Методическая статья

Мигрирующие поведение клеток Сгенерировано за ганглиозные культур Высокопреосвященнейшего

13K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/2583

⸱

21 апреля 2011 г.

 ,  ,  , 
1Dept. of Anatomy, Physiology and Genetics, Uniformed Services University, 2Neuroscience Program, Uniformed Services University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Временной интервал визуализации 3D культуры ткани позволяет изучать миграционное поведение отдельных клеток, происходящих из ганглиозные возвышение в качестве реакции на фракционированного извлечения белка из коры головного мозга.

Аннотация

Миграция клеток общий процесс, который приводит к развитию и созреванию позвоночных центральная нервная система (Хаттен, 99). Кора головного мозга состоит из двух основных типов нейронов: возбуждающие и тормозящие. Эти клетки возникают в различных областях и мигрируют в коре по разным маршрутам (Перлман и соавт., 98). Ингибирующих интернейронов мигрировать касательной из подкорковых источников, главным образом из разных регионов ганглиозные возвышения (Гельман и др., '09;. Сю и др., '04.). Их движение требует точного пространственно-временной контроль введенных сигналами окружающей среды, чтобы обеспечить создание надлежащих cytoarchitecture и связи в коре головного мозга (Caviness и Ракич, '78; Хаттен, '90; Ракич, 90). Для изучения миграционного поведения клеток, генерируемых в пролиферативных зонах ганглиозные возвышения (GE) у новорожденных хорьков в пробирке мы использовали 3 мерных расположение культуры в BD Матригель Matrix. Культуры установка состояла из двух эксплантатах GE и источником белков испытания извлечены из коры головного мозга и адсорбированных на флуоресцентных латексных Retrobeads IX расположен между эксплантов (Hasling и др., '03;. Риддла и др., 97.). Через 2-3 дней культивирования клетки начинают появляться на краю эксплантов показывающий склонность оставить ткань в радиальном направлении. Живая изображений позволил наблюдения миграций без необходимости маркировки или маркировки клеток. При контакте с долей белка экстракт, полученный из коры изохронный хорька, GE клетки отображаться различное поведение чем можно судить по количественным кинетического анализа отдельных движущихся клеток.

Протокол

1. Подготовка реагентов

  1. Оттепель замороженных Матригель на льду, оставляя достаточно времени до начала эксперимента (не ускорит процесс, с помощью активного потепления). Матригель используется для создания 3D-среде напоминающий внеклеточного матрикса способствует миграции клеток. Она обеспечивает клетки как с подложкой и механическим тэгов. Матригель хранятся замороженными при температуре -20 ° C. Перед использованием, она должна быть постепенно доведена до температуры 0-4 ° С, т.е. талые на мокром льду или в холодильнике. Матригель необратимо наборы форме геля в температуре инкубации (37 ° С). Поэтому не рекомендуется для ускорения таяния путем погружения контейнера в теплой воде.
  2. Белковые фракции готовятся изоэлектрофокусировки (МЭФ) от общего извлечения белка из коры головного мозга постнатального день 0 (P0) хорька. После разделения фракций диализу в течение ночи против 20 мМ Трис-HCl pH7.2 для очистки экстрактов из буфера фокусировки составляющих, которые могут быть токсичными для тканей.
  3. Белки системы доставки. Белки, извлеченные из коры головного мозга адсорбируются на флуоресцентные бисером латекса, который затем медленно отпустите белков environment.We обнаружили, что флуоресценция функция помогает в визуальной обработке микросфер и позволяет легко обнаруживать даже минимальное внешние эффекты с сайта бусинка депозита, при наблюдении под флуоресцентным микроскопом.
    1. Добавить 10 мкл флуоресцентного бисера 100-200 мкл раствора белка
    2. Инкубируйте в течение 30 минут в темном при комнатной температуре на шейкере
    3. Спиновые бисером вниз скамье центрифуга для 1 час при максимальной скорости
    4. Удалить супернатант
    5. Повторное приостановить вихрь использованием 10 мкл свежей среды
    6. Добавить 30μl из Матригель чтобы подвеска, хорошо перемешать и поместить на лед.
  4. Буферы и СМИ
    1. Подготовка и фильтрационно-стерилизовать искусственного спинномозговой жидкости (aCSF; NaCl 124 мм, 26 мм NaHCO 3, NaH 2 PO 4 1,2 мм, 3,2 мм KCl, MgSO 4 1,2 мм, 2,4 мм CaCl 2, глюкоза 10 мм). Слякоть заморозки aCSF заранее, так что он готов на момент вскрытия тканей. Чтобы сделать это, поместите пластиковую колбу заполнена стерильной aCSF в морозильной камере -80 ° C. Монитор замерзания каждый так часто, поэтому, когда слой льда накапливается на внутренней стене, разбейте его и смешать с жидкостью. Повторяйте, пока колба содержит в основном ледяной слякоти. Буфер подготовлена ​​таким образом, не только поддерживает ткани выживания, но также проведет низкой температуре дольше, и механически менее вредны для ткани, чем коренастый кубиков льда.
    2. Подготовка Neurobasal среде с N-2 и B-27 добавки добавлены в соответствии с предложениями производителя, а также 1mg/100ml гентамицин, 2 мМ L-глутамина, и 0,6% глюкозы. Стерилизовать фильтрацией через 0.22μm мембраны. Должен находится в тепле при температуре 37 ° С до использования.
  5. Культура пластин
    1. Культура пластика шесть-луночных готовятся расставить каждую лунку в центре с небольшим количеством (около 2μl) холодной Матригель использованием 20 мкл пипетки, и размещение автоклавного круглый 18мм покровное стекло на каждой капле. Ни одна из пластин, ни покровные должны быть в противном случае культура рассматривается.

