Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Источник: Смаа Корайм из Университета Джонса Хопкинса, доктор медицины, США
В первой части этого эксперимента вы приготовите раствор фосфата натрия, буферизованный при pH 7,0. Мононатрийфосфат – слабая кислота с конъюгированным основанием, динатрийфосфатом. Неотрегулированные растворы мононатрийфосфата обычно имеют pH около 4 - 6.
Буферы наиболее эффективны вблизи их pKa, который составляет от 6,8 до 7,2 для мононатрийфосфата. Таким образом, вы будете использовать NaOH для подталкивания равновесия к сопряженному основанию, не изменяя общий состав буферного равновесия.
| Молярная масса2PO4 = 119,98 г/моль | |
| Объем раствора (мл) | 200 |
| Молярность (мМ) | 50 |
| Родинки2PO4 (моль) | |
| Необходимая масса (мг) | |
| Начальный объем 1 М NaOH (мл) | |
| Итоговый объем 1 М NaOH (мл) | |
| Объем используемого NaOH (мл) | |
| Объем необходимой воды DI (мл) | |
Буферы могут использоваться для оценки соединений при определенных значениях pH. В этом разделе вы будете записывать спектр поглощения индикатора нейтральным красным цветом в различных буферах. Протонированная форма нейтрального красного цвета — красная, а депротонированная — желто-оранжевая, что означает, что они поглощают зеленый и сине-фиолетовый свет соответственно. Таким образом, кислотная и основная формы имеют различные длины волн поглощения. Связывание с белками изменяет свойства нейтрального красного цвета, изменяя как его абсорбцию, так и pKa.
После измерения спектра поглощения свободного нейтрального красного цвета при нескольких значениях pH вы добавляете в растворы рибофлавин-связывающий белок, или RP, и снова измеряете абсорбцию. Интенсивность поглощения связана с концентрацией, поэтому вы будете использовать спектры для определения pKa свободного и связанного нейтрального красного цвета после лабораторных работ.
| Кювета # | Буферный pH | Abs. at λmax (Free NRH+) | Abs. at λmax (Bound NRH) |
| 1 | 5.0 | ||
| 2 | 5.5 | ||
| 3 | 6.0 | ||
| 4 | 6.5 | ||
| 5 | 7.0 | ||
| 6 | 7.5 | ||
| 7 | 8.0 | ||
| 8 | 8.5 | ||
| 9 | 11 | ||
| 10 | blank |
Теперь давайте проанализируем наши данные об поглощении, чтобы определить pKa нейтрального красного цвета.
| Бесплатный NRH+ | Связанный NRH+ | |
| λmax (нм) | ||
| ΔA (нм) | ||
| Средняя точка (нм) | ||
| pKa |
Нажмите здесь, чтобы скачать таблицу 3
В первой части этого эксперимента вы приготовите раствор фосфата натрия, буферизованный при pH 7,0. Мононатрийфосфат представляет собой слабую кислоту с конъюгированным основанием динатрийфосфатом. Нескорректированные растворы мононатрийфосфата обычно имеют pH от 4 до 6.
Буферы наиболее эффективны вблизи их pKa, который составляет от 6,8 до 7,2 для мононатрийфосфата. Таким образом, вы будете использовать гидроксид натрия для подталкивания равновесия к сопряженному основанию без изменения общего состава буферного равновесия. Перед началом лабораторной работы рассчитайте массу мононатрийфосфата, которую вам понадобится для изготовления 200 миллилитров 50-миллимолярного раствора.
В этой части лаборатории используется гидроксид натрия, который является коррозионным и токсичным. Соблюдайте осторожность при заливке и транспортировке гидроксида натрия. Теперь давайте начнем.
Сначала наденьте лабораторный халат, брызгозащищенные защитные очки и нитриловые перчатки. Далее наполните 250-миллилитровую пластиковую бутылку для мытья деионизированной водой. Промаркируйте два 100-миллилитровых стакана для нейтральных и основных водных отходов соответственно.
Затем откалибруйте pH-метр с помощью предоставленных буферов. Сохраните зонд в своем хранилище, когда закончите. Теперь поднесите стакан объемом 400 миллилитров к зоне аналитических весов, чтобы получить мононатрийфосфат, который вам понадобится.
Разложите лист бумаги для взвешивания и чистым шпателем отмерьте необходимое количество мононатрийфосфата в соответствии с вашими расчетами. Мононатрийфосфат поглощает влагу из воздуха, поэтому работайте быстро, чтобы получить точное измерение, и плотно закройте контейнер, когда закончите с ним. Запишите точное количество мононатрийфосфата, которое вы измеряете, в лабораторном блокноте.
Затем поместите мононатрийфосфат в стакан и очистите шпатель лабораторной салфеткой. Выбросьте бумагу для взвешивания и салфетку, прежде чем вернуться в вытяжной шкаф. Теперь используйте градуированный цилиндр, чтобы отмерить 175 миллилитров деионизированной воды.
