Введение. stephensi Эмбрионы для генерации устойчивых к малярии комаров

Краткое содержание

Anopheles stephensi комары являются переносчиками малярии населяющие Индию и по всей Азии. Это видео демонстрирует технику для выполнения микроинъекций этого вида с трансгенов которые придают устойчивость к малярии комаров. Большая часть методологии продемонстрировали в этом видео применима к микроинъекции методов других видов комаров.

Аннотация

Введение экзогенных генов в геноме комаров требует микроинъекции методов с учетом конкретных видов, представляющих интерес. Это видео демонстрирует протокол метод, используемый Джеймсом лаборатории microinject конструкций ДНК в эмбрионы Anopheles stephensi для генерации трансформированных комаров. Методы подготовки микроинъекции иглы, сбора и подготовки эмбрионов и выполнения микроинъекции проиллюстрированы.

Протокол

Подготовка заранее микроинъекции:

1. Кровь комаров кормить: для инъекций с понедельника по среду кормить самок на предыдущую пятницу. Чтобы придать четверг и пятницу, кормить самок на понедельник на той же неделе.
   
   
2. Подготовка Кварцевые иглы с помощью программы 2 и изотонического раствора (см. материалы).
   
   
3. "Укладка трубы" для эмбрионов регулярные культуры дрозофилы флаконе. Влажная вата в низу, с мокрыми диск фильтровальной бумаги ее освещении.
   
   
4. Подготовка пластического скольжения покрытие, придерживаясь двухсторонней ленты в один конец. Обрежьте ленту покровным стеклом так, что оно заканчивается н....

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Кварцевые иглы для инъекций		Sutter Instrument Co.		Внешний диаметр (O.D.) — 1.0 mm, внутренний диаметр (I.D.) — 0.70 mm, длина 10 cm; изготавливаются путем вытягивания капиллярной трубки с помощью микропипетного вытягивателя до получения кончика 3-8 µm со стержнем длиной примерно 100-300 mm.
Кварцевый вытягиватель	Инструмент	Sutter Instrument Co.	P-2000	Настройки: Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141
Набор для выделения плазмид EndoFree		Qiagen
Изопропанол
Колонка Millex-GV			SLGV RO4 NL	для очистки ДНК
ДНК конструкции				0.5 mg/ml
Хелперная плазмида				0.3 mg/ml
Раствор для инъекций	Буфер			1x раствор: 5mM KCl, 0.1mM фосфата натрия, pH 6.8
Изотонический буфер				см. рецепт в разделе протокола
Десикационное масло				Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27 (1:1). Тщательно перемешать. Приготовить до начала микроинъекций.
Кровь				для кормления комаров
Anopheles stephensi	Животное			Комары, самцы и самки.
Пробирка для культуры Drosophila				для откладки яиц
Чашки Петри				с изотоническим буфером, для вылупления эмбрионов
Тонкая кисть				соболь, № 0000
Бумага Whatman 3MM
Пинцет №5
Двусторонняя лента
Микролоадер		Eppendorf	5242 956.003
Трансьектор		Eppendorf
Микроскоп		Leica Microsystems		с перемещаемым столиком и микроманипулятором, при увеличении 10x