Очистка и визуализация гриппа Вирусный комплексы рибонуклеопротеидных

Краткое содержание

Геном вируса гриппа А состоит из восьми отдельных комплексов РНК и белков, называемых вирусными комплексов рибонуклеопротеидных (vRNPs). Эта статья описывает очистки глицерина градиента и просвечивающей электронной микроскопии визуализации гриппа vRNPs.

Аннотация

Гриппа, вирусного генома состоит из восьми отрицательного смысла, одноцепочечной молекулы РНК, в индивидуальной упаковке с несколькими копиями гриппа нуклеопротеида (НП) в вирусные частицы ribonulceoprotein (vRNPs). Гриппа vRNPs заключены внутри вирусной оболочки. Во время ввода данных в ячейку, однако, эти vRNP комплексов высвобождаются в цитоплазму, где они получают доступ к хост ядерное движение машин. С целью изучения ядерного импорта гриппа vRNPs и репликации генома гриппа, это полезно для работы с изолированными vRNPs так, чтобы другие компоненты вируса не вмешиваются в эти процессы. Здесь мы опишем процедуру, чтобы очистить эти vRNPs от гриппа вирус. Процедура начинается с нарушения гриппа вириона с моющими средствами для того, чтобы выпустить vRNP комплексов из окутан вириона. VRNPs затем отделить от других компонентов вириона гриппа на 33-70% разрывной градиент глицерина по скорости осадконакопления. Фракции, полученные из глицерина градиент которые затем анализируются с помощью на SDS-PAGE после окрашивания Кумасси синий. Пик фракций, содержащих НП затем объединяются и концентрированной с помощью центрифугирования. После концентрации, целостность vRNPs проверяется визуализации vRNPs методом просвечивающей электронной микроскопии после отрицательного окрашивания. Очистки глицерина градиент изменения, что с Кемлера

Протокол

Часть 1: Разрушение гриппа Вирион

1. Добавить 750 мкл буфера тугриков (20 мМ MES, 150 мМ NaCl, 30 мМ Трис, рН 7,5) в одну Бекман поликарбоната центрифуге трубки (11 мм х 34 мм) рассчитана на установку в TLA-120,2 ротора для использования в Бекман Оптима Max-E ультрацентрифуге.
2. Добавить 500 мкл вируса гриппа А (H3N2 Х-31 A/AICHI/68 штамма; 2 мг / мл) в эту трубу. Смешайте вируса с МНТ буфера с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз.
3. Центрифуга течение 10 минут при 109 000 мкг, 4 ° С, в Бекман Optima Max-E центрифуги использованием TLA-120,2 ротора.
4. Удалить супернатант, и ресуспендируют осадок в 500 мкл буфера нарушения (100 мМ KCl, 5 мМ MgCl _2, 5% (вес / объем) глицерин, 50 мМ octylglucoside, 10 мг / мл лизолецитин, 1,5 мМ дитиотреитол, 100 мМ MES, рН 5,5).
5. Vortex энергично, а затем встряхнуть при 31 ° С в течение 20 минут в Эппендорф thermomixer.

Часть 2: Глицерин градиента скорости центрифугирования осадка

1. Подготовка глицерина градиент, поставив следующие количества глицерина в центрифуге Beckman ultraclear трубки (13 мм х 51 мм): 1 мл 70% (объем / объем) глицерин, 0,75 мл 50% глицерин, 0,375 мл 40% глицерина и 1,8 мл 33% глицерина. Глицерин решения принимаются путем смешивания чистого глицерина с Н. М. буфера (150 мМ NaCl, 50 мМ MES, рН 5,5). Также подготовить баланс трубки, содержащие как глицерин и буфера.
2. Vortex нарушена вирусного образца снова, и загрузить его на глицерин градиента.
3. Центрифуга градиент 3,75 часа при 217 000 мкг, 4 ° С, в Бекман MLS-50-размахивая ведром ротора.
4. После центрифугирования завершения вручную собирать 250 мкл аликвоты градиента, начиная с верхней части трубки. Держите фракций на льду или при температуре 4 ° C.

Часть 3: Анализ фракций Глицерин Градиент по SDS электрофореза в полиакриламидном геле

1. Удалить из 20 мкл каждой фракции в новую пробирку.
2. Добавьте 5 мкл 5x SDS-PAGE образца буфера.
3. Нагреть до 95 ° С в течение 5 минут.
4. Спином вниз образцы кратко и загружать их на 10% полиакриламидном геле, и включают маркеры молекулярного веса в одной из скважин.
5. Выполнить образцов на гель, пока бромфенол синего красителя загрузки достигает близко к нижней части геля.
6. Пятно гель Кумасси синий.

Часть 4: Концентрация vRNP Фракции

1. Выберите глицерин фракций, содержащих главным образом Н.П., объединить их и распределить их на две Бекман поликарбоната центрифужные пробирки (11 мм х 34 мм).
2. Заполните каждую пробирку с диэтиловым pyrocarbonate (DEPC) обработанных сверхчистой воды и пипеткой вверх и вниз несколько раз перемешать.
3. Центрифуга в течение 4,5 часа при 157 000 мкг, 4 ° С, в Бекман TLA-120,2 ротора.
4. Удалить супернатант, и ресуспендируют осадок в 50 мкл DEPC обработанной воды.
5. При желании, ₂₈₀ из концентрированного vRNPs может быть измерена. Как NP является основным компонентом в настоящее объединенных фракций, оценку молярность НП может быть рассчитана по его коэффициент экстинкции 55350 М ^-1 см ^-1 (как это определено через ProtParam ^3).
6. Алиготе очищенной vRNPs, и хранить их замораживали при -80 ° C для дальнейшего использования.

