Мезоскопические флуоресцентная томография для В естественных условиях Изображений развивающихся Drosophila</em

Краткое содержание

Мезоскопические флуоресценции томографии работает за пределы проникновения ткани срезов флуоресцентной микроскопии. Методика основана на мульти-проекции освещением и фотонной описание транспорта. Мы демонстрируем в естественных условиях всего тела 3D визуализация морфогенеза GFP-экспрессирующих крыло имагинальных дисков Дрозофилы.

Аннотация

Визуализация формирования развивающихся органов, а также прогрессирования и лечения заболеваний часто в значительной степени зависит от возможности оптического исследования молекулярных и функциональных изменений в неповрежденных живых организмах. Большинство существующих методов оптической визуализации недостаточно эффективны для получения изображений в масштабах, находящихся между пределами проникновения современной оптической микроскопии (0,5-1 мм) и пределами оптической макроскопии, обусловленными диффузией (>1 см) [1]. Таким образом, многие важные модельные организмы, например, насекомые, эмбрионы животных или конечности мелких животных, остаются недоступными для оптической визуализации in vivo.

Несмотря на растущий интерес к разработке методов оптической визуализации с нанометровым разрешением, было предпринято немного успешных попыток увеличить глубину проникновения при формировании изображения. Возможность проведения визуализации in-vivo за пределами пределов микроскопии на практике сталкивается с трудностями, связанными с рассеянием фотонов в тканях. Например, недавние попытки визуализировать целые эмбрионы [2,3] требуют специальной химической обработки образца для устранения рассеяния — процедуры, которая делает их пригодными только для посмертной визуализации. Однако эти методы подтверждают необходимость визуализации более крупных образцов, чем те, что обычно доступны при двухфотонной или конфокальной микроскопии, особенно в биологии развития и при поиске новых лекарственных средств.

Нами был разработан новый метод оптической визуализации, получивший название мезоскопическая флуоресцентная томография [4], который подходит для неинвазивной визуализации in-vivo в диапазоне размеров от 1mm до 5mm. Данный метод жертвует разрешением в пользу глубины проникновения, но обеспечивает беспрецедентные возможности томографической визуализации. Он был разработан для того, чтобы добавить время в качестве нового измерения в наблюдениях в области биологии развития (и, возможно, в других областях биологических исследований), предоставляя возможность визуализировать эволюцию флуоресцентно-меченных ответов во времени. Таким образом, этот метод может ускорить изучение морфологических или функциональных зависимостей от генных мутаций или внешних стимулов и, что немаловажно, позволяет получить полную картину развития или функционирования тканей за счет лонгитюдной визуализации в режиме таймлапс одного и того же развивающегося организма.

В данном методе используется модифицированный лабораторный микроскоп и многопроекционная подсветка для сбора данных при 360-градусном проецировании. В нем применяется упрощение Ферми к решению уравнения Фоккера-Планка для уравнения переноса фотонов в сочетании с принципами геометрической оптики для создания реалистичной схемы инверсии, подходящей для мезоскопического диапазона. Это позволяет осуществлять прижизненную визуализацию всего тела непрозрачных трехмерных структур в образцах размером до нескольких миллиметров.

Мы продемонстрировали эффективность данного метода in-vivo, визуализировав трехмерные структуры развивающихся тканей Drosophila in-vivo и отслеживая морфогенез крыльев в непрозрачных куколках Drosophila в режиме реального времени в течение шести последовательных часов.

Протокол

Дрозофилы запасы, используемые в данном эксперименте являются следующие:

• elav-Gal4 (FBti0002575)
• AP-Gal4md544 (FBal0051787)
• UAS-srcEGFP (FBti0013990)
• w1118 (FBal0018186)

Для всех экспериментов, UAS-Gal4 система была использована для гиперэкспрессией GFP в ткани интерес (т.е. слюнных желез или крыло диски). В частности, самок трансгенных с соответствующим Gal4 были скрещены на UAS-EGFP трансгенных товарищей. Крестов было выращено при 25 ° С в увлажненной инкубатора. Когда куколки начать заполнение флаконах (примерно 5-6 дней после начала крест), они были отобраны для GFP флуоресценции при белом prepupal этапе (0-1 ч после формирования пупария) и собранных для томографии.

