Preparação de Mycobacterium abscessus embebido em grânulo de ágar para inocular camundongos imunocompetentes por via intratraqueal

Estamos desenvolvendo um modelo de camundongo de infecção pulmonar crônica por abscessos de micobactéria para testar a eficácia dos antibióticos em estudos pré-clínicos. O primeiro desafio é superar a resistência intrínseca dos camundongos aos abscessos da micobactéria. O segundo desafio é gerar um lote reprodutível de bactérias incorporadas em ágar para infecção intratraqueal. Queremos compartilhar um protocolo detalhado de preparação e infecção de batimento de ágar que pode ser facilmente implementado por outros laboratórios para testar novos medicamentos em camundongos.

A infecção com bactérias incorporadas em ágar em vez de bactérias livres supera parcialmente a capacidade de camundongos imunocompetentes de eliminar espontaneamente a infecção. Este modelo fornece uma ferramenta pré-clínica robusta para avaliar novos antibióticos contra o Mycobacterium abscessus, facilitando a descoberta e o desenvolvimento de antibióticos muito necessários contra infecções pulmonares.

[Instrutor] Para começar, obtenha culturas de suspensão de mycobacterium abscessus de crescimento exponencial ajustadas a uma densidade óptica de 30. Transfira 27 mililitros de trado de soja tríptico derretido pré-equilibrado a 50 graus Celsius em um tubo contendo três mililitros de suspensão bacteriana. Misture a suspensão por pipetagem. Pipete cuidadosamente a mistura de trado de bactérias em um frasco contendo 60 mililitros de óleo mineral em um frasco. Colocar o balão num recipiente secundário e começar imediatamente a agitar a velocidade média com uma agitação magnética com uma barra de agitação magnética. Certifique-se de que um vórtice visível se forme na mistura do sem-fim de óleo e continue mexendo por seis minutos em temperatura ambiente. Coloque gelo no recipiente secundário para permitir que a suspensão esfrie. Em seguida, transfira a mistura de pasta para tubos de centrífuga de 250 mililitros. Centrifugue a suspensão a 3.700 G por seis minutos a quatro graus Celsius nos primeiros cinco ciclos e ressuspenda o pellet de talão helicoidal com DPBS. Além disso, monte um filtro de célula de funil, anel conector e um tubo de 50 mililitros em uma única unidade. Após a 10ª lavagem, ressuspenda o pellet e dilua a suspensão do cordão quatro vezes. Adicione o material de amostra diluído no filtro para filtrar a suspensão do cordão. Lentamente, puxe o pistão de uma seringa de 30 mililitros presa ao anel conector para criar sucção e melhorar a filtração. Em seguida, centrifugar a suspensão diluída a 1000 g durante dois minutos para a concentrar. Depois de puxar os grânulos para um tubo de 50 mililitros, armazene-os a quatro graus Celsius por até uma semana, mas prepare grânulos novos para cada lote de experimentos. Para começar, contenha os mouses CD one sedados usando um suporte tridimensional personalizado e impresso inclinado. Prenda o mouse por seus incisivos usando uma corda de sutura presa à haste central do suporte. Posicionar o mouse em uma postura ventral reclinada com a cabeça levantada. Conecte uma agulha de alimentação animal de calibre 24 de metal a uma seringa de vidro cheia de suspensão de talão de trado de mycobacterium abscessus. Coloque clipes ou rolhas de náilon no êmbolo para garantir um volume de inóculo controlado de 50 microlitros por mouse. Agora, posicione a agulha de gavagem de metal verticalmente acima do mouse. Insira cuidadosamente a agulha na parte superior e deslize-a mais para baixo na traqueia. Remova o clipe de náilon ou rolha e distribua lentamente 50 microlitros de suspensão de esferas de trado de mycobacterium abscessus nos pulmões. Deixe o mouse descansar por cinco minutos. Em seguida, repita o procedimento de inoculação uma segunda vez para garantir a deposição profunda e reprodutível do inóculo completo nos pulmões. As esferas de trado contendo mycobacterium abscessus expressaram a proteína fluorescente vermelha mCherry e variaram em tamanho de aproximadamente 70 a 250 micrômetros. A carga bacteriana em seis preparações independentes de grânulos mostrou alta reprodutibilidade. A enumeração bacteriana antes e depois de passar pela seringa de vidro não mostrou perda significativa da carga bacteriana. O método de inoculação intertraqueal foi reprodutível em três preparações independentes de grânulos, conforme mostrado pela contagem de UFC pulmonar 24 horas após a infecção. A reprodutibilidade da infecção entre três operadores independentes foi confirmada à medida que as contagens de UFC pulmonares 24 horas após a infecção permaneceram consistentes em todos os grupos.