Методическая статья

Decellularization и Recellularization Целых Печень

21.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/2394

⸱

4 февраля 2011 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Engineering in Medicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Shriners Hospitals for Children

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

Перфузии decellularization это новый метод для получения целого леса печень, которая сохраняет внеклеточного матрикса органа состав и микроархитектуры. При этом, способ приготовления целого леса орган использованием decellularization перфузии и последующим репопуляции с гепатоцитов описывается. Функциональные и трансплантации печени трансплантаты могут быть получены с помощью этой техники.

Аннотация

Печень сложный орган, который требует постоянной перфузии для доставки питательных веществ и кислорода и удаления отходов, чтобы выжить 1. Усилия, направленные на воссоздание или имитировать печени микроструктуры с основания до подхода с использованием тканевой инженерии и микротехнологий методы не увенчались успехом до сих пор из-за этой конструкции задача. Кроме того, синтетические биоматериалы для создания лесов для печени приложений тканевой инженерии были ограничены в индукции регенерации тканей и ремонт в значительной степени из-за отсутствия конкретной ячейке связывающие мотивы, которые будут обеспечивать надлежащее клеточных функций 2. Decellularized родной ткани, такие сосуды 3 и кожи 4, с другой стороны нашли много применений в тканевой инженерии, а также оказывали практическое решение некоторых проблем. Преимущество decellularized родной матрицы является то, что он сохраняет в определенной степени, оригинальные композиции и микроструктуры, следовательно, повышения вложений клеток и реорганизация 5.

В этой работе мы описываем методы для выполнения перфузии-decellularization печени, такие, что интактной печени bioscaffold, который сохраняет структуру крупных кровеносных сосудов получается. Далее мы опишем методы recellularize этих bioscaffolds взрослых первичных гепатоцитах, создания трансплантата печени, что является функциональным в пробирке, и судно доступ к необходимым для трансплантации в естественных условиях.

Протокол

1. Печень Decellularization

  1. Урожай печени крыс с портальной вены с использованием катетеризации и 18 калибра катетер. Оставьте низшими и верхней полой вены открытым. Держите орган гидратированных в фосфатном буферном растворе (PBS) в 10-см чашке Петри.
  2. Настройка перфузии система, состоящая из 8-литровый резервуар, перистальтического насоса и пузырь ловушку.
  3. Заполните перфузии системы фосфатным буферным солевым раствором и сохранить это работает в течение 10 минут. Заполните PBS в 10-см чашку Петри и уменьшить расход фосфатным буферным солевым раствором до 1 мл / мин.
  4. Тщательно передачи собранных печени фосфатным буферным солевым заполнены 10-см Петри.
  5. Продолжайте перфузии PBS в течение ночи.
  6. Начало перфузии с 0,01% (м / о) додецилсульфата натрия (SDS) в дистиллированной воде в течение 5 минут.
  7. Заливать с PBS в течение 1 часа.
  8. Повторите шаги 1.6 и 1.7 еще три раза увеличивает время SDS перфузии до 10, 15 и 20 минут в каждый момент времени.
  9. Продолжить перфузии с 0,01% (м / о) SDS в течение 24 часов.
  10. Продолжить перфузии с 0,1% (м / о) SDS в течение 24 часов.
  11. Заливать с 0,2% (м / о) SDS на 3 часа.
  12. Заливать с 0,5% (м / о) SDS на 3 часа.
  13. Заливать дистиллированной водой в течение 15 минут.
  14. Заливать с 1% (м / о) Тритон Х-100 в дистиллированной воде в течение 30 минут, чтобы удалить какой-либо связаны нуклеиновых кислот.
  15. Для мытья печени decellularized матрицы (DLM), заливать с PBS в течение 2 часов.
  16. Дополнительно: резекцию всех долях, за исключением средней доле.
  17. Магазин DLM в чистом и запечатаны чашку Петри пропитанные PBS при 4 ° С до готовности для использования (рис. 1).
  18. Для стерилизации DLM: 1) Флеш DLM стерильной PBS, содержащего 0,1% (об. / об) надуксусной кислоты и 4% (объем / объем) этилового спирта и выдержать в течение 3 часов при температуре 4 ° С. 2) промыть стерильной PBS 2 раза. 3) Промыть стерильной PBS, содержащий 2% пенициллина стрептомицин, 10ug / мл гентамицина и 2,5 мкг / мл амфотерицина Б. Хранить decellularized печени в том же растворе при температуре 4 ° С до готовности использовать для recellularization экспериментов.

