Буферов

Источник: Смаа Корайм из Университета Джонса Хопкинса, доктор медицины, США

1. Подготовка 50 мМ₂PO₄ Buffer, pH 7Expand

   В первой части этого эксперимента вы приготовите раствор фосфата натрия, буферизованный при pH 7,0. Мононатрийфосфат – слабая кислота с конъюгированным основанием, динатрийфосфатом. Неотрегулированные растворы мононатрийфосфата обычно имеют pH около 4 - 6.

   Буферы наиболее эффективны вблизи их pKa, который составляет от 6,8 до 7,2 для мононатрийфосфата. Таким образом, вы будете использовать NaOH для подталкивания равновесия к сопряженному основанию, не изменяя общий состав буферного равновесия.

   • Перед началом эксперимента рассчитайте массу мононатрийфосфата, которую вам понадобится, чтобы сделать 200 мл 50 мл раствора.

     Таблица 1: Приготовление 50 мМ буфера₂PO₄, pH 7,0

     Молярная масса2PO4 = 119,98 г/моль
     Объем раствора (мл)	200
     Молярность (мМ)	50
     Родинки2PO4 (моль)
     Необходимая масса (мг)
     Начальный объем 1 М NaOH (мл)
     Итоговый объем 1 М NaOH (мл)
     Объем используемого NaOH (мл)
     Объем необходимой воды DI (мл)

     Нажмите здесь, чтобы скачать таблицу 1
   • Для начала наденьте необходимые средства индивидуальной защиты, включая лабораторный халат, защитные очки с защитой от брызг и перчатки. заметка: В этой части лаборатории используется NaOH, который является коррозионным и токсичным. Соблюдайте осторожность при заливке и транспортировке NaOH.
   • Наполните пластиковую бутылку объемом 250 мл деионизированной водой.
   • Пометьте два стакана объемом 100 мл, один для нейтральных водных отходов, а другой для основных водных отходов.
   • Откалибруйте свой pH-метр с помощью предоставленных буферов. Сохраните зонд в своем хранилище, когда закончите.
   • Сдайте бумагу для взвешивания и используйте чистый шпатель, чтобы отмерить необходимое количество мононатрийфосфата в соответствии с вашими расчетами. Запишите точное количество мононатрийфосфата в свой лабораторный блокнот. заметка: Мононатрийфосфат поглощает влагу из воздуха, поэтому работайте быстро, чтобы получить точное измерение, и плотно закройте контейнер, когда закончите с ним.
   • Поместите мононатрийфосфат в стакан объемом 400 мл и очистите шпатель лабораторной салфеткой. Выбросьте бумагу для взвешивания и салфетку, прежде чем вернуться в вытяжной шкаф.
   • Используйте градуированный цилиндр, чтобы отмерить 175 мл деионизированной воды. Налейте в стакан воду с мононатрийфосфатом и добавьте магнитную мешалку.
   • Перемешивайте раствор до тех пор, пока соль полностью не растворится и раствор не станет однородным. Обычно это занимает 2 - 3 минуты.
   • Отмерьте 15 мл деионизированной воды и налейте ее в стакан. Продолжайте помешивать раствор до тех пор, пока он снова не станет однородным (около 1-2 минут). Выключите мотор мешалки.
   • Промойте pH-зонд деионизированной водой, а затем зажмите его в растворе с помощью датчика над мешалкой.
   • Поднесите градуированный цилиндр объемом 10 мл и стекло часов к вытяжке и отмерьте 10 мл 1 М NaOH. Обратите внимание на точный объем в градуированном цилиндре.
   • Накройте NaOH стеклом часов и осторожно поднесите его к вытяжному шкафу.
   • Возобновите перемешивание раствора мононатрийфосфата. Контролируя показания pH, с помощью одноразовой пипетки медленно добавляйте NaOH в раствор для перемешивания по каплям. Как только pH буфера достигнет 7,0, верните весь NaOH, оставшийся в пипетке, в градуированный цилиндр.
   • Рассчитайте объем NaOH, который вы добавили в буфер. Вычтите этот объем из 10 мл, чтобы определить, сколько деионизированной воды вы должны добавить в буфер, чтобы получить общий объем раствора в 200 мл.
   • Измерьте деионизированную воду с помощью другого мерного цилиндра объемом 10 мл и добавьте его в раствор для перемешивания, чтобы закончить создание буфера.
   • Промойте датчик pH деионизированной водой, накройте его крышкой, наполненной раствором для хранения, и отключите или выключите зонд.
   • Пометьте полиэтиленовую бутылку объемом 250 мл как '50 mM monosodium phosphate buffer, pH 7.0'. Извлеките магнитную мешалку из раствора.
   • Используйте воронку, чтобы налить буферный раствор в бутылку с этикеткой и плотно закрыть ее.
2. Абсорбционная спектроскопия свободного и связанного нейтрального красного цвета<кнопка class="expand">Expand

