Preparação de ilhotas fetais de primatas não humanos congelados para sequenciamento combinado de RNA de núcleo único e sequenciamento ATAC e metabolômica em massa
November 8th, 2024
Este protocolo descreve procedimentos para isolar núcleos de alta qualidade de ilhotas pancreáticas de primatas não humanos congelados para uso em sequenciamento simultâneo de RNA de núcleo único e sequenciamento ATAC, preservando a fração citosólica em massa para análises metabolômicas das mesmas amostras.
Utilizamos um modelo de primata não humano altamente translacional para avaliar como a dieta materna e o consumo de medicamentos durante a gravidez influenciam o desenvolvimento embrionário e a função pós-natal das ilhotas pancreáticas na prole. Mudanças programadas no desenvolvimento podem alterar a suscetibilidade à doença mais tarde na vida. Um desafio ao trabalhar com amostras difíceis de adquirir, como as de primatas não humanos, é avaliar várias perguntas do mesmo indivíduo de forma eficiente.
Infelizmente, extrair simultaneamente informações do metaboloma e do genoma pode ser difícil devido à incompatibilidade dos reagentes de ensaio na degradação sensível ao tempo das moléculas a serem quantificadas. Nosso protocolo permite a extrapolação da abundância de metabólitos, acessibilidade da cromatina e expressão gênica diferencial do mesmo material de partida. Essa abordagem em várias camadas fornece informações sobre como o metabolismo pode alterar o genoma nas ilhotas pancreáticas.
Visão Geral
Este protocolo descreve métodos para isolar núcleos de alta qualidade de ilhotas pancreáticas de primatas não humanos congelados para sequenciamento de RNA simultâneo e sequenciamento ATAC. Também preserva a fração citosólica em massa para análises metabolômicas, permitindo uma compreensão abrangente das interações metabólicas e genômicas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia
- Metabolômica
Fundo
- Modelos de primatas não humanos são cruciais para estudar mecanismos de doenças humanas.
- A dieta materna e a medicação podem influenciar o desenvolvimento das ilhotas pancreáticas da prole.
- A análise simultânea do metaboloma e do genoma é desafiadora devido à degradação da amostra.
- Este estudo aborda a necessidade de análises multicamadas eficientes a partir de amostras limitadas.
Propósito do Estudo
- Avaliar o impacto dos fatores maternos no desenvolvimento das ilhotas pancreáticas embrionárias.
- Explorar como as mudanças metabólicas podem influenciar a expressão genômica.
- Desenvolver um protocolo que permita uma análise abrangente a partir da mesma amostra.
Métodos Utilizados
- Isolamento de núcleos das ilhotas pancreáticas.
- Sequenciamento de RNA simultâneo e sequenciamento ATAC.
- Preservação de frações citosólicas para estudos metabolômicos.
- Análise multicamadas para avaliar a abundância de metabólitos e expressão gênica.
Principais Resultados
- Isolamento bem-sucedido de núcleos e frações citosólicas de alta qualidade.
- Insights sobre como a dieta materna afeta a função das ilhotas pancreáticas.
- Demonstração da viabilidade de análises genômicas e metabolômicas simultâneas.
- Revelação de potenciais ligações entre metabolismo e expressão gênica nas ilhotas.
Conclusões
- Este protocolo permite uma análise abrangente das ilhotas pancreáticas.
- Os resultados podem informar futuros estudos sobre suscetibilidade à doença.
- Destaca a importância das influências maternas na saúde da prole.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Integrating single-nucleus RNA-seq, ATAC-seq, and bulk metabolomics from frozen non-human primate islets addresses a critical bottleneck in multi-omic discovery using rare or precious samples. This approach enables comprehensive molecular profiling from limited material, supporting predictive confidence in early target validation and mechanistic de-risking. The protocol maximizes data yield per sample, informing risk-adjusted portfolio decisions in metabolic and developmental disease research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of metabolic and epigenetic mechanisms underlying cellular identity in disease-relevant systems.
- Supports functional target validation by linking metabolite abundance to gene expression and chromatin accessibility.
- Facilitates mechanistic de-risking by integrating multi-layered molecular data from the same biological source.
Screening & Assay Development
- Prepares validated nuclei and cytosolic fractions for downstream high-throughput sequencing and metabolomics workflows.
- Improves assay reproducibility and standardization by minimizing batch effects across multi-cohort studies.
- Enables quantitative, multi-omic outputs for robust compound or perturbation evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular readouts with disease-relevant metabolic and epigenetic biomarkers in translational models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by leveraging non-human primate systems.
- Provides predictive insights into developmental programming and disease susceptibility mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol bridges early discovery, target validation, and translational research by enabling multi-omic profiling from rare tissue samples.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on metabolic-epigenetic interactions in islet development.
- Screening: Delivers reproducible nuclei and metabolite preparations for scalable omics assays.
- Analytics: Provides quantitative gene expression, chromatin accessibility, and metabolite abundance data for comparative analyses.
- Translational Research: Connects molecular findings to disease-relevant phenotypes in non-human primate models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for maximizing data extraction from limited or archival samples.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early-stage research.
- Operational Value: Standardizes multi-omic sample preparation and minimizes batch effects.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and capital-efficient use of rare samples.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of metabolic and developmental disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nuclei isolation, single-nucleus sequencing, and metabolomics workflows.
- Demands access to high-throughput sequencing and mass spectrometry infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization to control for batch effects.
- Adaptable to other tissue types but may require protocol optimization for different sample matrices.
- Sample scarcity and degradation sensitivity impose practical limitations on throughput and timing.