2. Recellularization из Decellularized печени Матрица

  1. Настройка перфузии система, которая состоит из перфузии камеры, перистальтического насоса и пузырь ловушку в стерильных условиях. Заполните перфузии система с 200 мл питательной среды, например, высокий уровень глюкозы в DMEM (Sigma), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Hyclone,), 100 U мл -1 пенициллина и 100 мкг мл -1 стрептомицин (Invitrogen).
  2. Место decellularized матрицы печени в перфузионной камере и подключить к DLM перфузии системе через портал канюли вены, когда насос работает на 5 мл / мин, чтобы избежать образования пузырьков воздуха.
  3. Разрешить перфузии среды, через DLM течение 30 минут.
  4. Изоляция первичных гепатоцитах из взрослой крысы, по крайней мере 90% жизнеспособность.
  5. Остановите поток в системе перфузии и медленно вводят 50 миллионов гепатоцитов (в 1-3 мл питательной среды) в системе перфузии через пузырь ловушку.
  6. Начало течения при 10 мл / мин и рециркуляции среды в течение 10 минут.
  7. Повторите шаги 2.5 и 2.6, пока в общей сложности 200 миллионов клеток вводятся в DLM (рис. 2) 6.
  8. После того как все клетки перфузии в DLM, собирать перфузат на четыре 50-мл центрифужные пробирки и центрифуги при 600 оборотов в минуту в течение 10 минут. Отменить супернатанты и собирать шариков в одну трубу. Определить количество клеток и жизнеспособность через трипанового синего исключения, чтобы определить эффективность посева.

3. In Vitro культуры трансплантата печени Recellularized

  1. Настройка перфузии система, которая состоит из перфузии камеры, перистальтического насоса, оксигенатор и пузырь ловушку в стерильных условиях (рис. 3). Заполните перфузии система с 50 мл питательной среды, например, E Уильямса (Sigma), 5% эмбриональной телячьей сыворотки (Hyclone,), 0,5 U мл -1 инсулина (Eli Lilly), 20 нг мл -1 EGF (Invitrogen) , 14 нг мл -1 глюкагона (Бедфорд Laboratories), 7,5 мкг мл -1 гидрокортизон (Pharmacia), 100 U мл -1 пенициллина и 100 мкг мл -1 стрептомицин (Invitrogen).
  2. Место recellularized трансплантата печени у перфузии камеры и подключить к DLM перфузии системе через портал канюли вены, когда насос работает на 5 мл / мин, чтобы избежать образования пузырьков воздуха.
  3. Асептических условиях близких перфузии камеры и плотно прилегают к исключить возможность утечки в культуре.
  4. Передача перфузии системы инкубаторе, что составляет 37 ° С и 10% CO 2 и увеличение скорости перфузии потока до 15 мл / мин.
  5. Подключение к оксигенатор 95% O 2 и 5% CO 2 баковых смесях газа и установить расход газа до 0,5 л / мин. Это должно достичь парциальное давление кислорода в приближенииtely 400 мм рт.
  6. Культура может продолжаться до 10 дней с ежедневными изменениями культуральной среде. Культуральной среде может производиться отбор проб в день в течение контроль функции печени трансплантата, таких как альбумин, мочевина и общей секреции желчных кислот. В конце периода культуре, привитой recellularized печени может производиться отбор проб для молекулярной и гистологического анализа.

4. Представитель Результаты:

Полный decellularization из печени крыс занимает около 72 часов с использованием описанных протокола. Результирующая матрица сохраняет 100% коллаген фибриллярные, 50% гликозаминогликанов и только 5% ДНК родной печени (табл. 1) 6. Сосудистые структуры матрицы сохраняется, о чем свидетельствует коррозии литья и сканирующей электронной микроскопии анализа (рис. 4) 6. Наличие сосудистых микроархитектуры в DLM облегчает его заселение с клетками с КПД 96% и его последующее перфузии для культуры в пробирке. Трансплантата recellularized печени может быть культурным до 10 суток в пробирке и отображает собственные функции печени, что подтверждается с помощью альбумина, мочевины и общего секреции желчных кислот (рис. 5) 6.

