$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Клонирование Соображения
- Коммерчески подготовленные олигонуклеотиды представляющих интерес TMD окружении NheI и сайтах BamHI ограничения и 5'-фосфорилированных можно лигируют pTox7 (изменение в нашей лаборатории вставки одной пары оснований непосредственно после сайта BamHI ограничение 14) (рис. 3) усваивается последовательно с BamHI и NheI. Например олигонуклеотидных приведен ниже:
5'ctagcTMDSEQUENCEg3 '
3 'gTMDSEQUENCEcctag5'
TMD последовательность должна быть 12-24 остатков (короткие последовательности, предположительно, будет удлиненный векторными закодированные остатков гидрофобных). Для того чтобы исследовать интерфейс, четыре варианта дизайна ПРО ТВД должна быть создана последовательная, где вставки остатков и сопутствующей остаток удаление приводит к вращению TMD относительно ToxR. 15,16 Наконец, концентрации арабинозы должны варьироваться от 0,001 до 0,01% (м / о) для определения концентрации, где максимальные различия в β-галактозидазы сигналов между различными TMD последовательности наблюдается; тестирования различных уровней выражение рекомендуется определить условия, при которых различные сходства можно выделить лучших. В дополнение к арабинозы и антибиотиков, 0,4 мМ IPTG может быть использован для повышения различия родства между различными TMDS. Измерение ToxR должно быть выполнено по крайней мере в четырех экземплярах. Вся процедура должна быть повторена по крайней мере в три раза с разными плазмиды преобразований.
2. Рост бактериальных культур
- Аккуратно оттепели FHK12 компетентных клеток (200 мкл) на льду и передачи в 15 мл в пробирку. Добавить ДНК плазмиды (200 нг) и инкубировать клетки на льду в течение 30 мин.
- Теплового шока клеток инкубации в течение 90 с при 42 ° C, с последующей инкубацией на льду в течение 2 мин.
- Добавить SOC СМИ (800 мкл) и инкубировать образцов при 37 ° C при встряхивании (300 оборотов в минуту) в течение одного часа
- Привить 5 мл LB среды с хлорамфеникол (30 мкг / мл) и арабинозы (0,0025% м / о) с 50 мкл преобразования смеси в 15 мл культуры труб в трех экземплярах. Инкубируйте образцы при температуре 37 ° C при встряхивании (300 оборотов в минуту) в течение 20 ч. (В качестве альтернативы 5 мкл культуры может быть использован для инокуляции 100 мкл среды в 96-луночного планшета. Этот метод полезен при работе с большим количеством образцов, хотя ошибки будут несколько выше. Во избежание испарения, которые привели бы к ошибке, заполните внешний скважин со средствами массовой информации, но не используют их для образцов. Наконец, дважды обернуть сустав между крышкой и пластиной с парафильмом).
3. Измерение β-галактозидазы
- Разогреть пластины для считывания до 28 ° C.
- Передача Z-буфера в резервуар с большим кончиком пипетки, убедившись, что только занимают верхние (водный) слой. Передача 100 мкл свежеприготовленного Z-buffer/chloroform в лунки 96-луночного планшета. Передача 5 мкл каждой культуры в лунки пластины в четырех экземплярах. Пропустить культуры из четырех скважин, которые будут служить пустым.
- Измерить диаметр 595 пластины, чтобы определить плотность клеток.
- Добавить 50 мкл Z-buffer/SDS во все лунки пластины. Встряхните пластины в пластинчатых читателя в течение 10 мин, чтобы лизировать клетки. Убедитесь, что клеточные суспензии ясны после лизиса и повторить пожимая шаг, если требуется. Неполное лизис предлагает Z-buffer/chloroform не свежеприготовленной.
- Добавить 50 мкл свежеприготовленного Z-buffer/ONPG во все лунки и вернуть пластину к пластине читателя и измерить диаметр 405 каждые 30 секунд в течение 20 мин.
- Рассчитать β-галактозидазы, используя следующее уравнение (напомним, вычесть пустым). Отношение OD 405 / мин следует рассчитывать с использованием всех точек данных в диапазоне 405 OD 0,0 до 1,0 с помощью линейного подходят модели.
Миллер единицы отличаются иногда, когда записанные в разные дни. Таким образом, ссылки построить как ГПД следует измерять в каждом тесте. Его значения могут быть использованы для нормализации ToxR ценностей.