Часть 5: Отрицательные Окрашивание vRNPs

1. Развести 1 мкл очищенной vRNP на 9 мкл свежей производства и фильтруется-два раза МНТ буфера (20 мМ MES, 150 мМ NaCl, 30 мМ Трис, рН 7,5). Другие буферы и OK, чтобы разбавить vRNPs и мыть образца сетки (шаг 5.5), но не использовать PBS если уранилацетата используется для отрицательной окраски.
2. Тлеющего разряда образца (медь ПЭМ) сетки ранее окрашенных parlodion и углеродной пленки в течение 30 секунд.
3. Держите свеже тлеющем выписан образца сетки с помощью пинцета, а также применять 5-мкл каплю разбавленного vRNP на образец сетки.
4. Оставьте капли образца на сетке в течение 8 минут.
5. Во время ожидания, места небольшую полоску парафильмом на скамейке, и обойтись 2 капли, содержащие 10 мкл буфера МНТ (мыть сетку), и 80-мкл капли свежеприготовленного красящим раствором (1% молибдата аммония или 1 % уранилацетата) на парафильмом.
6. После 8-минут адсорбции, фитиль от части образца раствора из образца сетки с кусочек фильтровальной бумаги (разрезанных на треугольники). Не позволяйте образца сетки для просушки.
7. Промыть образец сетки в 2 капли, содержащие 10 мкл буфера для MNT общее время 1 минута. Это можно сделать, внимательно снижение образца сетки на падение, а затем влагу от части образца раствора из образца сетку с куском фильтровальной бумаге (не давая образец сетки сухой).
8. Сразу же после влагу от последней капли буфера от образца сетки, в комплектеLy погрузить образец сетки в пределах пятна капель и подождите 1 минуту.
9. Полностью фитиль от окраски раствора от образца сетку с куском фильтровальной бумаги.
10. Разрешить образца сетке высохнуть на воздухе в течение нескольких минут до наблюдения в электронном микроскопе.

Часть 6: Представитель Результаты:

Рисунок 1

Как гриппа Н.П. (~ 56 кДа) является основной белок, содержащийся в вирусную комплексов рибонуклеопротеидных, группа НП как правило, сильные группы в фракций, содержащих vRNPs (рис. 1). В дополнение к Н. П., каждый гриппа vRNP также содержит копию тримерной РНК-полимеразы (молекулярный вес 82, 86 и 86,5 кДа) комплекса. Они могут быть или не быть видимым окрашиванием Кумасси синим, потому что их обилие низка по сравнению с NP. Полимераз, однако, может быть обнаружен, если вместо Commassie синевы, серебряные пятна гель не выполняется. Гриппа матрица белка М1 (~ 28 кДа) должны быть минимально присутствует в фракций, где Н. П. белковых фракций пика присутствуют.

Рисунок 2

Негативно окрашенные vRNPs как визуализируются при электронной микроскопии должно дать vRNPs, которые напоминают палочковидные частицы с переменной длины, примерно 30 нм до 120 нм в длину (рис. 2а). Олигомерные NP организован как цепочка NP молекулы, которые в дальнейшем сложенными в двойную спиральную структуру повторить, так как петли на концах этих палочковидные частицы иногда можно увидеть (рис. 2б).

Обсуждение

Очистка vRNPs основана на методике, описанной Кемлера и соавт. (1994) ^1. Мы и другие также используют этот протокол для изоляции vRNPs для изучения их ядерных импорта. ^2,4,5

Мы рекомендуем использовать РНКазы-бесплатные советы и трубки при манипулировании vRNPs потому что вирусный геном состоит из РНК и, следовательно, ухудшает легко в присутствии РНК. Кроме того, все буферы должны быть сделаны в воде, которая РНКазы бесплатно. Протокол, описанный здесь, был пр...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
вирус гриппа А H3N2 X-31 A/AICHI/68	Charles River Laboratories	490715
Трис	Sigma-Aldrich	T1503
МЕС (2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота)	Sigma-Aldrich	M-8250
Глицерин	Fisher Scientific	G33-1
Октилглюкозид	Sigma-Aldrich	O-8001
Лизолецитин	Sigma-Aldrich	L-4129
Дитиотреитол	Sigma-Aldrich	D-9779
Кумасси бриллиантовый синий G-250	Kodak	1367796
вода, обработанная диэтилпирокарбонатом (DEPC)	Invitrogen	750024
Ацетат уранила	Ted Pella, Inc.	19481
Молибдат аммония	Fisher Scientific	A-674
Ультрацентрифуга Optima MAX-E	Beckman Coulter Inc.	434491
Комплект ротора MLS-50, с поворотными стаканами	Beckman Coulter Inc.	367280
TLA-120.2 Ротор в сборе, с фиксированным углом, титановый	Beckman Coulter Inc.	362046
Eppendorf Thermomixer	Лауда Бринкманн	022670000