Why is monosodium phosphate an effective buffer near pH 7?

Monosodium phosphate is effective near pH 7 because its pKa range is 6.8 to 7.2, which overlaps with the target pH. Buffers are most effective close to their pKa, where the weak acid and conjugate base are present in significant concentrations. This allows the buffer to resist pH changes when small amounts of acid or base are added.

What is the role of NaOH when preparing a monosodium phosphate buffer?

NaOH is added drop-wise to shift the equilibrium toward the conjugate base, disodium phosphate, without altering the overall buffer composition. Unadjusted monosodium phosphate solutions typically have a pH of 4–6, so NaOH raises the pH to the target value of 7.0 while maintaining the buffer's capacity to resist pH changes.

How do the protonated and deprotonated forms of neutral red differ in color and light absorption?

The protonated form of neutral red is red and absorbs green light, while the deprotonated form is yellow-orange and absorbs blue-violet light. These distinct absorption wavelengths allow researchers to track the ionization state of neutral red across different pH values using absorption spectroscopy.

How does protein binding affect the properties of neutral red?

Protein binding alters both the absorbance and pKa of neutral red. When riboflavin-binding protein binds to neutral red, the pKa increases by approximately one unit, indicating that bound-protonated neutral red is a weaker acid than free protonated neutral red by an order of magnitude.

What is the isosbestic point in an absorption spectrum?

The isosbestic point is the wavelength where all absorption spectra cross at a single point, regardless of pH. Recording this wavelength helps verify data quality and indicates a clean transition between the protonated and deprotonated forms of neutral red across the pH range tested.

How do you determine the pKa of neutral red from absorbance data?

Plot absorbance intensity at lambda max versus pH for both free and bound neutral red. Calculate the midpoint between the highest and lowest absorbance values, then find the pH at which this midpoint occurs on the plotted line. That pH value is the pKa of the compound.

Why is it important to handle cuvettes correctly during spectrophotometry?

Cuvettes must be held by their textured sides and have transparent sides wiped clean before measurement to ensure accurate absorbance readings. The transparent sides must align with the spectrophotometer's light beam. Proper handling prevents fingerprints and contamination that would interfere with light transmission and distort results.

Буферов

Концепции Подготовка преподавателя Протокол студента

0 просмотров04:35 мин

Буферные растворы — это растворы, которые работают на поддержание постоянного pH в системе независимо от добавления сильных кислот или оснований. При отсутствии буферов добавление в раствор сильной кислоты или основания существенно изменяет рН. Буферы имеют решающее значение в повседневной жизни. Например, кровь действует как буфер и способна поддерживать pH в диапазоне от 7,35 до 7,45, поскольку pH выше 7,8 или ниже 6,8 может привести к смерти.

Итак, как работает буфер? Буфер — это, по сути, слабая кислота или основание и его сопряженное основание или кислота, находящиеся в равновесии друг с другом. Возьмем, к примеру, буфер из уксусной кислоты и ацетата натрия. Буферный раствор содержит слабую кислоту и ее сопряженную соль, которая диссоциирует с образованием ацетата сопряженного основания. Раствор является кислым, потому что K_a уксусной кислоты выше, чем K_b сопряженного основания.

Помните, что константа диссоциации, K_a или K_b, определяет силу кислоты или основания, соответственно, так как это константа равновесия для диссоциации соединения в воде. Константа диссоциации также может быть представлена в виде pK_a, или отрицательного логарифма K_a, где чем меньше pK_a, тем сильнее кислота. То же самое следует и для pK_b, где чем меньше pK_b, тем прочнее основание.

Возвращаясь к ацетатному буферу, если мы добавим сильное основание, такое как гидроксид натрия, ионы гидроксида вступят в реакцию с ионами гидроксония, присутствующими в растворе. Это приводит к тому, что большее количество уксусной кислоты вступает в реакцию с водой, чтобы вернуться к равновесию, тем самым образуя больше ионов гидроксония. Если мы добавим сильную кислоту, например, соляную кислоту, в растворе образуется больше ионов гидроксония. Эти ионы вступают в реакцию с ионами ацетата, образуя больше уксусной кислоты. В обоих случаях рН раствора изменяется очень незначительно.

Имейте в виду, что каждый буфер имеет определенный диапазон pH, в котором он может буферизировать раствор. Здесь мы показываем кривую титрования для буфера уксусной кислоты. Диапазон буферизации будет выделен. Эта область определяется уравнением Хендерсона-Хассельбальха, которое говорит нам, что pH буфера определяется K_a слабой кислоты и отношением сопряженного основания к слабой кислоте.

Вдали от этого рН слабая кислота или основание буфера истощается, и он не может буферизовать рН. Таким образом, при выборе буфера для вашего приложения выбирайте тот, pK_a которого близок к желаемому pH.

