Введение. stephensi Эмбрионы для генерации устойчивых к малярии комаров

Краткое содержание

Anopheles stephensi комары являются переносчиками малярии населяющие Индию и по всей Азии. Это видео демонстрирует технику для выполнения микроинъекций этого вида с трансгенов которые придают устойчивость к малярии комаров. Большая часть методологии продемонстрировали в этом видео применима к микроинъекции методов других видов комаров.

Аннотация

Введение экзогенных генов в геноме комаров требует микроинъекции методов с учетом конкретных видов, представляющих интерес. Это видео демонстрирует протокол метод, используемый Джеймсом лаборатории microinject конструкций ДНК в эмбрионы Anopheles stephensi для генерации трансформированных комаров. Методы подготовки микроинъекции иглы, сбора и подготовки эмбрионов и выполнения микроинъекции проиллюстрированы.

Протокол

Подготовка заранее микроинъекции:

1. Кровь комаров кормить: для инъекций с понедельника по среду кормить самок на предыдущую пятницу. Чтобы придать четверг и пятницу, кормить самок на понедельник на той же неделе.
   
   
2. Подготовка Кварцевые иглы с помощью программы 2 и изотонического раствора (см. материалы).
   
   
3. "Укладка трубы" для эмбрионов регулярные культуры дрозофилы флаконе. Влажная вата в низу, с мокрыми диск фильтровальной бумаги ее освещении.
   
   
4. Подготовка пластического скольжения покрытие, придерживаясь двухсторонней ленты в один конец. Обрежьте ленту покровным стеклом так, что оно заканчивается на краю крышки скольжения.
   
   
5. Подготовка масло для высыхания.
   
   
6. Подготовка чашки Петри с изотоническим буфером для передачи эмбрионов для штриховки.

Настройка принудительного укладки:

1. Сбор крови 6-10 кормили самок с использованием аспиратора и передавать их на флаконе дрозофилы культуры с хлопком и фильтровальная бумага мокрая от изотонического буфера.
   
   
2. Комары затем поместить обратно в insectery условиях в темноте и позволили, чтобы отложить яйца в течение 1 ч и 15 мин.
   
   
3. Давайте взрослых летят в клетку и удалить фильтр диск бумаги с эмбрионами.
   
   
4. Для выстраиваются яйца, делать это под рассекает области. Сбор пучки яйца с тонкой кистью (Соболь, № 0000) и передача подготовленной квадрат 3MM ватмане пропитанный изотоническом буфере. Держите бумагу все время влажным. Не позволяйте яйца получить сухие. Удалить exochorion с кистью, это помогает лучше придерживаться яйца на ленту.
   
   
5. Использование тонких forcep № 5 или штраф кисть, подобрать темный серый эмбрионов и организовать в соответствии с квадратом 3 мм Whatman мокрым изотоническом буфере. Линия по сравнению с 20-30 эмбрионов. Все эмбрионы должны быть в той же ориентации, инъекция должна быть на заднем полюсе. Передний конец эмбрионов немного шире, чем задняя. Затем, используя полосы 3MM ватмане, сухой фильтр, где яйца выстроились нажав жесткий по обе стороны линии яйцо, не задевая яйца.
   
   
6. Для передачи яйца, инвертировать слайд, содержащий двусторонний скотч (медицина), и мягко давить яйца. Заднем конце яйца должны быть очень близко к краю двусторонний скотч. Влажность бумаги имеет решающее значение для этого, если он слишком влажный они не будут палки. Я высыхания эмбрионов от 5-10 секунды, но высыхание время зависит от влажности и температуры в микроинъекции комнате.
   
   
7. Сушка имеет решающее значение для яиц: немного слишком много, и эмбрионы не будут люк. Без высыхания ДНК не вдаваясь в зародыше.
   
   
8. Обложка сухие эмбрионов с галоидоуглеводородов масла, чтобы предотвратить дальнейшее высыхание.

Микроинъекции эмбрионы:

Наиболее важным аспектом хорошей инъекции качество иглы (см. примечание).

1. Заполните игла с ДНК раствор вводят с помощью microloader (Eppendorf 5242 # 956,003). Очень мало soliution инъекция необходима, от 1 до 2 мл.
   