Налейте в стакан воду с мононатрийфосфатом и добавьте магнитную мешалку. Размешайте раствор на мешалке до тех пор, пока соль полностью не растворится и раствор не станет однородным. Обычно это занимает две-три минуты.
Затем отмерьте 15 миллилитров деионизированной воды с помощью градуированного цилиндра. Налейте деионизированную воду в стакан и продолжайте помешивать раствор, пока он снова не станет однородным, что обычно занимает одну-две минуты. Затем выключите мотор мешалки.
Промойте pH-зонд деионизированной водой, а затем зажмите его в растворе с помощью датчика над мешалкой. Теперь поднесите 10-миллилитровый градуированный цилиндр и часовое стекло к вытяжке и отмерьте 10 миллилитров 1 молярного гидроксида натрия. Накройте гидроксид натрия стеклом часов и осторожно поднесите его к вытяжному шкафу.
Обратите внимание на точный объем в градуированном цилиндре. Затем возобновите помешивание раствора мононатрийфосфата. Контролируя показания pH, с помощью одноразовой пипетки медленно добавляйте гидроксид натрия в раствор для перемешивания по каплям.
Как только pH буфера достигнет 7,0, верните весь гидроксид натрия, оставшийся в пипетке, в градуированный цилиндр. Затем рассчитайте объем гидроксида натрия, который вы добавили из начального и конечного объемов в градуированном цилиндре. Вычтите этот объем из 10 миллилитров, чтобы определить, сколько деионизированной воды вы должны добавить в буфер, чтобы получить общий объем раствора в 200 миллилитров.
Отмерьте необходимую вам деионизированную воду с помощью другого 10-миллилитрового мерного цилиндра и добавьте ее в раствор для перемешивания, чтобы завершить изготовление буфера. Промойте датчик pH деионизированной водой, накройте его крышкой, наполненной раствором для хранения, и отключите или выключите зонд. После этого пометьте 250-миллилитровую полиэтиленовую бутылку как 50 миллимолярный буфер мононатрийфосфата, pH 7,0. Используйте щипцы для извлечения магнитной мешалки из раствора.
Затем поместите воронку в горлышко бутылки и налейте буферный раствор в бутылку. Снимите воронку, и плотно закройте бутылку крышкой. Теперь вы готовы перейти к разделу абсорбционной спектроскопии.
Буферы могут использоваться для оценки соединений при определенных значениях pH. В этом разделе вы будете записывать спектр поглощения индикатора нейтральным красным цветом в различных буферах. Протонированная форма нейтрального красного цвета — красная, а депротонированная — желто-оранжевая, что означает, что они поглощают зеленый и сине-фиолетовый свет соответственно.
Таким образом, кислотная и основная формы имеют различные длины волн поглощения. Связывание с белками изменяет свойства нейтрального красного цвета, изменяя как его абсорбцию, так и pKa. После измерения спектра поглощения свободного нейтрального красного цвета при нескольких значениях pH вы добавляете в растворы рибофлавин-связывающий белок, или RP, и снова измеряете абсорбцию.
Интенсивность поглощения связана с концентрацией, поэтому вы будете использовать спектры для определения pKa свободного и связанного нейтрального красного цвета после лабораторных работ. Прежде чем приступить к работе над этим разделом, нарисуйте таблицу в лабораторном блокноте, в которой будут указаны число кювет, pH буфера, поглощение на уровне лямбда max для свободного протонированного нейтрального красного цвета и поглощение на уровне lambda max для связанного протонированного нейтрального красного цвета. Пронумеруйте кюветы от 1 до 10 и перечислите девять значений pH буфера, которые вы будете использовать.
10-я кювета будет представлять собой деионизированную водную заготовку. Всегда держите кюветы за текстурированные стороны и протирайте прозрачные стороны непосредственно перед тем, как поместить кювету в спектрофотометр. Не забудьте выровнять прозрачные стороны с лучом света в спектрофотометре.
Теперь давайте начнем. Приобретите десять кювет и крышек объемом 1,5 миллилитров и промаркируйте крышки от 1 до 10 в соответствии с таблицей в лабораторном блокноте. Пометьте стакан объемом 25 миллилитров как DIH2O' и наполните его деионизированной водой.
Затем смойте нейтральные водные отходы в канализацию и перемаркируйте стакан как водные буферные отходы»Кроме того, пометьте стакан объемом 400 миллилитров для использованных наконечников для микропипеток. Затем прикрепите наконечник к микропипетке объемом 1 миллилитр и используйте его, чтобы дозировать 1000 микролитров деионизированной воды в кювету 10. Это будет ваша заготовка для растворителя.
Теперь извлеките наконечник, установите микропипетку на дозирование 925 микролитров и прикрепите новый наконечник. Поместите 925 микролитров буфера мононатрийфосфата pH 7,0 в кювету номер пять. Извлеките кончик и закройте крышку кюветы.