Наконец, у всех буферов есть предел их буферной способности, то есть количество кислоты или основания, которое может быть добавлено в буферный раствор до того, как pH значительно изменится. Например, если мы добавим слишком много кислоты в буферный раствор уксусной кислоты и ацетата натрия, мы протонируем все ионы ацетата и накопим много ионов гидроксония, тем самым снизив pH.

Точно так же, если мы добавим слишком много основания, мы депротонируем всю уксусную кислоту и накопим много гидроксид-ионов, тем самым увеличивая pH. Таким образом, на буферную способность влияет концентрация слабой кислоты и сопряженной соли. Таким образом, 1-молярный ацетатный буфер обладает более высокой буферной способностью, чем 0,1-молярный ацетатный буфер.

В этой лаборатории вы будете готовить и исследовать буферы с широким диапазоном pH. Затем вы будете использовать буферы для определения_{pK a} индикатора pH, называемого нейтральным красным, и исследуете изменение pK_a нейтрального красного при введении белка, связывающего рибофлавин.

Print Procedure Steps

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Смаа Корайм из Университета Джонса Хопкинса, доктор медицины, США

Подготовка 50 мМ₂PO₄ Buffer, pH 7

В первой части этого эксперимента вы приготовите раствор фосфата натрия, буферизованный при pH 7,0. Мононатрийфосфат – слабая кислота с конъюгированным основанием, динатрийфосфатом. Неотрегулированные растворы мононатрийфосфата обычно имеют pH около 4 - 6.

Буферы наиболее эффективны вблизи их pKa, который составляет от 6,8 до 7,2 для мононатрийфосфата. Таким образом, вы будете использовать NaOH для подталкивания равновесия к сопряженному основанию, не изменяя общий состав буферного равновесия.

Перед началом эксперимента рассчитайте массу мононатрийфосфата, которую вам понадобится, чтобы сделать 200 мл 50 мл раствора.

Таблица 1: Приготовление 50 мМ буфера₂PO₄, pH 7,0

Молярная масса₂PO₄ = 119,98 г/моль
Объем раствора (мл)	200
Молярность (мМ)	50
Родинки₂PO₄ (моль)
Необходимая масса (мг)
Начальный объем 1 М NaOH (мл)
Итоговый объем 1 М NaOH (мл)
Объем используемого NaOH (мл)
Объем необходимой воды DI (мл)

Нажмите здесь, чтобы скачать таблицу 1

Для начала наденьте необходимые средства индивидуальной защиты, включая лабораторный халат, защитные очки с защитой от брызг и перчатки. заметка: В этой части лаборатории используется NaOH, который является коррозионным и токсичным. Соблюдайте осторожность при заливке и транспортировке NaOH.
Наполните пластиковую бутылку объемом 250 мл деионизированной водой.
Пометьте два стакана объемом 100 мл, один для нейтральных водных отходов, а другой для основных водных отходов.
Откалибруйте свой pH-метр с помощью предоставленных буферов. Сохраните зонд в своем хранилище, когда закончите.
Сдайте бумагу для взвешивания и используйте чистый шпатель, чтобы отмерить необходимое количество мононатрийфосфата в соответствии с вашими расчетами. Запишите точное количество мононатрийфосфата в свой лабораторный блокнот. заметка: Мононатрийфосфат поглощает влагу из воздуха, поэтому работайте быстро, чтобы получить точное измерение, и плотно закройте контейнер, когда закончите с ним.
Поместите мононатрийфосфат в стакан объемом 400 мл и очистите шпатель лабораторной салфеткой. Выбросьте бумагу для взвешивания и салфетку, прежде чем вернуться в вытяжной шкаф.
Используйте градуированный цилиндр, чтобы отмерить 175 мл деионизированной воды. Налейте в стакан воду с мононатрийфосфатом и добавьте магнитную мешалку.
Перемешивайте раствор до тех пор, пока соль полностью не растворится и раствор не станет однородным. Обычно это занимает 2 - 3 минуты.
Отмерьте 15 мл деионизированной воды и налейте ее в стакан. Продолжайте помешивать раствор до тех пор, пока он снова не станет однородным (около 1-2 минут). Выключите мотор мешалки.
Промойте pH-зонд деионизированной водой, а затем зажмите его в растворе с помощью датчика над мешалкой.
Поднесите градуированный цилиндр объемом 10 мл и стекло часов к вытяжке и отмерьте 10 мл 1 М NaOH. Обратите внимание на точный объем в градуированном цилиндре.
Накройте NaOH стеклом часов и осторожно поднесите его к вытяжному шкафу.
Возобновите перемешивание раствора мононатрийфосфата. Контролируя показания pH, с помощью одноразовой пипетки медленно добавляйте NaOH в раствор для перемешивания по каплям. Как только pH буфера достигнет 7,0, верните весь NaOH, оставшийся в пипетке, в градуированный цилиндр.
Рассчитайте объем NaOH, который вы добавили в буфер. Вычтите этот объем из 10 мл, чтобы определить, сколько деионизированной воды вы должны добавить в буфер, чтобы получить общий объем раствора в 200 мл.
Измерьте деионизированную воду с помощью другого мерного цилиндра объемом 10 мл и добавьте его в раствор для перемешивания, чтобы закончить создание буфера.
Промойте датчик pH деионизированной водой, накройте его крышкой, наполненной раствором для хранения, и отключите или выключите зонд.
Пометьте полиэтиленовую бутылку объемом 250 мл как '50 mM monosodium phosphate buffer, pH 7.0'. Извлеките магнитную мешалку из раствора.
Используйте воронку, чтобы налить буферный раствор в бутылку с этикеткой и плотно закрыть ее.

