$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Часть 1: Подготовка уточнил гомогената ткани
- Dounce гомогенизации незаписанных корковой ткани в 4 раза объема ледяного буфера (0,1 М фосфатным буферным раствором [Са + + - и Mg + +-Free] плюс протеазы 2x ингибитор коктейль [Санта-Крус]) с примерно 30 даже пестиком штрихов (т.е. добавить 400μl буфер до 100 мг ткани).
- Спиновые гомогенатах течение 5 минут при 3000 г (4 ° С). Осторожно снимите уточнил супернатанты и хранить аликвоты этих экстрактов при -80 ° C до использования.
- Определите общую концентрацию белка (мкг / мкл) для уточнил гомогенатах использованием bicinchoninic кислоты (ДСС) анализ, в соответствии с инструкциями производителя (ThermoFisher).
Часть 2: SDS-PAGE Пробоподготовка
- С 10 хорошо, 10-20% Tricine гель (Invitrogen), максимальный объем, который может быть загружен на одну скважину составляет ~ 25 мкл. Общий объем включает 2x образец SDS буфера и 10x восстановителем, поэтому максимальный объем гомогената уточнил, которые могут быть загружены в скважину 10 мкл. Разъяснено 20% (м / о) корковых гомогенатах должны иметь общую концентрацию белка более 5 мкг / мкл, что позволяет 50 мкг общего белка на лунку. Образцы с менее 5mg/ml белка потребует загрузки меньше общего белка на лунку. Однако высокий уровень белка являются оптимальными для обнаружения мономерных и агрегированных Ар (50-60μg суммарного белка оптимально).
Всегда загружайте же количество общего белка на лунку. - Для каждого гель, загрузить по крайней мере одну скважину с 10 мкл из маркер молекулярного веса, таких как SeeBlue Plus2 (Invitrogen). В качестве положительного контроля, запустить 10-100ng синтетических Aβ40 или Aβ42 пептид (разводится в 1xPBS) в другом хорошо.
- Подготовка реакционной смеси на льду, используя только что оттаяли, уточнил гомогенатах. Вихревые трубки в течение 5-10 секунд, тепло в сухой ванне при температуре 100 ° С в течение 5 минут, затем быстро спина все образцы для удаления конденсата в шапку.
Часть 3: SDS-PAGE гель-электрофореза
- Нагрузка встряхивали образцы на 10-20% Tricine геля в XCell Конечно Блокировка Мини-Cell Gelbox, используя Tricine SDS работает буфер, в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen),
- Выполнить гель при постоянном напряжении 125 В в течение приблизительно 90 минут. Давайте образцы продлится до 4KDa группы маркера составляет около 1 см от нижней части геля.
Часть 4: Перенос белков из Гели для мембран
- Осторожно снимите гели из пластикового корпуса и монтаж сэндвич передачи внутри модуля XCell II Blot, в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen). Предварительно мокрой промокательной колодки и 0,2 мкм мембран нитроцеллюлозы с Трис-Глицин буфера передачи (20% метанола), и удалить все пузырьки из промокательной колодки или фильтровальную бумагу / мембранного сэндвича.
- В XCell Gelbox, заполнить внутреннюю камеру с передачей буфера и заполнить внешнюю камеру с DIH 2 O (метанол воздействия могут износиться пластиковые gelbox во времени).
- Выполнить перенос в течение 2-3 часов при постоянной силе тока 25 мА в.
- Когда передача завершена, деконструировать бутерброд и место гели в DIH 2 O и мембран в 1xPBS, как в квадратные пластиковые чашки Петри (или другой подходящий контейнер).
- Для визуализации эффективности белка-переносчика, гели могут быть окрашены с Simply Blue SafeStain (Invitrogen) и мембран с Красным пятном пунцовый S (Sigma Aldrich), и в соответствии с инструкциями производителя. Это окрашивание не будет вмешиваться в иммуноблоттинга. Если окрашивание выявляет неэффективные белка-переносчика, изменить время передачи в шаге 3.
Часть 5. Антиген-эпитопа поиска и Иммуноблоттинг
- Антиген поиска является важным шагом в выявлении Ар эпитопов на мембраны для связывания антител в течение иммуноблоттинга. Любой пароход, микроволновая печь, или водяной бане, который поддерживает постоянную температуру 100 ° C будет достаточно. Для поиска в антиген пароход рулонн мембраны в тяжелых Kapak пластиковый пакет заполнен 1xPBS, при комнатной температуре. Положите мешочек квартиру в предварительно нагретой пароход, однажды мешок начинает расширяться, инкубировать еще 15 минут. Разрешить мембраны медленно охлаждаться до удаления его из сумки, чтобы предотвратить чрезмерное морщин.
- При комнатной температуре, тщательно удалить мембрану из пар мешочек и полоскать мембраны в течение 5 минут в 1xPBS, после 5-ти минутах промыть в TBS-T (Трис-буферном растворе, рН 8,0 с 0,05% Твин-20 [Sigma] ), на орбитальном шейкере. Инкубируйте мембраны в блокировании решения (2,5% обезжиренным молоком в TBS-T) в течение одного часа, встряхивая. Без промывки, передача мембраны блюдо или пластиковый пакет содержащие первичные антитела разбавляют в блокировании решения (6E10 на 1:1000 [1μg/ml] 1:5000 [0.2μg/ml] разбавления, Covance), избегая пузырейs. Инкубировать на орбитальном шейкере при комнатной температуре в течение одного часа, а затем через 24-48 часов тряски при 4 ° С (больше инкубационный может дать лучший сигнал).
- Промыть мембраны в течение 30 минут в TBS-T (один быстрое полоскание затем 3 х 10 полосканий минуту).
- Инкубируйте мембраны в HRP-сопряженных вторичные антитела (Amersham ECL овец антимышиным, GE Healthcare), растворенный в 1:10000 в блокировании решения, в течение 90 минут на шейкере при комнатной температуре.
- Промыть мембраны в течение 30 минут в TBS-T (один быстрое полоскание затем 3 х 10 полосканий минуту).
- В шейкер, инкубировать мембраны в свеже-Запад сделал SuperSignal Пико электрохемилюминесценции реагента (ThermoFisher) в течение 5 минут, промокните лишнюю реагента на безворсовой фильтровальную бумагу и поместите мембрану в фильме кассету, между пластиковой защиты листа. Пятно от дополнительных реагентов с SuperSignal пыли Kimwipes если это необходимо.
- Expose для Kodak фильм Биомакс MR за каждые 30 секунд до 30 минут и развиваться в фильме разработчика. Через 5 минут, Ар полосы мономера, вероятно, будет насыщенным.
- Мембраны могут быть удалены (после промывки в TBS-T) при встряхивании в Restore Plus зачистки буфера в течение 30 минут при комнатной температуре и reprobed с дополнительными антителами, при желании.
Часть 6: Представитель Вестернблот:
Цифры 1а-с. Разъяснено гомогенатах содержащие 50 мкг общего белка с 7 человека в качестве субъекта анализируются на наличие мультимерные Ар и АЭС. Иммуноблоттинг с антителами 6E10 показывает Ар мономеров, димеров, тримеров, тетрамеров и APP (верхний диапазон) во всех случаях болезни Альцгеймера, а также обильные более высоким молекулярным весом Ар мультимеров в 2 случаях нашей эры. Синтетические Aβ40 подтверждает личность более низкой молекулярной полосы веса. AD: болезнь Альцгеймера, DLB: деменция с тельцами Леви, Н. Д.: Nondemented человека () 30 минутный фильм воздействия, (б) 5 минут фильма экспозиции, (с) 30 секундной экспозиции пленки..