Separação e Caracterização Diferencial de Vesículas Microbianas Extracelulares Intestinais em Ratos Sensíveis ao Sal sob Condições de Dieta Rica em Sal

Esta pesquisa explora o papel das vesículas extracelulares microbianas intestinais em ratos hipertensos sensíveis ao sal em uma dieta rica em sal, examinando como uma dieta rica em sal altera as vesículas e influencia as interações hipertensivas e imunológicas. Avanços recentes neste campo incluem a compreensão do papel das vesículas extracelulares microbianas intestinais na hipertensão, avaliando o impacto de dietas ricas em sal na diversidade microbiana e implementando intervenções baseadas em plantas direcionadas às vesículas da regulação metabólica e imunológica. Os desafios experimentais atuais incluem isolar vesículas extracelulares de alta prioridade, distinguir também vesículas derivadas de vesículas de microbioma, minimizando a perda de amostras nos protocolos de tingimento padrão para garantir a reprodutibilidade entre os estudos. Esta grade de densidade e protocolo de centrifugação fornece maior prioridade às vesículas extracelulares com integridade e reprodutibilidade aprimoradas em comparação com os métodos tradicionais, permitindo uma pesquisa mais confiável de vesículas extracelulares do microbioma intestinal em estudos de hipertensão.

[Narrador] Para começar, transfira cinco gramas de fezes para um tubo de centrífuga pré-pesado de 50 mililitros. Adicione 50 mililitros de PBS livre de endotoxinas pré-aquecido a 37 graus Celsius ao tubo e gire o tubo por 30 minutos. Resfrie a centrífuga de alta velocidade a 4 graus Celsius. Em seguida, coloque a amostra simetricamente na centrífuga e gire a 8.000G por 15 minutos. Após centrifugação, aspirar o sobrenadante e transferi-lo para um novo tubo de centrifugação estéril. Depois de centrifugar novamente durante 15 minutos, aspirar cuidadosamente o sobrenadante e utilizá-lo para uma análise posterior. Coloque uma unidade de filtro estéril de 0.22 micrômetro no gelo. Transfira o sobrenadante para a parte superior do filtro e ligue a bomba de vácuo para coletar as amostras filtradas. Transferir o filtrado para um filtro centrífugo com um corte de 10 kilodalton e uma capacidade de 15 mililitros. Centrifugue a 4 graus Celsius 3000G por 30 minutos para concentrar a amostra em pelo menos 1.400 microlitros. Coloque imediatamente a amostra no gelo. Misture um volume de tampão de gradiente A com cinco volumes de meio de gradiente de densidade para preparar a solução de trabalho. Prepare uma solução de iodixanol a 10% misturando uma unidade de solução de trabalho com quatro unidades de tampão B. Da mesma forma, misture duas unidades de solução de trabalho com três unidades de tampão B para uma solução de iodixanol a 20% e quatro unidades de solução de trabalho com uma unidade de tampão B para uma solução de iodixanol a 40%. Agora misture a amostra concentrada preparada anteriormente com sete mililitros de meio gradiente de densidade para fazer uma solução de iodixanol a 50%. Para preparar um gradiente de densidade, adicione solução de azul de tripano às soluções de iodixanol a 40% e 10%. Transfira oito mililitros de solução de iodixanol a 50% para o fundo de um tubo de centrífuga de polipropileno de parede fina. Incline o tubo a 70 graus e transfira oito mililitros de solução de iodixanol a 40% para a superfície do líquido. Em seguida, adicione oito mililitros de solução de iodixanol a 20%, seguidos por sete mililitros de solução de iodixanol a 10% e dois mililitros de PBS livre de endotoxina. Pegue o tubo de gradiente de densidade preparado e coloque-o em uma ultracentrífuga pré-resfriada. Defina os parâmetros de ultracentrifugação para 100.000 G, 20 horas e 10 graus Celsius e inicie a corrida. Para a separação manual da densidade do gradiente para a coleção, o gradiente de densidade é de cerca de 34 mililitros de líquido. Dois mililitros de solução são extraídos lentamente do centro da superfície do líquido, e cada solução de dois mililitros é um gradiente. Portanto, a solução de gradiente de densidade é dividida em 17 gradientes. Por fim, com uma pipeta, transferir as fracções de densidade para tubos de amostra estéreis e colocá-los imediatamente no gelo. A análise de rastreamento de nanopartículas revelou os perfis de tamanho, distribuição e concentração de vesículas extracelulares coletadas de diferentes frações de gradiente de densidade. A maioria das vesículas extracelulares em todas as frações estava concentrada na faixa de tamanho de 30 a 100 nanômetros, seguindo um padrão de distribuição típico. A concentração de vesículas extracelulares atingiu seu nível mais alto na fração nove, atingindo um pico de aproximadamente 3,85 vezes 10 elevado a nove partículas por mililitro. O teor de proteína, medido usando um kit de ácido bicinconínico, também foi maior na fração nove, com 0,417 microgramas por microlitro. Além disso, os níveis de expressão de lipopolissacarídeos, determinados usando um kit de detecção de endotoxinas, foram significativamente elevados nas frações nove e 10. Maiores quantidades de proteína também foram observadas na fração nove durante a análise de eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio. A microscopia eletrônica de transmissão, ou imagens TEM, revelou as vesículas extracelulares possuídas como morfologia circular semelhante a uma membrana.