Рисунок 1
Рисунок 1. Decellularized печени матрицы в конце decellularization процесса. () Весь печени (б) средняя доля после резекции.

Рисунок 2
Рисунок 2. Схематическое изображение recellularization из DLM.

Рисунок 3
Рисунок 3. Перфузии настройки системы для экстракорпорального культура трансплантата печени recellularized.

Рисунок 4
Рисунок 4. Микрососудистых структура сохраняется в матрице печени decellularized. Коррозия изображения бросок) нормальной печени б) печень decellularized, портал (красный) и венозной (синий) сосудов. Сканирующей электронной микроскопии изображений DLM в) судно, г) раздел с участием желчных протоков, как мелких сосудов (стрелки), масштаб баров (а, б) 5 мм (в, г) 20 мкм.

Рисунок 5
Рисунок 5. Печень специфические функции recellularized трансплантата печени в течение в культуре перфузии пробирке. а) альбумин секреции (р = 0,5249), б) производство карбамида (р = 0,5271) и с) общего секреции желчных кислот (р = 0,0114). Статистический анализ различий между опытом и контролем было сделано за 10 период культуры г-испытатель Фридмана в = 0,01. Планки погрешностей представляют сем (п = 3).

Свежий Ливера Decellularized печени матрицы р-значения % Свежей печени
п = 4 п = 8
Коллаген 0,07 ± 0,01 0,08 ± 0,03 0,56 114%
(Мг в печени г)
Гликозаминогликаны 73,1 ± 6,7 34,2 ± 2,9 0,004 47%
(Мг в печени г)
ДНК 14,9 ± 5,6 0,44 ± 0,08 3.3 10 -5 2,9%
(Мг в печени г)

Таблица 1. Биохимического состава матрицы печени decellularized по сравнению с родной печени.
Значения представлены как среднее ± стандартная ошибка

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Метод перфузии decellularization описанные здесь производит целую печень эшафот с тем же валовой структуры и сосудистой микроархитектуры родной печени. Эшафот имеет внеклеточной матрицы составу похож на родной печени. Recellularization метода достигает репопуляции строительных лесов с клетками при высокой эффективности и клетки остаются жизнеспособными и функциональной в течение в пробирке культуру период испытания. С добавлением nonparenchymal клеток в трансплантат печени recellularized, мы представляем себе, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Джек Milwid для проектирования в камере перфузии пробирке. Эта работа была поддержана грантами из США NIH, R01DK59766 и R01DK084053 к М.Ю., R00DK080942 к КУ, США NSF конбет-0853569 в КУ и Shriners больницы для детей в БЭУ (грант №. 8503). Мы также признаем, поддержку и Shriners больницы для детей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Додецилсульфат натрияSigma-AldrichL4390
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Цифровой привод Masterflex L/SCole-ParmerEW-07523-80
Стандартная головка насоса Masterflex L/SCole-ParmerEW- 07013-81
Ловушка для пузырьковRadnoti Glass Technology Inc.130149

Ссылки

  1. Kulig, K. M., Vacanti, J. P. Hepatic tissue engineering. Transpl Immunol. 12, 303-310 (2004).
  2. Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nature biotechnology. 23, 47-55 (2005).
  3. Dahl, S. L., Koh, J., Prabhakar, V., Niklason, L. E. Decellularized native and engineered arterial scaffolds for transplantation. Cell Transplant. 12, 659-666 (2003).
  4. Schechner, J. S. Engraftment of a vascularized human skin equivalent. FASEB J. 17, 2250-2256 (2003).
  5. Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F., F, S. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).
  6. Uygun, B. E. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. , (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Исправление


Formal Correction: Erratum: Decellularization and Recellularization of Whole Livers
Posted by JoVE Editors on 3/14/2011. Citeable Link.

A correction was made to Decellularization and Recellularization of Whole Livers. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:

Nima Saeidi

instead of:

Nima Saedi.

Теги

in vitro

Похожие статьи