2. Ткань подготовки

  1. Получение ткани мозга
    1. После глубоко обезболивающим животное с Euthasol, удалить мозг и поместить его в ледяной aCSF
    2. Отдельные полушарий с помощью скальпеля и нарезать коронки на 500 мкм с помощью устройства выбора, собирая срезы в небольшое блюдо содержащих ледяной aCSF
  2. Создание эксплантов (использование рассекает микроскопом)
    1. Определить ломтиками содержащие ганглиозные возвышения (GE) и отделка зон коры головного мозга, которые могут виться по GE и мешают дальнейшим шагам
    2. Пресс Харриса Uni процессоров нес в районе, недалеко от желудочковой поверхности GE, отказаться ядро, содержащее преимущественно желудочковой зоны, и изгнать его с плунжером в ледяной среде (рис. 1). Три-четыре эксплантатов 0,5 мм в диаметре могут быть сделаны из GE в одном P0 срез мозга хорька. Пожалуйста, обратите внимание, что в обоих грызунов и хорьков, средние и боковые ГЭС слиты в этом возрасте. Если ядро остается в часть или прилипла к пластиковым дно тарелки, мобилизовать его, впрыскивая aCSF с кончика пипетки и передачи с пипетки в блюдо с холодной Neurobasal среды. Держите блюдо на льду.
    3. Передача партии эксплантатов из среды в большой капли ледяной Матригель (около 0,25 0,5 мл) помещают в отдельную посуду, заботясь, чтобы у эксплантов полностью погружен и избежать пузырей. Держите блюдо на льду. Размер партии зависит от скорости рабочий процесс вниз по течению.

3. Культура установки (использование рассекает микроскопом)

  1. Всегда держите Матригель и Матригель содержащих смесей на лед, чтобы избежать лечения.
  2. Remix бусины подвески и место 1-2μl или менее борта подвеску в ледяной Матригель в центре стекло покровное, ранее помещенных в культуру пластину и использованием 20 мкл кончиком пипетки. Пусть это набор маленьких, во избежание высыхания.
  3. Использование 20 мкл кончиком пипетки подобрать 2 эксплантов из раскрывающегося Матригель и разместите их в желаемом районе бусинка депозита (по крайней мере 1 мм от края депозита) симметрично с противоположных сторон. Пусть это множество не более чем на 5 минут при комнатной температуре. Правильное время шагов б, имеет решающее значение. Если времени слишком мало, это приведет к неполной гелеобразования и компонентов культуры установка будет двигаться, когда они покрыты слоем окончательного Матригель, если время слишком долго это может привести к чрезмерной сушки геля, а также создание физических барьеров, препятствующих свободному передвижению клеток.
  4. Обложка бисером и эксплантов с плоским слоем около 30μl из Матригель, расширяя его за пределы эксплантов (рис.2). Пусть он установлен в инкубаторе в течение приблизительно 15 минут.
  5. Добавить 2 мл Neurobasal среде с добавками.
  6. Инкубировать при 37 ° С в 5% CO 2 / 95% O 2 мониторинг миграционной активности ежедневно.

