Preparação de ilhotas fetais de primatas não humanos congelados para sequenciamento combinado de RNA de núcleo único e sequenciamento ATAC e metabolômica em massa
8 de novembro de 2024
Este protocolo descreve procedimentos para isolar núcleos de alta qualidade de ilhotas pancreáticas de primatas não humanos congelados para uso em sequenciamento simultâneo de RNA de núcleo único e sequenciamento ATAC, preservando a fração citosólica em massa para análises metabolômicas das mesmas amostras.
Utilizamos um modelo de primata não humano altamente translacional para avaliar como a dieta materna e o consumo de medicamentos durante a gravidez influenciam o desenvolvimento embrionário e a função pós-natal das ilhotas pancreáticas na prole. Mudanças programadas no desenvolvimento podem alterar a suscetibilidade à doença mais tarde na vida. Um desafio ao trabalhar com amostras difíceis de adquirir, como as de primatas não humanos, é avaliar várias perguntas do mesmo indivíduo de forma eficiente.
Infelizmente, extrair simultaneamente informações do metaboloma e do genoma pode ser difícil devido à incompatibilidade dos reagentes de ensaio na degradação sensível ao tempo das moléculas a serem quantificadas. Nosso protocolo permite a extrapolação da abundância de metabólitos, acessibilidade da cromatina e expressão gênica diferencial do mesmo material de partida. Essa abordagem em várias camadas fornece informações sobre como o metabolismo pode alterar o genoma nas ilhotas pancreáticas.
Visão Geral
Este protocolo descreve métodos para isolar núcleos de alta qualidade de ilhotas pancreáticas de primatas não humanos congeladas para sequenciamento simultâneo de RNA e sequenciamento ATAC. Também preserva a fração citosólica em massa para análises metabolômicas, permitindo uma compreensão abrangente das interações metabólicas e genômicas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia
- Metabolômica
Antecedentes
- Modelos de primatas não humanos são cruciais para o estudo dos mecanismos das doenças humanas.
- A dieta materna e medicamentos podem influenciar o desenvolvimento das ilhotas pancreáticas da prole.
- A análise simultânea do metaboloma e do genoma é desafiadora devido à degradação da amostra.
- Este estudo aborda a necessidade de análises eficientes em múltiplas camadas a partir de amostras limitadas.
Objetivo do Estudo
- Avaliar o impacto de fatores maternos no desenvolvimento das ilhotas pancreáticas embrionárias.
- Explorar como alterações metabólicas podem influenciar a expressão genômica.
- Desenvolver um protocolo que permita análise abrangente a partir da mesma amostra.
Métodos Utilizados
- Isolamento de núcleos de ilhotas pancreáticas.
- Sequenciamento simultâneo de RNA e sequenciamento ATAC.
- Preservação de frações citosólicas para estudos metabolômicos.
- Análise multicamada para avaliar a abundância de metabólitos e a expressão gênica.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de frações nucleares e citossólicas de alta qualidade.
- Compreensão de como a dieta materna afeta a função das ilhotas pancreáticas.
- Viabilidade demonstrada de análises genômicas e metabolômicas simultâneas.
- Revelação de possíveis associações entre metabolismo e expressão gênica nas ilhotas.
Conclusões
- Este protocolo permite uma análise abrangente das ilhotas pancreáticas.
- Os achados podem orientar estudos futuros sobre a suscetibilidade a doenças.
- Destaca a importância das influências maternas na saúde da prole.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A integração de RNA-seq de núcleo isolado, ATAC-seq e metabolômica em massa a partir de ilhotas de primatas não humanos congeladas resolve um gargalo crítico na descoberta multiômica utilizando amostras raras ou valiosas. Essa abordagem permite um perfil molecular abrangente a partir de material limitado, apoiando a confiança preditiva na validação precoce de alvos e na redução de riscos mecanicistas. O protocolo maximiza o rendimento de dados por amostra, orientando decisões de portfólio ajustadas ao risco em pesquisas sobre doenças metabólicas e do desenvolvimento.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação dos mecanismos metabólicos e epigenéticos subjacentes à identidade celular em sistemas relevantes para doenças.
- Apóia a validação funcional de alvos ao associar a abundância de metabólitos à expressão gênica e acessibilidade da cromatina.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao integrar dados moleculares multicamadas provenientes da mesma fonte biológica.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Prepara frações nucleares e citosólicas validadas para sequenciamento de alto rendimento e fluxos de trabalho em metabolômica.
- Melhora a reprodutibilidade e padronização dos ensaios ao minimizar efeitos de lote em estudos com múltiplas coortes.
- Permite saídas quantitativas multi-ômicas para avaliação robusta de compostos ou perturbações.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha leituras moleculares com biomarcadores metabólicos e epigenéticos relevantes para doenças em modelos translacionais.
- Apóia a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, aproveitando sistemas de primatas não humanos.
- Fornece insights preditivos sobre mecanismos de programação do desenvolvimento e suscetibilidade a doenças.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo conecta a descoberta inicial, a validação de alvos e a pesquisa translacional ao permitir o perfilamento multi-ômico a partir de amostras raras de tecido.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre interações metabólicas-epigenéticas no desenvolvimento das ilhotas.
- Triagem: Fornece preparações reprodutíveis de núcleos e metabólitos para ensaios omicos escaláveis.
- Análises: Oferece dados quantitativos de expressão gênica, acessibilidade da cromatina e abundância de metabólitos para análises comparativas.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas moleculares a fenótipos relevantes para doenças em modelos de primatas não humanos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho reutilizável para maximizar a extração de dados a partir de amostras limitadas ou arquivadas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa de estágio inicial.
- Valor Operacional: Padroniza a preparação de amostras multi-ômicas e minimiza efeitos de lote.
- Valor Estratégico: Permite decisões mais informadas de prosseguir/não prosseguir e uso eficiente de capital em amostras raras.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de programas para doenças metabólicas e do desenvolvimento.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em isolamento de núcleos, sequenciamento de único núcleo e fluxos de trabalho em metabolômica.
- Exige acesso a infraestrutura de sequenciamento de alto rendimento e espectrometria de massas.
- Necessita padronização rigorosa entre equipes para controle de efeitos de lote.
- Adaptável a outros tipos de tecidos, mas pode exigir otimização do protocolo para diferentes matrizes de amostras.
- A escassez de amostras e a sensibilidade à degradação impõem limitações práticas quanto à produtividade e cronograma.
