Мезоскопические флуоресцентная томография для В естественных условиях Изображений развивающихся Drosophila</em

Краткое содержание

Мезоскопические флуоресценции томографии работает за пределы проникновения ткани срезов флуоресцентной микроскопии. Методика основана на мульти-проекции освещением и фотонной описание транспорта. Мы демонстрируем в естественных условиях всего тела 3D визуализация морфогенеза GFP-экспрессирующих крыло имагинальных дисков Дрозофилы.

Аннотация

Визуализация формирования развивающихся органов, а также прогресса и лечения болезней часто в значительной степени зависит от способности оптически исследовать молекулярные и функциональные изменения в интактных живых организмах. Большинство существующих методов оптической визуализации неадекватны для получения изображений в размерах, лежащих между пределами проникновения современной оптической микроскопии (0,5-1 мм) и диффузионными пределами оптической макроскопии (>1 см) [1]. Таким образом, многие важные модельные организмы, например, насекомые, эмбрионы животных или конечности мелких животных, остаются недоступными для оптической визуализации in vivo.

Несмотря на растущий интерес к развитию методов оптической визуализации с нанометровым разрешением, было не так много успешных попыток улучшить глубину проникновения изображения. Возможность выполнения визуализации in vivo за пределами микроскопии на самом деле сталкивается с трудностями, связанными с рассеянием фотонов в тканях. Недавние попытки визуализации целых эмбрионов, например, [2,3], требуют специальной химической обработки образца, чтобы очистить его от рассеивания, что делает его пригодным только для посмертной визуализации. Эти методы, однако, свидетельствуют о необходимости визуализации более крупных образцов, чем те, которые обычно допускаются с помощью двухфотонной или конфокальной микроскопии, особенно в биологии развития и при разработке лекарств.

Мы разработали новый метод оптической визуализации под названием Мезоскопическая флуоресцентная томография [4], который подходит для неинвазивной визуализации in vivo при размерах 1-5 мм. Этот метод обеспечивает беспрецедентную производительность томографической визуализации, и он был разработан для того, чтобы добавить время в качестве нового измерения в наблюдениях за биологией развития (и, возможно, в других областях биологических исследований), предоставляя возможность визуализировать эволюцию флуоресцентных реакций с течением времени. Таким образом, он может ускорить изучение морфологических или функциональных зависимостей от генных мутаций или внешних стимулов и, что важно, может охватить полную картину развития или функции тканей, позволяя продольную покадровую визуализацию того же развивающегося организма.

Этот метод использует модифицированный лабораторный микроскоп и многопроекционное освещение для сбора данных в проекциях на 360 градусов. В ней применяется упрощение Ферми к решению уравнения переноса фотонов Фоккера-Планка в сочетании с принципами геометрической оптики для построения реалистичной схемы инверсии, пригодной для мезоскопического диапазона. Это позволяет визуализировать все тело в натуральном виде непрозрачных трехмерных структур в образцах размером до нескольких миллиметров.

Мы продемонстрировали эффективность метода in vivo, визуализируя трехмерные структуры развивающихся тканей дрозофилы in vivo и отслеживая морфогенез крыльев у непрозрачных куколок дрозофилы в реальном времени в течение шести последовательных часов.

Протокол

Дрозофилы запасы, используемые в данном эксперименте являются следующие:

• elav-Gal4 (FBti0002575)
• AP-Gal4md544 (FBal0051787)
• UAS-srcEGFP (FBti0013990)
• w1118 (FBal0018186)

Для всех экспериментов, UAS-Gal4 система была использована для гиперэкспрессией GFP в ткани интерес (т.е. слюнных желез или крыло диски). В частности, самок трансгенных с соответствующим Gal4 были скрещены на UAS-EGFP трансгенных товарищей. Крестов было выращено при 25 ° С в увлажненной инкубатора. Когда куколки начать заполнение флаконах (примерно 5-6 дней после начала крест), они были отобраны для GFP флуоресценции при белом prepupal этапе (0-1 ч после формирования пупария) и собранных для томографии.