4. Живая изображений

  1. После инкубации в течение 3-4 дней, обзор культуре тарелки и выбирать покровные интересов. Эксплантов должны генерировать радиально равномерного облака клеток. Замените выбрали покровных в свежем планшета для культуры, которая будет использоваться в живых изображений.
  2. Пусть покровные сидеть в новой пластинкой в ​​течение ночи. Прежде чем поместить пластинку на микроскоп для работы с изображениями, в капоте культуре клеток, использование стерильного шпателя для перемещения покровного стекла для того, чтобы выпускать любые микропузырьков, которые собирают между покровным и пластины культуре клеток. Вмешательство пузыри испортит изображение. Перемещение покровные к центру хорошо.
  3. Для предотвращения испарения, заполнить пространство между ямами с водой.
  4. Тщательно передачи пластины из капота культуре клеток к микроскопу, чтобы не двигаться покровные от центра хорошо.
  5. Определить изображений схеме с использованием обработки изображений. Благодаря 3D характер культуры установки клетки также перемещаться по вертикали, поэтому важно собирать Z-плоскостях охватывающей всю глубину миграции облака. Степени ХУ отображаемого области должны быть также установлен достаточно большой, чтобы охватить области прогнозируется на уровне населенных мигрирующих клеток в ходе записи, а также содержат бусинка депозит, чтобы записать угловой ориентации эксплантов и мигрирующих клеток по отношению к Источником белка. Также учитывать, что чем больше отображаемого Z самолетов, или более площадь, тем больше времени требуется для записи цикла в конкретный момент времени, заставляя больше временных интервалов между образцов и потеря временное разрешение клеточных слежения. В нашем случае, используя 10-кратный цели, оптимальная схема была 3x3 записи плитка для каждого из 10 самолетов Z-через каждые 20 мкм, с интервалом в 30 мин. Мы обнаружили, каждые 30 мин длинный, что позволяет однозначно идентифицировать клетки в последовательные моменты времени, которое имеет решающее значение для надежного отслеживания их движения.
  6. Инициировать изображений промежуток времени.
  7. После нужное время, удалить пластину и закрепите культур в 4% с фосфатным буфером параформальдегида. Он может быть использован для дальнейшего морфологического и иммуноцитохимического анализа.

5. Анализ движения

  1. Преобразование время записи серии снимков в формате наиболее удобном для дальнейшей обработки, TIFF является наиболее портативным один.
  2. Трек движение отдельных клеток с течением времени при записи координат XY. Это может быть сделано с помощью свободно доступного программного обеспечения, как ImageJ (NIH) с ручного отслеживания плагин, или любые другие коммерческие приложения, такие как ImagePro, Volicity или AutoQuant.
  3. Участок треков с помощью Excel или в собственной разработки программного обеспечения.
  4. Для каждой ячейки гусеничных расчета кинетических параметров, таких как средняя скорость, искривление пути, направленной изменчивости во времени, ветвление, отклонение в сторону источника белков и т.д. Расчет может быть сделано в MS Excel или эквивалентного таблицы. Наш опыт показывает, однако, что гораздо более продуктивно развиваться в доме-скриптов (с использованием R, Matlab, Python, Perl или другие, в основном Открытое языках Source), так как они позволяют более гибкой настройки и включения более сложные аналитические методы, чем те, доступны в базовой установки Excel.

6. Представитель Результаты:

Рисунок 1
Рисунок 1. Схема анатомического оригип эксплантов. Это рисунок короны кусочек hemisected мозга хорька. Серые круги указывают на область, из которой эксплантов были приняты.

Рисунок 2
Рисунок 2. Схема установки культуры. Депозит бусина является источником белков; эксплантов помещаются в любую сторону, и все элементы покрыты Матригель.

Рисунок 3
Рисунок 3. Корреспондент участки клеточных треки окрашены квадранта (стрелки указывают на борт депозита). Клетка треков на право миграции в сторону часть D, который, как представляется привлечение клеток, клетки слева миграции в сторону фракция, которая появляется, чтобы отразить мигрирующих клеток.