Абсорбционная спектроскопия свободного и связанного нейтрального красного цвета<кнопка class="expand">Expand
Буферы могут использоваться для оценки соединений при определенных значениях pH. В этом разделе вы будете записывать спектр поглощения индикатора нейтральным красным цветом в различных буферах. Протонированная форма нейтрального красного цвета — красная, а депротонированная — желто-оранжевая, что означает, что они поглощают зеленый и сине-фиолетовый свет соответственно. Таким образом, кислотная и основная формы имеют различные длины волн поглощения. Связывание с белками изменяет свойства нейтрального красного цвета, изменяя как его абсорбцию, так и pKa.

После измерения спектра поглощения свободного нейтрального красного цвета при нескольких значениях pH вы добавляете в растворы рибофлавин-связывающий белок, или RP, и снова измеряете абсорбцию. Интенсивность поглощения связана с концентрацией, поэтому вы будете использовать спектры для определения pKa свободного и связанного нейтрального красного цвета после лабораторных работ.
- Нарисуй следующую таблицу в своем лабораторном блокноте. Пронумеруйте кюветы от 1 до 10 и перечислите девять значений pH буфера, которые вы будете использовать. 10-я кювета будет представлять собой деионизированную водную заготовку. заметка: Всегда держите кюветы за текстурированные стороны и протирайте прозрачные стороны непосредственно перед тем, как поместить кювету в спектрофотометр. Не забудьте выровнять прозрачные стороны с лучом света в спектрофотометре.
  Таблица 2: Поглощение свободного и связанного нейтрального красного цвета
  
