В месте субклеточных фракционирования клеток млекопитающих на микроскопе покровные позволяет визуализировать белки локализации.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В месте субклеточных Фракционирование Приверженец и не соблюдают клетках млекопитающих
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Белки функции тесно связаны с белком локализации. Хотя некоторые белки ограничены в определенном месте или субклеточных отсек, многие белки присутствуют в виде свободно диффундирующих населения в свободном обмене с подгруппы населения, тесно связанный с определенным субклеточных домена или структуры. Натурные субклеточного фракционирования позволяет визуализировать компартментализация белка, а также может выявить белок подгруппах, локализовать к конкретным структурам. Например, удаление растворимых цитоплазматических белков и слабозакрепленных ядерных белков может выявить устойчивые ассоциации некоторых факторов транскрипции с хроматином. Последующие переваривания ДНК может в некоторых случаях выявить связь с сетью белков и РНК, является общее название ядерной эшафот или ядерного матрикса.
Здесь мы опишем шаги, необходимые во время на месте фракционирования сторонник и не сторонник клетках млекопитающих на микроскопе покровные. Белки визуализации можно достичь с помощью специфических антител или флуоресцентных белков слияния и флуоресцентной микроскопии. Антитела и / или флуоресцентными красителями, которые выступают в качестве маркеров для конкретного отделения или структуры позволяют белка локализации быть отображены в деталях. Натурные фракционирования также может быть объединена с западной промокательной сравнить количество белков, присутствующих в каждой фракции. Этот простой биохимический подход может выявить ассоциации, которые могли бы остаться незамеченными.
Протокол
I. Подготовка для фракционирования
В этом разделе описывается подготовка поли-L-лизин покрытием покровные микроскопа и прикрепление клеток до фракционирования. При необходимости клетки могут быть временно трансфицированных векторов экспрессии белка до или после вложения.
А. Получение поли-L-лизин покрытием покровные
- Подготовка решения 1mg/ml поли-L-лизин в дистиллированной воде.
- Пальто чистой покровные с поли-L-лизин, путем инкубации их в раствор, по крайней мере 1 час на качалке платформы при 22 ° C.
- Мыть покрытие покровные стерильной дистиллированной водой в два раза и следовать ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Общие проблемы и предложения:
Все или большинство из клетки потеряли во время стирки. Во время промывки жидкости должны быть медленно добавляют в сторону 6-луночный планшет избегая покровное. Аналогично жидкостей должны быть удалены путем тщательного наклоняя тарелку и медленно пипетирования лишнюю жидкость. Адгезия клеток может быть увеличено использованием поли-L-лизин покрытием покровные.
Геномная ДНК не полностью переваривается. Для некоторых типов клеток пищева.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Anyaporn Sawasdichai и Nazefah Абдул Хамид благодарны правительству Королевства Таиланд и правительством Малайзии, соответственно, для доктор философии Стипендии. Эта работа финансировалась Wellcome Trust грант присужден PSJ и KG. Мы также благодарны Бристольского университета фонда Bioimaging Вольфсон.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии | |
|---|---|---|---|---|
| BSA | Химическое вещество | Sigma-Aldrich | A9647-100G | |
| ДНКаза I | Химическое вещество | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| поли-L-лизин | Химическое вещество | Sigma-Aldrich | P-8920 | |
| Трипсин | Химическое вещество | |||
| EGTA | Химическое вещество | Sigma-Aldrich | E4378-25G | |
| Формальдегид | Химическое вещество | VWR | 284216N | |
| PIPES | Химическое вещество | Sigma-Aldrich | P-6757 | |
| Сахароза | Химическое вещество | Fisher Scientific | S/8600/53 | |
| Triton X-100 | Химическое вещество | Sigma-Aldrich | T-6876 | |
| Среда для заключения с DAPI | Химическое вещество | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Реагент для трансфекции Fugene 6 | Химическое вещество | Roche Group | 11814443001 | |
| Гистон H1 | Антитела | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-8030 | |
| Ламин A/C | Антитела | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-20681 | |
| Тубулин-α | Антитела | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-32293 |
Ссылки
- Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 regulates human papillomavirus type 16 E2 interaction with chromatin. J Virol. 81, 4338-4342 (2007).
- Javed, A., Guo, B., Hiebert, S., Choi, J. Y., Green, J., Zhao, S. C., Osborne, M. A., Stifani, S., Stein, J. L., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, G. S.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