Рисунок 4
Рисунок 4. ) Серии изображений из выбранных timepoints показывает растущее облако клетки мигрируют из эксплантов. Например клетки, указанном стрелкой, отслеживается во времени, как указано ниже (линейка 200 мкм). Это был эксплантов визуализированы с живыми изображениями в течение 38 ч. Здесь показаны изображения клеток, оставляя эксплантов с начала записи изображения в конечное изображение. B) клетка, указанных в части в то время, указано. Ячейка показывает повторяющиеся ветвления (шкалы 50 мкм).

Обсуждение

Здесь мы приведем простой системы для исследования и анализа миграционное поведение нервных клеток в ответ на химические сигналы. В анализах пробирке миграции были использованы для идентификации молекул, влияющих внеклеточной передвижения клеток. Наша парадигма гарантирует, что каждая отдельная клетка изучал имеет 3-мерные (3D) окружающей среды, с которой, чтобы взаимодействовать. Это значительное преимущество по сравнению с культурами, где клетки мигрируют из эксплантов вынуждены двигаться по ровной поверхности поли-D-лизин покрытием покровное, таким образом, лишенные взаимодействия с внеклеточного матрикса (например, Hirschberg др. '10;. 8. Метин и соавт. '07). Однако в отношении более крупных масштабах отслеживания миграции клеток, остается 2-мерных, как клетки вертикально вынужден пространство между покровным стеклом на дне и верхней поверхности Матригель, которое является относительно мала по сравнению с горизонтальной свободы миграции. Такая установка позволяет упростить анализ движения, которые до сих пор остается в основном 2-мерной. Подобные 3D парадигм, состоящий из эксплантов GE или повторно агрегатов клеток GE встроенные в коллаген или Матригель, которые ранее были заняты, с использованием агрегатов клеток, экспрессирующих частности сигнальный белок как источник химических сигналов (например, Liodis др. '07;. Мартини и др. .. др. '09;. Нобрега-Перейра и др. '08; Вихтерле др. '03).. Метод, изложенный здесь, использует медленные системы выпуска в виде бус латекса с наклеенными белков, чтобы обеспечить устойчивый уровень в местной среде, что выше, чем белки добавлять непосредственно в среде, что делает систему особенно удобно, когда количество доступных белка ограничено или когда сложную смесь белков испытания. Выбор из бисера не ограничивается латексной основе продуктов, и включает в себя также другие материалы, например, агарозном бисера, каждый с различными характеристиками. Для дальнейшего повышения плотности теста, мы использовали два эксплантов соединенный с бисером депозит на противоположных сторонах. Для обеспечения определенной области происхождения, мы использовали ганглиозные эксплантов возвышения как источник клеток. Мы оценили различия в медиальной и латеральной части ганглиозные возвышения, но не видит никаких различий. Следует отметить, что это исследование использует хорьков, у этого вида медиальной и латеральной ганглиозные возвышения предохранитель раньше, чем у грызунов (получ и др. '08.). В то время культур были сделаны (P0) средние и боковые ганглиозные возвышения были сплавлены, хотя многие клетки коры головного мозга заполнения по-прежнему генерируется и миграции. Однако, если по-настоящему однородной источником клеток является предпочтительным, клеточной суспензии могут быть приготовлены из расчлененных ткани и непосредственно смешивать с Матригель, или же остановлен и Полученный осадок кулаками, чтобы сделать "эксплантов. Использование ферментативного переваривания ткани для подготовки суспензии клеток не рекомендуется, потому что даже остаточные следы протеолитической активности можно сжижать Матригель в течение эксперимента. Кроме того, аудит должен быть применен к сроков культуры установки. Хотя Матригель требует период потепления к полимеризации, даже слегка длительного воздействия малых капель Матригель (как это используется в данном протоколе) для воздуха вызывает сушка и результаты в оболочку, которая непроницаема для миграции клеток и которые не могут быть стерты последующим покрытием со свежими Матригель.

Раскрытие информации

Животное использование: Все процедуры, связанные с животными проводились в соответствии с USUHS и NIH институциональных принципов и одобрен USUHS IACUC.

