effects when preparing for large-scale multi-omic experiments, ...

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Aprenda a isolar núcleos de ilhotas pancreáticas de primatas não humanos congelados para sequenciamento combinado de RNA e ATAC, preservando frações citosólicas para metabolômica. Este protocolo permite análises genômicas e metabólicas simultâneas do mesmo material.

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