Name: Rastreamento de proteínas individuais em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprenda a rastrear proteínas individuais em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência. Este método revela estados ocultos da dinâmica proteica em membranas biomiméticas.

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<table><tbody><tr><td>Placa de onda 1/4</td><td>Thorlabs</td><td>WPQ05M-633</td><td>Certifique-se de combinar o laser</td></tr><tr><td>Objetivo 100X do Petróleo</td><td>Olympus</td><td>12-563-659</td><td>1,45 N/A apocromático</td></tr><tr><td>16:0-18:1 PC</td><td>Lípidos polares Avanti</td><td>850457</td><td>POPC Fosfolipídios</td></tr><tr><td>18:0 PEG2000 Educação Física</td><td>Lípidos polares Avanti</td><td>880210</td><td>Sal de Amônio</td></tr><tr><td>Lente 300mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-300-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>Laser He:Ne de 633 nm</td><td>Melles Griot</td><td>05-LHP-927</td><td>Pode ser alterado para outras fontes e para outros comprimentos de onda</td></tr><tr><td>Filtro passa-banda de 633nm</td><td>Chroma Tech</td><td>633/10X</td><td>Correspondência com o laser usado</td></tr><tr><td>Filtro passa-longa de 655nm</td><td>Chroma Tech</td><td>ET655lp</td><td>Altere para corresponder aos comprimentos de onda do corante/laser</td></tr><tr><td>Andor Solis I</td><td>Andor&nbsp;</td><td>Andor Solis I</td><td>Software para captura de imagem</td></tr><tr><td>ATTO 655&nbsp;</td><td>ATTO-TEC</td><td>655 d.C.</td><td>Modificação NHS-Ester, qualquer corante com uma modificação adequada para trabalho com molécula única pode ser utilizada. ATTO é recomendado, mas Cy5/7 pode ser usado</td></tr><tr><td>Bioesferas SM-2 Resina</td><td>BioRad</td><td>1523922</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Millipore Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3155-50MG</td><td>de fígado bovino, soltion aquoso e GE; 30.000 unidades/mg</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Fisher Scientific & nbsp;</td><td>C547-1</td><td>HPLC ou grau espectroscópico</td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Coberturas</td><td>Óptica ESCO</td><td>R525000</td><td>Quartzo 25mm</td></tr><tr><td>Divisor de Feixe Dicroico</td><td>Semrock</td><td>FF545/650-Di01-25x36</td><td>Altere para corresponder aos comprimentos de onda do corante/laser</td></tr><tr><td>Câmera EMCCD</td><td>Andor&nbsp;</td><td>iXon Ultra 888</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tubes 15mL&nbsp;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188261</td><td>Tubos de cultura celular Cellestar</td></tr><tr><td>Glucose Oxidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133-50KU</td><td>de Aspergillus niger, typer VII, &ge; 100000 unidades/g sólido (sem oxigênio adicionado)</td></tr><tr><td>Pistola de Calor</td><td>Carga do Porto</td><td>56434</td><td>Usado no aquecimento do parafilme, geralmente qualquer pistola de calor podia ser usada</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Biorreagentes Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de imersão de baixa autofluorescência</td><td>Thorlabs</td><td>MOIL-30</td><td></td></tr><tr><td>Methonal</td><td>Fisher Scientific & nbsp;</td><td>A452-1</td><td>HPLC ou grau espectroscópico</td></tr><tr><td>Tubo Microcentrífuga</td><td>VMR</td><td>525-1126</td><td>1,5 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Micro Pipetters</td><td>Ependorf</td><td></td><td>Vários; 1000 & micro; L, 100 & micro; L e 10 & micro; L são sugeridos</td></tr><tr><td>& Oslash; Tubos de lente de 1,5"</td><td>Thorlabs</td><td>SM1.5L10</td><td>A rosca externa é raspada para preparação da amostra</td></tr><tr><td>Tabela Óptica</td><td>Newport</td><td>Dependência RPR</td><td>O tamanho da tabela depende do espaço disponível</td></tr><tr><td>Tecidos ópticos</td><td>Thorlabs</td><td>MC-50E</td><td>Limpeza de vários componentes</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Millipore Sigma</td><td>P7669</td><td>Verifique não haver gases fluorescentes durante o processo</td></tr><tr><td>Atuador piezo</td><td>Newport</td><td>PZA12</td><td></td></tr><tr><td>Isoladores pneumáticos de vibração</td><td>Newport</td><td>Série I-2000</td><td>usado para estabilizar a tabela óptica para qualquer irregularidade &nbsp;</td></tr><tr><td>Banho Refrigerado</td><td>Fisher Scientific & nbsp;</td><td>Isotemp 3016</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de obturador</td><td>Thorlabs</td><td>SC10</td><td>Vinculado ao software de imagem</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Millipore Sigma</td><td>S988</td><td></td></tr><tr><td>Filtro Steritop</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2GPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>Driver e Controlador de Switchbox&nbsp;</td><td>Newport</td><td>PZC200</td><td>Controlador de estágio</td></tr><tr><td>Filtro de Seringa</td><td>J.T. Baker</td><td>SF01-98</td><td>PES 25mm 0.2 & micro; M</td></tr><tr><td>Elemento TEC</td><td>Thorlabs</td><td>TEC3-2.5</td><td>Usado para conectar a bomba de calor Peltirer ao suporte da amostra e ao colar objetivo</td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>Engenharia Meerstetter</td><td>TEC-1091</td><td></td></tr><tr><td>Detector de Temperatura</td><td>Thorlabs</td><td>TH100PT</td><td></td></tr><tr><td>Termistor</td><td>Thorlabs</td><td>TH10K</td><td></td></tr><tr><td>Diálisador Tube-O-Diálisador</td><td>G Biosciences</td><td>786-611</td><td>4K MWCO</td></tr><tr><td>Limpador UV de Ozônio</td><td>Novascan</td><td>PSDP_UV</td><td>Pro Series - Digital & nbsp;</td></tr><tr><td>Zoom Optics&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>SM1NR1</td><td></td></tr></tbody></table>

rastreamento de proteínas individuais em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência

Tracking Single Proteins in Lipid Bilayers Using Fluorescence Microscopy

Rastreamento de proteínas individuais em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência

Direct observation is a fundamental method for scientific discovery and understanding. Time-lapse single-molecule fluorescence imaging allows the ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este protocolo descreve como usar a microscopia de fluorescência de reflexão interna total para visualizar e rastrear receptores únicos na superfície de células vivas e, assim, analisar a mobilidade lateral do receptor, o tamanho dos complexos receptores, bem como visualizar as interações transitórias receptor-receptor. Este protocolo pode ser estendido a outras proteínas de membrana.

De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

A distribuição espacial e a dinâmica temporal das proteínas e lipídios da membrana plasmática são um tema quente na biologia. Aqui, esse problema é abordado por uma análise de flutuação de imagem espaço-temporal que fornece conceitualmente as mesmas quantidades físicas de rastreamento de partícula única, mas usa pequenos rótulos moleculares e configurações de microscopia padrão.

De fast imagens de fluorescência com a Lei difusão molecular em membranas de células vivas em um microscópio comercial

Apresenta-se um método de preparação de mica suportado bicamadas lipídicas para microscopia de alta resolução. Mica é transparente e liso em uma escala atômica, mas raramente usado em imagiologia por causa de dificuldades de manuseio; a preparação resulta em deposição uniforme da folha de mica, e reduz o material usado na preparação de bicamada.

Preparação de Mica Apoiado Lipid Bicamadas para alta resolução Microscopia Óptica de Imagem

A preparação de bicamadas lipídicas planares com suporte de vidro funcionalizadas por proteínas, determinação da mobilidade de proteínas e medição de densidades de proteínas é mostrada aqui. Um roteiro para a construção de um microscópio de reflexão interna total com redução de ruído é delineado, o que permite visualizar fluorocromos residentes em uma única camada com alta resolução espaço-temporal.

Bicamadas única molécula de microscopia de fluorescência em Planar Apoiado

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar eventos individuais, mediada por SNARE fusão entre lipossomas e bicamadas suportados em canais microfluídicos usando TIRFM polarizada, com sensibilidade única molécula e ~ 15 resolução de tempo ms. Lipídico e liberação de cargas solúveis podem ser detectados simultaneamente. o tamanho do lipossoma, de difusividade lípido, e propriedades de fusão dos poros são medidos.

Fusão SNARE mediada por uma única proteolipossomos com Bicamadas suportados Tethered em uma célula Microfluidic fluxo monitorado por polarizada TIRF microscopia

Aqui, apresentamos um protocolo para acompanhamento de análise de imagem que permite a avaliação quantitativa dos coeficientes de difusão, tipos de tamanhos de cluster e o movimento de partículas único detectados por microscopia de fluorescência de partícula única.

Processamento de imagem protocolo para análise de difusão e o tamanho do Cluster de receptores de membrana por microscopia de fluorescência

a microscopia da localização da único-molécula 3D é utilizada para sondar as posições espaciais e as trajetórias do movimento de proteínas cDNAs etiquetadas em pilhas bacterianas vivas. O protocolo de análise experimental e de dados descrito neste documento determina os comportamentos diffusivos prevalentes de proteínas citosómicas baseadas em trajetórias unimoléculas agrupadas.

Microscopia de seguimento da único-molécula-uma ferramenta para determinar os Estados diffusive de moléculas cytosolic

Este protocolo descreve uma abordagem de processamento de imagem baseada em iSCAT e rastreamento de partículas únicas que permite a investigação simultânea da massa molecular e o comportamento difuso de macromoléculas interagindo com membranas lipídicas. Instruções passo a passo para preparação da amostra, conversão em massa para contraste, aquisição de filmes e pós-processamento são fornecidas juntamente com direções para evitar possíveis armadilhas.

Rastreamento de partículas sensíveis à massa para caracterizar dinâmicas de macromolécula associadas à membrana

A reconstituição livre de células tem sido uma ferramenta fundamental para entender a montagem do citoesqueleto, e o trabalho na última década estabeleceu abordagens para estudar a dinâmica dos septins em sistemas mínimos. Aqui apresentados estão três métodos complementares para observar a montagem de septina em diferentes contextos de membrana: bicamadas planares, suportes esféricos e suportes de hastes.

Reconstituição da Assembleia septina em membranas para estudar propriedades e funções biofísicas

Aqui, um protocolo para realizar e analisar a ligação, mobilidade e montagem de moléculas individuais em membranas lipídicas artificiais apinhadas usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total de molécula única (smTIRF) é apresentado.

Difusão e Montagem de Molécula Única em Membranas Lipídicas Repletas de Polímeros

Este protocolo descreve como usar a microscopia TIRF para rastrear canais iônicos individuais e determinar sua atividade em membranas lipídicas suportadas, definindo assim a interação entre o movimento da membrana lateral e a função do canal. Ele descreve como preparar as membranas, registrar os dados e analisar os resultados.

Imagem de molécula única da mobilidade lateral e atividade do canal iônico em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência por reflexão interna total (TIRF)

Aprenda a rastrear proteínas individuais em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência. Este método revela estados ocultos da dinâmica proteica em membranas biomiméticas.

Rastreamento de proteínas individuais em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência

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