  Кювета # Буферный pH Abs. at λ_max(Free NRH⁺) Abs. at λ_max (Bound NRH)
  1 5.0
  2 5.5
  3 6.0
  4 6.5
  5 7.0
  6 7.5
  7 8.0
  8 8.5
  9 11
  10 blank
  Нажмите здесь, чтобы скачать таблицу 2
- Возьмите десять кювет и колпачков объемом 1,5 мл и обозначьте колпачки от 1 до 10, чтобы они соответствовали таблице в вашем лабораторном блокноте.
- Пометьте стакан объемом 25 мл как 'DIH2O' и наполните его деионизированной водой.
- Слейте нейтральные водные отходы в канализацию и перемаркируйте стакан как "водные буферные отходы".
- Пометьте стакан объемом 400 мл для использованных наконечников для микропипеток.
- Прикрепите наконечник к микропипетке объемом 1 мл и используйте его для дозирования 1000 мкл деионизированной воды в кювету 10. Это ваша заготовка для растворителя.
- Поместите 925 μл буфера мононатрийфосфата pH 7.0 в кювету 5.
- Перенесите оставшиеся пустые кюветы в буферную таблицу. Следуя таблице в лабораторном блокноте, распределите 925 мкл каждого буфера в соответствующую кювету с помощью маркированных микропипеток. Будьте осторожны и не используйте один и тот же наконечник для дозатора для разных буферов.
- Как только вы закончите, верните буферы обратно на свой рабочий стол. Там установите микропипетку объемом 200 мкл для дозирования 75 мкл и прикрепите наконечник к микропипетке.
- Нанесите 75 μL нейтрального красного в каждую из девяти буферных кювет. Переверните каждую кювету несколько раз, чтобы тщательно перемешать растворы. заметка: Замените наконечник пипетки, если он соприкасается с буфером.
- После того как вы смешали нейтральный красный цвет с каждым буфером, сделайте снимок или запишите цвета растворов.
- Включите ручной спектрофотометр и дайте источнику света нагреться. Как только он будет готов, создайте новый эксперимент для измерения зависимости поглощения от длины волны для свободного нейтрального красного цвета.
- Вставьте кювету с деионизированной водой и получите спектр деионизированной воды. Установите его в качестве сольвентного фона или заготовки.
- Затем удалите заготовку и вставьте кювету нейтрального красного цвета в буфер с самым низким pH, который будет иметь самую высокую концентрацию протонированного нейтрального красного.
- Получите спектр, который должен показать один сильный пик. Определите длину волны, соответствующую самой высокой точке этого пика, или максимуму. Запишите эту длину волны в лабораторный блокнот как lambda max для протонированного свободного нейтрального красного цвета.
- Сохраните данные и удалите кювету. Запишите поглощение в блокнот, затем соберите спектры для кювет 2 - 9, используя ту же процедуру.
- Запишите длину волны изобестической точки в свой лабораторный блокнот. Именно здесь все спектры пересекаются на одной длине волны. Если в этой точке спектр не пересекается, опорожните и очистите кювету, приготовьте новый образец и повторите попытку.
- Как только вы закончите собирать спектры для всех девяти кювет, сохраните и экспортируйте данные.
- Создайте новый эксперимент для измерения зависимости поглощения от длины волны для ограниченного нейтрального красного.
- Установите новый наконечник на микропипетку объемом 200 мкл и добавьте 75 мкл раствора рибофлавин-связывающего белка в каждую кювету, включая бланк. Извлеките наконечник, закрепите крышки кюветы и несколько раз переверните кювету, чтобы перемешать растворы.
- Вставьте кювету 10 в спектрофотометр и установите ее в качестве заготовки для растворителя.
- Получите спектр образца с самым низким pH и определите длину волны, соответствующую максимуму самого интенсивного пика. Запишите его в лабораторный блокнот как лямбда-максимум нейтрального красного цвета, связанного с протонированием.
- Получите спектры для кювет 2 - 9 так же, как вы делали это для бесплатных нейтральных красных образцов. Запишите интенсивности в максимальной точке лямбда для протонированного нейтрального красного цвета в таблице, а также длину волны в изобестической точке.
- Когда вы закончите, сохраните свои данные, экспортируйте их для последующего анализа и выключите спектрофотометр.
- Уберите все оборудование и выбросьте использованные наконечники для пипеток в утвержденный контейнер для отходов или мусорное ведро.
- Вылейте кюветы в стакан для отходов водного буфера и промойте кюветы в стакане деионизированной водой.
- Вылейте излишки NaOH в основные отходы и промойте градуированный цилиндр водой.
- Смойте основные водные отходы в канализацию обильной водой из-под крана, вместе с другими водными отходами.
- Мойте стеклянную посуду, крышки кювет и мешалку в соответствии со стандартными процедурами вашей лаборатории. Протрите рабочие поверхности влажным бумажным полотенцем и выбросьте использованные бумажные полотенца и лабораторные салфетки в мусорное ведро.
Results
Теперь давайте проанализируем наши данные об поглощении, чтобы определить pKa нейтрального красного цвета.

Таблица 3: Определение нейтральных красных pKa

Бесплатный NRH⁺ Связанный NRH⁺
λ_max (нм)
ΔA (нм)
Средняя точка (нм)
pKa

Нажмите здесь, чтобы скачать таблицу 3
- Отобразите оба набора данных интенсивности с интенсивностью поглощения на уровне лямбда макс по оси y и pH по оси x, при этом точки будут соединены плавными линиями.
- Рассчитайте разницу между начальной и конечной интенсивностями поглощения для каждого ряда данных.
- Определите поглощение посередине между начальным и конечным поглощениями для каждого ряда, или средние точки поглощения.
- Найдите, где находится средняя точка на каждой линии, и определите значение pH в этой точке. Эти значения pH представляют собой pKa свободного и связанного нейтрального красного цвета.
- Здесь мы видим увеличение pKa примерно на единицу между свободным и связанным нейтральным красным, указывая на то, что связанный протонированный нейтральный красный на порядок слабее, чем свободный протонированный нейтральный красный.

Browse More Videos

pKa

Кювета #	Буферный pH	Abs. at λ_max(Free NRH⁺)	Abs. at λ_max (Bound NRH)
1	5.0
2	5.5
3	6.0
4	6.5
5	7.0
6	7.5
7	8.0
8	8.5
9	11
10	blank

	Бесплатный NRH⁺	Связанный NRH⁺
λ_max (нм)
ΔA (нм)
Средняя точка (нм)
pKa

Буферов

Таблица 1: Приготовление 50 мМ буфера2PO4, pH 7,0

Таблица 2: Поглощение свободного и связанного нейтрального красного цвета

Таблица 3: Определение нейтральных красных pKa

Browse More Videos

Таблица 1: Приготовление 50 мМ буфера₂PO₄, pH 7,0