Далее вынесите оставшиеся пустые кюветы на буферный стол. Следуя таблице в лабораторном блокноте, распределите 925 микролитров каждого буфера в соответствующую кювету с помощью помеченных микропипеток. Будьте осторожны и не используйте один и тот же наконечник для дозатора для разных буферов.
Когда вы закончите, верните буферы обратно на верстак. Там установите микропипетку объемом 200 микролитров для дозирования 75 микролитров и прикрепите наконечник к микропипетке. Теперь приобретите флакон или тюбик с нейтральным красным раствором, которым можно поделиться с другой студенческой группой.
Нанесите по 75 микролитров нейтрального красного в каждую из девяти буферных кювет. Замените наконечник пипетки, если он соприкасается с буфером. По завершении извлеките наконечник пипетки и закройте крышки кювет.
Теперь переверните каждую кювету несколько раз, чтобы тщательно перемешать растворы. После того, как вы смешали нейтральный красный цвет с каждым буфером, сделайте снимок или запишите цвета растворов. Далее включите ручной спектрофотометр и дождитесь прогрева источника света.
Как только он будет готов, создайте новый эксперимент для измерения зависимости поглощения от длины волны для свободного нейтрального красного цвета. Затем вставьте кювету с деионизированной водой. Получите спектр деионизированной воды и установите его в качестве растворителя фона или заглушки.
Затем извлеките заготовку из спектрофотометра и вставьте кювету нейтрального красного цвета в буфер с самым низким pH, который будет иметь наибольшую концентрацию протонированного нейтрального красного. Приобретите спектр, который должен показать один сильный пик. Определите длину волны, соответствующую самой высокой точке этого пика, или максимуму.
Запишите эту длину волны в лабораторный блокнот как lambda max для протонированного свободного нейтрального красного цвета. Сохраните данные и извлеките кювету. Запишите поглощение в блокнот, а затем соберите спектры для кювет со 2 по 9, используя ту же процедуру.
Все спектры должны пересекаться в одной точке, называемой изобестической точкой. Запишите длину волны этой точки в лабораторный блокнот. Если в этой точке спектр не пересекается, опорожните и очистите кювету, приготовьте новый образец и повторите попытку.
После того, как вы закончите сбор спектров для всех 9 кювет, сохраните и экспортируйте данные. Затем создайте новый эксперимент для измерения зависимости поглощения от длины волны для связанного нейтрального красного цвета. Установите новый наконечник на микропипетку объемом 200 микролитров и получите общий контейнер с рибофлавин-связывающим белком.
Добавьте 75 микролитров раствора рибофлавин-связывающего белка в каждую кювету, включая заготовку. Извлеките наконечник, закрепите крышки кюветы и несколько раз переверните кювету, чтобы перемешать растворы. Теперь вставьте кювету 10 в спектрофотометр и установите ее в качестве заготовки растворителя.
Затем получите спектр образца с самым низким pH и определите длину волны, соответствующую максимуму самого интенсивного пика. Запишите его в лабораторный блокнот как лямбда-максимум нейтрального красного цвета, связанного с протонированием. После этого получите спектры для кювет со 2 по 9 так же, как вы делали это для бесплатных нейтральных красных образцов.
Запишите интенсивности в максимальной точке лямбда для протонированного нейтрального красного цвета в таблице, а также длину волны в изобестической точке. Когда все будет готово, сохраните данные, экспортируйте их для последующего анализа и выключите спектрофотометр. Уберите микропипетки, коробки с наконечниками, pH-метр и спектрофотометр.
Выбросьте использованные наконечники для дозатора в утвержденный контейнер для отходов или мусорное ведро. Теперь высыпьте кюветы в стакан для водных буферных отходов и промойте кюветы в стакане деионизированной водой. В вытяжном шкафу слейте излишки гидроксида натрия в основные отходы и промойте градуированный цилиндр водой.
Слейте основные водные отходы в канализацию обильным количеством водопроводной воды вместе с другими водными отходами. Мойте стеклянную посуду, крышки кювет и мешалку в соответствии со стандартными лабораторными процедурами. Наконец, очистите рабочие поверхности влажным бумажным полотенцем и выбросьте использованные бумажные полотенца и лабораторные салфетки в мусорное ведро.
Теперь давайте проанализируем наши данные об поглощении, чтобы определить pKa нейтрального красного цвета. Во-первых, нанесите оба набора данных об интенсивности поглощения с интенсивностью поглощения на уровне лямбда-макс по оси y и pH по оси x, причем точки будут соединены плавными линиями. Затем для каждого ряда данных вычислите разницу между начальной и конечной интенсивностями поглощения.
Используйте его для вычисления поглощения на полпути между начальным и конечным поглощениями для каждого ряда, или средними точками поглощения. Теперь найдите, где находится средняя точка на каждой линии, и определите значение pH в этой точке. Эти значения pH представляют собой pKa свободного и связанного нейтрального красного цвета.
Здесь мы видим увеличение pKa примерно на 1 между свободным и связанным нейтральным красным, что указывает на то, что связанный протонированный нейтральный красный на порядок слабее, чем свободный протонированный нейтральный красный.