4. Контроль за экспрессию белка
- Выполните западных промокательной проверить даже экспрессии белка между конструкциями. Комбинат 50 мкл трех экземплярах культур и центрифуги (2000 оборотов в минуту, 4 мин) в микроцентрифужных. Удаляют супернатант пипетки и ресуспендируйте остаточных осадок в 2 х буфера загрузки образца.
- Нагрузка 7,5 мкл на стандартный 8% геля и проведение electrophoreses при 125 V в течение 1 часа 5 мин. После передачи, инкубировать с анти-MBP HRP-конъюгированных антител и визуализации; химерных белков наблюдается приблизительно в 70 кДа с некоторыми продуктами разложения иногда рассматривается около 48 кДа. Эндогенные MBP наблюдается также в 45 кДа (рис. 5).
5. Контроль за Правильная вставка Мембранные
Клеточная линия дефицит мальтозу связывающий белок используется для оценки надлежащего вставки оболочки химерных построить ПРО ТВД. При росте на средах с минимальным мальтозы в качестве единственного источника углерода, только клетки, экспрессирующие мембрана-интеграла продукт выражение с мальтозу связывающий белок правильно расположены периплазме способны расти.
- Преобразование PD28 клеток (как описано для FHK12 клеток) и привить 2 мл LB среды. Рост клеток при 37 ° C при встряхивании (300 оборотов в минуту) в течение ночи.
- Гранул клетки центрифугированием при 3500 оборотов в минуту, 10 мин, 4 ° С и стирать ресуспендирования в PBS (2 мл), осторожно пипеткой с большим наконечником или нежный вортексе. Гранул клеток (см. выше), мытье с PBS во второй раз, пеллет и, наконец, ресуспендируют в PBS (1 мл).
- Используйте 25 мкл ресуспендировали клетки привить 5 мл минимальные средства массовой информации в трех экземплярах и инкубировать при температуре 37 ° C при встряхивании (300 оборотов в минуту). Возьмите OD 595 показания между 15-25 ч, примерно каждые 2 часа путем перевода 200 мкл каждого образца в 96-луночного планшета и чтения с помощью пластин-ридера.
6. Представитель Результаты:
Пример использования ToxR транскрипционный анализ репортер проанализировать олигомеризации склонность трансмембранных доменов в показано на рисунке 4. Ранее мы исследовали олигомеризации трансмембранных доменов из multispanning мембрана-интеграла мембранный белок скрытая белка-1 (LMP-1) различными методами, в том числе ToxR 14 трансмембранных домена пять (ТМ5) было показано, демонстрируют сильную склонность к oligomerize. Об этом свидетельствует высокая единиц Миллер, сравнимой с положительным контролем, ГПа, устоявшихся dimerizing последовательности. Вредные мутации в ТМ5, D150A, снижает способность последовательности oligomerize. LMP-1 TM1 существенно не oligomerize и экспонаты очень низкой Миллер Группа сигнал, чуть выше сигнала для пустой, нетрансформированных FHK12 клеток.
Рисунок 1. Мультфильм изображающий анализа ToxR репортер. Трансмембранного домена (ПРО ТВД) приводом олигомеризации приводит к димеризации ToxR и активации транскрипции LacZ. Ген продукт LacZ, β-галактозидазы может быть определена количественно, как мера склонности к ПРО ТВД oligomerize.
Рисунок 2. Гидролитического расщепления ONPG по β-галактозидазы результатов в производстве поглощающий свет видов о-nitrophenolate (ОНП).
Рисунок 3. Плазмиды карта pToxR7.
Рисунок 4. Представителю ToxR транскрипционного анализа репортер анализа олигомеризации склонность латентный мембранный белок-1 трансмембранных доменов. Трансмембранного домена 5 (ТМ5) oligomerizes сильно, в то время трансмембранного домена 1 (TM1) имеет лишь слабое взаимодействие. Мутация D150A в ТМ5 значительно снижает его способность oligomerize. ГПД входит в качестве позитивного шага управления для сильных димеризации. Пустые представляет непреобразованных FHK12 клеток.
Рисунок 5. Иммуноблоттинга для экспрессии белка.
Рисунок 6. PD28 дополнения анализа для контроля за правильным вставки мембраны периплазме. Отрицательный контроль представляет построить дефицит мальтозу связывающий белок.