   Буферы могут использоваться для оценки соединений при определенных значениях pH. В этом разделе вы будете записывать спектр поглощения индикатора нейтральным красным цветом в различных буферах. Протонированная форма нейтрального красного цвета — красная, а депротонированная — желто-оранжевая, что означает, что они поглощают зеленый и сине-фиолетовый свет соответственно. Таким образом, кислотная и основная формы имеют различные длины волн поглощения. Связывание с белками изменяет свойства нейтрального красного цвета, изменяя как его абсорбцию, так и pKa.

   После измерения спектра поглощения свободного нейтрального красного цвета при нескольких значениях pH вы добавляете в растворы рибофлавин-связывающий белок, или RP, и снова измеряете абсорбцию. Интенсивность поглощения связана с концентрацией, поэтому вы будете использовать спектры для определения pKa свободного и связанного нейтрального красного цвета после лабораторных работ.

   • Нарисуй следующую таблицу в своем лабораторном блокноте. Пронумеруйте кюветы от 1 до 10 и перечислите девять значений pH буфера, которые вы будете использовать. 10-я кювета будет представлять собой деионизированную водную заготовку. заметка: Всегда держите кюветы за текстурированные стороны и протирайте прозрачные стороны непосредственно перед тем, как поместить кювету в спектрофотометр. Не забудьте выровнять прозрачные стороны с лучом света в спектрофотометре.

     Таблица 2: Поглощение свободного и связанного нейтрального красного цвета

     Кювета #	Буферный pH	Abs. at λmax (Free NRH+)	Abs. at λmax (Bound NRH)
     1	5.0
     2	5.5
     3	6.0
     4	6.5
     5	7.0
     6	7.5
     7	8.0
     8	8.5
     9	11
     10	blank