1. Настройка соответствующие кресты и задних при 25 ° С
2. 5-6 дней после начала крест, выберите флуоресцентные потомства для работы с изображениями. Использование мокрой кистью для нежного удаления белого предкуколок из сторон флаконе.
3. Положите предкуколок в капле воды или PBS размещены в чашке Петри, чтобы удалить частицы пищи и клей, который охватывает куколки дело и делает образца autofluorescent. Аккуратно очистите кисть. Если старение куколки необходимо, место, выбранное белый предкуколок в чашку Петри с мокрым бумажным полотенцем (влажной камере), либо по бокам чистый флакон с летучей пищи. Это будет гарантировать, что есть достаточно влаги, чтобы обеспечить правильное развитие животного.

Монтаж дрозофилы

1. Клей нижней части куколки случае в капиллярной стеклянной трубки (800 микрон в диаметре), что передняя / задняя ось мухи ориентирована параллельно трубе.
2. Fix капиллярной трубке вертикально на ротационной стадии.
3. Отрегулируйте наклон оси вращательное этапе для того, чтобы оси вращения должны быть параллельны пикселей колонны изображения CCD.

Модель определения Вперед

1. Fix куколки в капиллярной стеклянной и смонтировать, как описано выше
2. Заполните кварцевую капиллярную трубку (100 микрон, О. Д.) с флуоресцентным красителем (Cy5.5)
3. Вставьте капилляр внутри куколки при температуре 45 градусов по отношению к передней / задней оси
4. Illuminate куколки с пучком лазерного возбуждения с низкой числовой апертуры линзы. Сбор флуоресцентные изображения просвечивание более 360 градусов вращающийся куколки вдоль его вертикальной оси.
5. Fit экспериментальных данных с соответствующими вперед модель

Изображений слюнных желез

1. Горы куколки выражения GFP в слюнных железах, как описано выше
2. Illuminate с возбуждением пучка и собирать в просвечивание сигнала флуоресценции GFP более 360 градусов вращающийся куколки вдоль его вертикальной оси.
3. Реконструкция приобретенных данных с использованием передовых моделей

Time-Lapse изображений

1. Горы белых prepupa выражения GFP в крыле имагинальных дисков
2. Держите изображений среды влажных и при комнатной температуре, чтобы избежать обезвоживания куколки.
3. Место выдержки, чтобы избежать непрерывного освещения
4. Illuminate с возбуждением пучка и собирать в просвечивание сигнала флуоресценции GFP более 360 градусов вращающийся куколки вдоль его вертикальной оси.
5. Реконструкция приобретенных данных с использованием модели вперед.

Гистология

1. Рассеките слюнных желез ЦНС / глаз диски 1x PBS.
2. Fix тканей в 4% формальдегида, 1x PEM (100 мм трубы, 1мМ EGTA, 1мМ MgCl ₂₎ для 20 минут при комнатной температуре.
3. Удалить фиксации и установки в Vectashield с DAPI (вектор)
4. Изображение с флуоресцентным микроскопом.

Time-Lapse Гистология

1. Сбор белых предкуколок и стадии их во влажной камере.
2. Сбор куколки на разных стадиях развития
3. Укол куколки случае в два раза (0 часов после Пупарий свита) с помощью тонкой иглы (насекомое контактный 000, ФСТ) до фиксации.
4. Fix куколки в 8% формальдегида, 1x PEM в течение 6-8 часов при комнатной температуре при легком помешивании.
5. После снятия фиксации и промывки 1x PBS, вырезать фиксированной куколки с острым лезвием на две части перпендикулярно оси / P;
6. Погрузите две штуки в Vectashield с DAPI (вектор) и смонтировать на покровного стекла слайдов (Lab-Tek) для работы с изображениями.
7. Получение изображений с флуоресценции конфокальной микроскопии.

Рисунок 1. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы увидеть др.arger версия рисунке 1.

Обсуждение

В естественных условиях реконструкции куколки дела и GFP-экспрессирующих слюнных желез D. MELANOGASTER prepupa (Масштаб бар, 500 мкм) с соответствующими гистологии (синий, DAPI окрашивания; зеленый, GFP флуоресценции) показана на рис 1 (а). Покадровый серии изображений D. MELANOGASTER крыло имагинальных дисков показана на рис.1 (б). Изображения, приобретенные у одного живого образца, на четырех различных моментов времени (0,3.0, 3,5 и 6,5 часа). В первой колонке одной проекции при 0 градусов по отношен...