Сиалидазы анализа является простой технический подход, который позволит выяснить роман молекулярный механизм (ы) TLR датчиков микробной инфекции и участие в воспалительных заболеваний на уровне рецепторов на поверхности клетки живых макрофагов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Обнаружение Neu1 сиалидазы активность в регулировании Toll-подобных рецепторов активации
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Млекопитающих Toll-подобные рецепторы (TLRs) представляют собой семейство рецепторов, которые распознают патоген-связанные молекулярные паттерны. Мало того, что TLRs важно датчиков микробного (например, вирусов, бактерий и паразитов) инфекции, они также играют важную роль в патофизиологии инфекционных заболеваний, воспалительных заболеваний, и, возможно, при аутоиммунных заболеваниях. Таким образом, интенсивность и продолжительность TLR ответы с инфекционными болезнями должны быть под жестким контролем. Отсюда следует, что понимание структурной целостности датчиков-рецепторов, их взаимодействие лиганд и сигнальных компонентов имеет важное значение для последующего иммунологической защиты. Он также даст широкие возможности для модификации болезни через датчик манипуляции. Хотя сигнальные пути из TLR датчики хорошо охарактеризованы, параметры, управляющие взаимодействиями между датчиками и их лигандами до сих пор остаются плохо определены. Мы недавно выявили новый механизм активации TLR его природный лиганд, который ранее не наблюдалось 1,2. Она предполагает, что лиганд-индуцированной активации TLR жестко контролируется Neu1 сиалидазы активации. Мы также сообщили, что Neu1 жестко регулирует нейротрофинов рецепторов, как TrkA и TrkB 3, которые включают Neu1 и матричные металлопротеиназы-9 (MMP-9) перекрестные помехи в комплексе с рецепторами 4. Сиалидазы анализа была изначально использовать, чтобы найти новых лигандов, тимохинон, в активации Neu4 сиалидазы на поверхности клеток макрофагов, дендритных клеток и клеток фибробластов с помощью GPCR Gαi белков и MMP-9, 5. Для TLR рецепторы, наши данные показывают, что Neu1 сиалидазы уже в комплексе с TLR-2, -3 и -4 рецепторы, и индуцируется на связывание лигандов либо рецептора. Активированный Neu1 гидролизует сиалидазы сиалил α-2 ,3-связанных β-галактозил остатки удаленных от лиганд для удаления стерическое препятствие для TLR-4 димеризации, MyD88/TLR4 сложный набор, NFkB активации и про-воспалительных реакций клетки. В совместный доклад, Neu1 сиалидазы было показано, регулируют фагоцитоз макрофагов клетки 6. Взятые вместе, сиалидазы анализ дает нам мощные идеи для молекулярных механизмов лиганд-индуцированной активации рецептора. Хотя точной взаимосвязи Neu1 сиалидазы и активация TLR, ТРК рецепторов до сих пор не выяснена, она будет представлять новый или новаторский подход к регуляции клеточного пути.
Протокол
1. Воскрешая замороженных клеток макрофагов
- Прежде чем воскрешение замороженных клеток от -80 ° C морозильник, необходимо подготовить культуральной среде стерильные фильтруется Средний Дульбеко изменения Орла (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 5 мкг / мл plasmocin. Plasmocin является антибиотиком раствор, используемый в нашем исследовании для устранения и предотвращения загрязнения микоплазмы клеточных культур.
- За один флакон замороженных клеток, одна добавляет 4 мл, 1 мл культурной среды на 25 см 2 клеточной культуре колбу в стерильных биологической капот сдерживания.
- Когда флакон замороженны....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Использование недавно разработанной метода обнаруживать сиалидазы активности в живых клетках макрофагов 2, мы использовали эту технологию для выявления сиалидазы деятельности в индуцированной лигандом сиалидазы деятельности в живом BMC-2 макрофагов клеток в зависимости от дозы, а в живом DC-2.4 дендритных клеток , HEK-TLR4/MD2, HEK293, SP1 клетки молочной железы аденокарцинома, человека WT и 1140F01 и WG0544 типа я сиалидоз клетки фибробластов. Ингибиторы нейраминидазы, как Тамифлю (озельтамивир фосфат) тормо.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
SRA и PJ способствовали в равной степени как первые авторы.
Благодарности
Частичная поддержка грантами для MRS от естествознания и техники Научно-исследовательского совета Канады (NSERC), Гарри Botterell Фонда в области нейронаук, ARC, и Гарфилд Келли сердечно-сосудистых исследований и развития Фонда. SRA является получателем университета королевы премию исследований и Роберт Дж. Уилсон стипендий. PJ является получателем высшей премии королевы и Роберт Дж. Уилсон стипендий. А. Г. и С. являются получателями Высшей премии королевы. Ф. был удостоен стипендии Онтарио Высшее в области науки и технологий (OGSST). AG является получателем Франклин королевы стипендии Bracken Высшее. SA является получателем RS королевы стипендии Маклафлин Высшее.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | ||
| 4-MUNANA | Biosynth International, Inc | ||
| Фетальная телячья сыворотка | Hyclone | ||
| DakoCytomation, флуоресцентная среда для заключения препаратов | Dako | S3023 | 15 mL |
| Тамифлю (осельтамивира фосфат) | Hoffmann-La Roche AG |
Ссылки
- Amith, S. R. Neu1 desialylation of sialyl alpha-2,3-linked beta-galactosyl residues of TOLL-like receptor 4 is essential for receptor activation and cellular signaling. Cell Signal. 22, 314-324 (2010).
- Amith, S. R.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