     Нажмите здесь, чтобы скачать таблицу 2
   • Возьмите десять кювет и колпачков объемом 1,5 мл и обозначьте колпачки от 1 до 10, чтобы они соответствовали таблице в вашем лабораторном блокноте.
   • Пометьте стакан объемом 25 мл как 'DIH2O' и наполните его деионизированной водой.
   • Слейте нейтральные водные отходы в канализацию и перемаркируйте стакан как "водные буферные отходы".
   • Пометьте стакан объемом 400 мл для использованных наконечников для микропипеток.
   • Прикрепите наконечник к микропипетке объемом 1 мл и используйте его для дозирования 1000 мкл деионизированной воды в кювету 10. Это ваша заготовка для растворителя.
   • Поместите 925 μл буфера мононатрийфосфата pH 7.0 в кювету 5.
   • Перенесите оставшиеся пустые кюветы в буферную таблицу. Следуя таблице в лабораторном блокноте, распределите 925 мкл каждого буфера в соответствующую кювету с помощью маркированных микропипеток. Будьте осторожны и не используйте один и тот же наконечник для дозатора для разных буферов.
   • Как только вы закончите, верните буферы обратно на свой рабочий стол. Там установите микропипетку объемом 200 мкл для дозирования 75 мкл и прикрепите наконечник к микропипетке.
   • Нанесите 75 μL нейтрального красного в каждую из девяти буферных кювет. Переверните каждую кювету несколько раз, чтобы тщательно перемешать растворы. заметка: Замените наконечник пипетки, если он соприкасается с буфером.
   • После того как вы смешали нейтральный красный цвет с каждым буфером, сделайте снимок или запишите цвета растворов.
   • Включите ручной спектрофотометр и дайте источнику света нагреться. Как только он будет готов, создайте новый эксперимент для измерения зависимости поглощения от длины волны для свободного нейтрального красного цвета.
   • Вставьте кювету с деионизированной водой и получите спектр деионизированной воды. Установите его в качестве сольвентного фона или заготовки.
   • Затем удалите заготовку и вставьте кювету нейтрального красного цвета в буфер с самым низким pH, который будет иметь самую высокую концентрацию протонированного нейтрального красного.
   • Получите спектр, который должен показать один сильный пик. Определите длину волны, соответствующую самой высокой точке этого пика, или максимуму. Запишите эту длину волны в лабораторный блокнот как lambda max для протонированного свободного нейтрального красного цвета.
   • Сохраните данные и удалите кювету. Запишите поглощение в блокнот, затем соберите спектры для кювет 2 - 9, используя ту же процедуру.
   • Запишите длину волны изобестической точки в свой лабораторный блокнот. Именно здесь все спектры пересекаются на одной длине волны. Если в этой точке спектр не пересекается, опорожните и очистите кювету, приготовьте новый образец и повторите попытку.
   • Как только вы закончите собирать спектры для всех девяти кювет, сохраните и экспортируйте данные.
   • Создайте новый эксперимент для измерения зависимости поглощения от длины волны для ограниченного нейтрального красного.
   • Установите новый наконечник на микропипетку объемом 200 мкл и добавьте 75 мкл раствора рибофлавин-связывающего белка в каждую кювету, включая бланк. Извлеките наконечник, закрепите крышки кюветы и несколько раз переверните кювету, чтобы перемешать растворы.
   • Вставьте кювету 10 в спектрофотометр и установите ее в качестве заготовки для растворителя.
   • Получите спектр образца с самым низким pH и определите длину волны, соответствующую максимуму самого интенсивного пика. Запишите его в лабораторный блокнот как лямбда-максимум нейтрального красного цвета, связанного с протонированием.
   • Получите спектры для кювет 2 - 9 так же, как вы делали это для бесплатных нейтральных красных образцов. Запишите интенсивности в максимальной точке лямбда для протонированного нейтрального красного цвета в таблице, а также длину волны в изобестической точке.
   • Когда вы закончите, сохраните свои данные, экспортируйте их для последующего анализа и выключите спектрофотометр.
   • Уберите все оборудование и выбросьте использованные наконечники для пипеток в утвержденный контейнер для отходов или мусорное ведро.
   • Вылейте кюветы в стакан для отходов водного буфера и промойте кюветы в стакане деионизированной водой.
   • Вылейте излишки NaOH в основные отходы и промойте градуированный цилиндр водой.
   • Смойте основные водные отходы в канализацию обильной водой из-под крана, вместе с другими водными отходами.
   • Мойте стеклянную посуду, крышки кювет и мешалку в соответствии со стандартными процедурами вашей лаборатории. Протрите рабочие поверхности влажным бумажным полотенцем и выбросьте использованные бумажные полотенца и лабораторные салфетки в мусорное ведро.
3. ResultsExpand

   Теперь давайте проанализируем наши данные об поглощении, чтобы определить pKa нейтрального красного цвета.

   Таблица 3: Определение нейтральных красных pKa

   	Бесплатный NRH+	Связанный NRH+
   λmax (нм)
   ΔA (нм)
   Средняя точка (нм)
   pKa

   Нажмите здесь, чтобы скачать таблицу 3

   • Отобразите оба набора данных интенсивности с интенсивностью поглощения на уровне лямбда макс по оси y и pH по оси x, при этом точки будут соединены плавными линиями.
   • Рассчитайте разницу между начальной и конечной интенсивностями поглощения для каждого ряда данных.
   • Определите поглощение посередине между начальным и конечным поглощениями для каждого ряда, или средние точки поглощения.
   • Найдите, где находится средняя точка на каждой линии, и определите значение pH в этой точке. Эти значения pH представляют собой pKa свободного и связанного нейтрального красного цвета.
   • Здесь мы видим увеличение pKa примерно на единицу между свободным и связанным нейтральным красным, указывая на то, что связанный протонированный нейтральный красный на порядок слабее, чем свободный протонированный нейтральный красный.