Благодарности

Эта работа была поддержана МО Грант PT074620 (SLJ) и NIH Грант R01NS245014 (SLJ).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге Комментарии (необязательно)
Neurobasal Средняя (1X), жидких Invitrogen 21103-049
N-2 Дополнение (100X), жидких Invitrogen 17502-048
B-27 Дополнение (50х) Invitrogen 0080085-SA
BD Матригель базальной мембраны Матрица BD Biosciences 354234
Харриса Uni-Core, 0,5 размера Электронная микроскопия наук 69036-05 Удар отверстием
Зеленый Retrobeads IX Lumafluor, Inc Латексные микросферы

Ссылки

  1. Caviness, V. S. Jr, Rakic, P. Mechanisms of cortical development: a view from mutations in mice. Annu. Rev. Neurosci. 1, 297-326 (1978).
  2. Gelman, D. M., Martini, F. J., Nóbrega-Pereira, S., Pierani, A., Kessaris, N., Marín, O. The embryonic preoptic area is a novel source of cortical GABAergic interneurons. J. Neurosci. 29, 9380-9389 (2009).
  3. Hasling, T. A., Gierdalski, M., Jablonska, B., Juliano, S. L. A radialization factor in normal cortical plate restores disorganized radial glia and disrupted migration in a model of cortical dysplasia. Eur. J. Neurosci. 17, 467-780 (2003).
  4. Hirschberg, A., Deng, S., Korostylev, A., Paldy, E., Costa, M. R., Worzfeld, T., Vodrazka, P., Wizenmann, A., Götz, M., Offermanns, S., Kuner, R. Gene deletion mutants reveal a role for semaphorin receptors of the plexin-B family in mechanisms underlying corticogenesis. Mol. Cell Biol. 30, 764-780 (2010).
  5. Hatten, M. E. Riding the glial monorail: a common mechanism for glial-guided neuronal migration in different regions of the developing mammalian brain. Trends Neurosci. 13, 179-184 (1990).
  6. Hatten, M. E. Central nervous system neuronal migration. Annu. Rev. Neurosci. 22, 511-539 (1999).
  7. Liodis, P., Denaxa, M., Grigoriou, M., Akufo-Addo, C., Yanagawa, Y., Pachnis, V. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. J. Neurosci. 27, 3078-3089 (2007).
  8. Métin, C., Alvarez, C., Moudoux, D., Vitalis, T., Pieau, C., Molnár, Z. Conserved pattern of tangential neuronal migration during forebrain development. Development. 134, 2815-2827 (2007).
  9. Martini, F. J., Valiente, M., López Bendito, G., Szabó, G., Moya, F., Valdeolmillos, M., Marín, O. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. , 136-1341 (2009).
  10. Nóbrega-Pereira, S., Kessaris, N., Du, T., Kimura, S., Anderson, S. A., Marín, O. Postmitotic Nkx2-1 controls the migration of telencephalic interneurons by direct repression of guidance receptors. Neuron. 59, 733-745 (2008).
  11. Pearlman, A. L., Faust, P. L., Hatten, M. E., Brunstrom, J. E. New directions for neuronal migration. Curr. Opin. Neurobiol. 8, 45-54 (1998).
  12. Poluch, S., Jablonska, B., Juliano, S. L. Alteration of interneuron migration in a ferret model of cortical dysplasia. Cereb Cortex. 18, 78-92 (2008).
  13. Rakic, P. Principles of neural cell migration. Experientia. 46, 882-891 (1990).
  14. Riddle, D. R., Katz, L. C., Lo, D. C. Focal delivery of neurotrophins into the central nervous system using fluorescent latex microspheres. Biotechniques. 23, 928-937 (1997).
  15. Wichterle, H., Alvarez-Dolado, M., Erskine, L., Alvarez-Buylla, A. Permissive corridor and diffusible gradients direct medial ganglionic eminence cell migration to the neocortex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 727-732 (2003).
  16. Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. J. Neurosci. 24, 2612-2622 (2004).

Перепечатки и разрешения

Теги

Миграция клетоккора головного мозгатаймлапс-визуализациякультура тканейбелковая фракцияфлуоресцентные микросферыматрикс Matrigelсветлопольный микроскопкинетический анализ
Мигрирующие поведение клеток Сгенерировано за ганглиозные культур Высокопреосвященнейшего
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.