   
2. Подключите иглы Эппендорф Transjector, которая контролирует времени впрыска и давления, а также противодавления. Микроинъекция выполняется с помощью микроскопа с движущейся этапе (Leica) при увеличении х 10 и микроманипулятора (Leica). Если необходимо, поднял столик микроскопа могут быть получены путем укладки 4-5 слайды микроскопом. Место проведения покровным стеклом эмбрионов на приподнятой сцене. Эмбрионы вводятся на 150 градусов; проникновение должно быть у заднего полюса. Для инъекций, я держу иглу стационарных и перемещать столик микроскопа. Когда игла новый, запечатанный наконечник и, как правило перерывы в первой инъекции. Я всегда получается давление, необходимое для изгнать маленькая капелька ДНК в нефти между каждой инъекции.
   
   
3. Я установил время впрыска до 0,2 - 0,9 сек и 1000 гПа, когда игла находится новое. Я меняться давление и время, пока маленькая капелька видна, выходящий из иглы в масле. Противодавление должно быть установлено около 100. Как иглы изнашивается, давление впрыска должна быть уменьшена держать низкие объемом впрыска (около 300 гПа). После этого кончик иглы слишком велик, и убивает большинство из эмбрионов.
   
   
4. После инъекции, удалять масла салфеткой и покрывают слайд с эмбрионами и место в чашке Петри с изотоническом буфере. Место блюда в insectory и оставить их там, пока эмбрионов люк. Они начинают выводятся через 2-6 дней. Передача личинки к дистиллированной воды с щепоткой земли пищу рыбу.

Примечания

ДНК для инъекций: плазмиды ДНК решение для инъекций выделяли с помощью плазмиды EndoFree комплект.Построить плазмиды и помощник плазмиды смешать в правильной концентрации, осаждали изопропанола. Осадок промывают 70% этанолом до ресуспендирования в инъекции буфера. Перед инъекцией, чистой ДНК с использованием Millex-GV колонке.

Izotonic буфера:

1,68 М NaCl - 88,3 мл 1,68 М NaCl - 2,9 м 1 М Hepes -10,7 мл 1,12 М CaCl 2 - 2,2 мл дН 2 O - 896 мл

ИЛИ

5 М NaCl - 29,67 мл 1 М KCl - 4,87 мл 1 М Hepes - 10,7 мл 1,12 М CaCl 2 - 2,2 мл дН 2 O - 952,56 мл

Отрегулируйте до рН 7,2

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Кварцевые иглы для инъекций		Sutter Instrument Co.		Внешний диаметр (O.D.) — 1.0 mm, внутренний диаметр (I.D.) — 0.70 mm, длина 10 cm; изготавливаются путем вытягивания капиллярной трубки с помощью микропипетного вытягивателя до получения кончика 3-8 µm со стержнем длиной примерно 100-300 mm.
Кварцевый вытягиватель	Инструмент	Sutter Instrument Co.	P-2000	Настройки: Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141
Набор для выделения плазмид EndoFree		Qiagen
Изопропанол
Колонка Millex-GV			SLGV RO4 NL	для очистки ДНК
ДНК конструкции				0.5 mg/ml
Хелперная плазмида				0.3 mg/ml
Раствор для инъекций	Буфер			1x раствор: 5mM KCl, 0.1mM фосфата натрия, pH 6.8
Изотонический буфер				см. рецепт в разделе протокола
Десикационное масло				Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27 (1:1). Тщательно перемешать. Приготовить до начала микроинъекций.
Кровь				для кормления комаров
Anopheles stephensi	Животное			Комары, самцы и самки.
Пробирка для культуры Drosophila				для откладки яиц
Чашки Петри				с изотоническим буфером, для вылупления эмбрионов
Тонкая кисть				соболь, № 0000
Бумага Whatman 3MM
Пинцет №5
Двусторонняя лента
Микролоадер		Eppendorf	5242 956.003
Трансьектор		Eppendorf
Микроскоп		Leica Microsystems		с перемещаемым столиком и микроманипулятором, при увеличении 10x