1. Настройка соответствующие кресты и задних при 25 ° С
2. 5-6 дней после начала крест, выберите флуоресцентные потомства для работы с изображениями. Использование мокрой кистью для нежного удаления белого предкуколок из сторон флаконе.
3. Положите предкуколок в капле воды или PBS размещены в чашке Петри, чтобы удалить частицы пищи и клей, который охватывает куколки дело и делает образца autofluorescent. Аккуратно очистите кисть. Если старение куколки необходимо, место, выбранное белый предкуколок в чашку Петри с мокрым бумажным полотенцем (влажной камере), либо по бокам чистый флакон с летучей пищи. Это будет гарантировать, что есть достаточно влаги, чтобы обеспечить правильное развитие животного.

Монтаж дрозофилы

1. Клей нижней части куколки случае в капиллярной стеклянной трубки (800 микрон в диаметре), что передняя / задняя ось мухи ориентирована параллельно трубе.
2. Fix капиллярной трубке вертикально на ротационной стадии.
3. Отрегулируйте наклон оси вращательное этапе для того, чтобы оси вращения должны быть параллельны пикселей колонны изображения CCD.

Модель определения Вперед

1. Fix куколки в капиллярной стеклянной и смонтировать, как описано выше
2. Заполните кварцевую капиллярную трубку (100 микрон, О. Д.) с флуоресцентным красителем (Cy5.5)
3. Вставьте капилляр внутри куколки при температуре 45 градусов по отношению к передней / задней оси
4. Illuminate куколки с пучком лазерного возбуждения с низкой числовой апертуры линзы. Сбор флуоресцентные изображения просвечивание более 360 градусов вращающийся куколки вдоль его вертикальной оси.
5. Fit экспериментальных данных с соответствующими вперед модель

Изображений слюнных желез

1. Горы куколки выражения GFP в слюнных железах, как описано выше
2. Illuminate с возбуждением пучка и собирать в просвечивание сигнала флуоресценции GFP более 360 градусов вращающийся куколки вдоль его вертикальной оси.
3. Реконструкция приобретенных данных с использованием передовых моделей

Time-Lapse изображений

1. Горы белых prepupa выражения GFP в крыле имагинальных дисков
2. Держите изображений среды влажных и при комнатной температуре, чтобы избежать обезвоживания куколки.
3. Место выдержки, чтобы избежать непрерывного освещения
4. Illuminate с возбуждением пучка и собирать в просвечивание сигнала флуоресценции GFP более 360 градусов вращающийся куколки вдоль его вертикальной оси.
5. Реконструкция приобретенных данных с использованием модели вперед.

Гистология

1. Рассеките слюнных желез ЦНС / глаз диски 1x PBS.
2. Fix тканей в 4% формальдегида, 1x PEM (100 мм трубы, 1мМ EGTA, 1мМ MgCl ₂₎ для 20 минут при комнатной температуре.
3. Удалить фиксации и установки в Vectashield с DAPI (вектор)
4. Изображение с флуоресцентным микроскопом.

Time-Lapse Гистология

1. Сбор белых предкуколок и стадии их во влажной камере.
2. Сбор куколки на разных стадиях развития
3. Укол куколки случае в два раза (0 часов после Пупарий свита) с помощью тонкой иглы (насекомое контактный 000, ФСТ) до фиксации.
4. Fix куколки в 8% формальдегида, 1x PEM в течение 6-8 часов при комнатной температуре при легком помешивании.
5. После снятия фиксации и промывки 1x PBS, вырезать фиксированной куколки с острым лезвием на две части перпендикулярно оси / P;
6. Погрузите две штуки в Vectashield с DAPI (вектор) и смонтировать на покровного стекла слайдов (Lab-Tek) для работы с изображениями.
7. Получение изображений с флуоресценции конфокальной микроскопии.

Рисунок 1. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы увидеть др.arger версия рисунке 1.

Обсуждение

В естественных условиях реконструкции куколки дела и GFP-экспрессирующих слюнных желез D. MELANOGASTER prepupa (Масштаб бар, 500 мкм) с соответствующими гистологии (синий, DAPI окрашивания; зеленый, GFP флуоресценции) показана на рис 1 (а). Покадровый серии изображений D. MELANOGASTER крыло имагинальных дисков показана на рис.1 (б). Изображения, приобретенные у одного живого образца, на четырех различных моментов времени (0,3.0, 3,5 и 6,5 часа). В первой колонке одной проекции при 0 градусов по отношен...