Rastreamento de proteínas individuais em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência

As proteínas operam em um espaço de estados complexo e grande parte dele está oculta. Usamos imagem de molécula única para revelar esses estados. Ao rastrear proteínas de membrana simples em uma bicamada lipídica, os principais desafios são preparação da amostra, fotobranqueamento e resolução temporal.

Para começar, retire as soluções do caule lipídico do freezer e deixe que atinjam a temperatura ambiente. Tire um frasco limpo de 10 mililitros do forno e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Adicione 900 microlitros de clorofórmio grau espectroscópico e 100 microlitros de metanol grau espectroscópico ao frasco de fundo redondo resfriado.

Depois, adicione as quantidades apropriadas de cada lipídio ao frasco e faça girar para misturar bem. Agora coloque um conector de destilação a vácuo em cima do frasco redondo inferior e conecte-o à linha de secagem de nitrogênio. Depois, ligue o gás nitrogênio e ajuste a pressão até que o fluxo seja sentido apenas no dorso da mão.

Pipete um mililitro de tampão para cada cinco microrganismos de lipídio total no cantil de fundo redondo. Coloque uma rolha de vidro no frasco e o selee com filme de parafina. Posicione o frasco e uma gramposa em um suporte de anel e submerga sua base em um banho sonicador a 60 graus Celsius.

Confirme que a solução fica opaca e que nenhum lipídio permanece preso à parede interna do frasco. Após a incubação de uma hora, ligue o sonicador e ajuste a amplitude para o nível máximo. Mova o frasco dentro da banheira para localizar o ponto com a maior agitação onde a solução visivelmente bate e espirra dentro do cantil.

Sonice a solução por 30 minutos. Observando a transição do opaco para o transparente e levemente opalescente. Remova a solução lipídica do frasco e transfira-a para um tubo microcentrífuga.

Centrifuge o tubo a 100.000 G por uma hora a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, remova e transfira o sobrenadante para um novo tubo de centrífuga. Coloque a cobertura de quartzo de 25 milímetros em um béquer e adicione volumes iguais de água nanopura, 30% de peróxido de hidrogênio e ácido nítrico concentrado.

Aqueça a tampa deslizando na solução preparada por 30 minutos até começar a borbulhar. Verifique a solução a cada 10 minutos e faça um giro suave para evitar que a capa escorregue junta. Observe a tampa deslizando e se separando durante o redemoinho.

Uma vez separados, reduza gradualmente a velocidade de redemoinho para manter a separação e permita que a solução borbulhante cubra a tampa deslize uniformemente. Depois, enxágue a tampa cuidadosamente com água purificada enquanto gira suavemente para remover todos os resíduos químicos. Alternativamente, limpe as lâminas de cobertura de quartzo usando n-hexano seguido de metanol, limpando com papel de lente para cada solvente.

Coloque as tampas dentro de um limpador UV de ozônio, com a superfície a ser tratada voltada para a lâmpada. Deixe o oxigênio entrar na câmara a cinco libras por polegada quadrada por cinco minutos. Depois, desligue o fluxo de oxigênio.

Agora acenda as luzes ultravioletas por 15 minutos e depois deixe as tampas deslizarem por pelo menos 10 minutos para permitir que o ozônio se dissipe. Coloque uma capa recém-limpa em um suporte de amostra de 25 milímetros. Usando um tubo SM de um quarto de polegada e uma única lente, corte uma junta de filme par de oito milímetros de diâmetro e dupla camada de diâmetro e posicione-a no centro do suporte da amostra.

Aplique uma gota de 50 microlitros das pequenas vesículas Unilamelares no centro da junta de oito milímetros. Após selar a câmara, incube a 37 graus Celsius por uma hora. Após a incubação, use uma pipeta para enxaguar a solução.

Adicione 50 microlitros de novo buffer à bicamada e repita esse processo um total de 10 vezes. Após o enxágue final, remova o tampão do suporte da amostra. Adicione uma alíquota de 50 microlitros da proteína desejada no detergente, garantindo que a concentração esteja igual ou abaixo da concentração crítica de micella.

Incube a amostra a 37 graus Celsius por pelo menos uma hora para permitir a incorporação de proteínas, enxágue a amostra com um tampão para remover qualquer proteína e detergente não incorporados. Ajuste a velocidade vertical de deslocamento de pixels para aproximadamente 600 nanossegundos e aumente a tensão de clock vertical usando o modo de overclock. Depois, configure a leitura horizontal de pixels para sua velocidade máxima.

Ajuste o ganho do pré-amplificador para dois. Ajuste a saída do amplificador para multiplicação de elétrons e ajuste o ganho do multiplicador de elétrons para seu nível máximo. Depois, defina o tempo de exposição para 25 milissegundos.

Confirme que a taxa de quadros real excede um pouco o tempo de exposição. Agora ajuste a potência do laser até que o sinal se destaque claramente do ruído de fundo. Colete dados de imagem suficientes para obter no mínimo 1000 trilhas por amostra.

Para análise de rastreamento, corte todos os conjuntos de dados para um tamanho consistente e realize correção de fundo usando o Image J.In Fiji, arraste e solte o vídeo ou empilhe o arquivo TIFF que precisa ser analisado na interface. Para inserir os detalhes da calibração de pixels, vá até a aba de analisar, selecione definir escala e aplique a calibração de pixel a distância específica para o instrumento. Depois, salve uma cópia do conjunto de dados para preservar o original e acompanhar quaisquer alterações feitas.

Subtraia o fundo de uma região selecionada de interesse e aplique à cópia salva dos dados originais. Vá até a aba de processo e escolha subtrair fundo. Na aba de plugins, selecione tracking, seguido de trackmate para abrir a janela de diálogo trackmate para análise de rastreamento.

O grau de marcação para quatro tetrameros AQP foi calculado em 4,12 usando espectrometria UV visível, e a análise de distribuição de Poisson indicou que 98% dos tetrameros carregavam pelo menos uma molécula de corante fluorescente. O histograma mostra uma ampla distribuição de tamanhos de passos consistente com a difusão de arranjos ortogonais de partículas de tamanhos diferentes, e o coeficiente médio de difusão calculado foi de 0,0143 micrômetros quadrados por segundo. Neste vídeo, identificamos estados-chave importantes para a regulação da aquaporina quatro e suas forças termodinâmicas associadas.

Esse protocolo elimina a dúvida na criação de membranas biomiméticas com proteínas transmembranares purificadas, adequadas para o rastreamento de moléculas únicas em lapso de tempo. Máquinas de proteína operadas em pontos de inflexão, o rastreamento de uma única proteína em lapso de tempo permite a observação direta de vias estocásticas, ramificações e becos sem saída.