Эффективная процедура для оценки олигомеризации склонность однопроходный трансмембранных доменов (TMDS) описывается. Химерные белки, состоящие из TMD слит с ToxR выражаются в репортеру штамма E.coli. TMD-индуцированной олигомеризации причины димеризации ToxR, активации транскрипции и производства репортер белка,-галактозидазы.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Трансмембранного домена олигомеризации склонность определяется Пробирной ToxR
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Упрощенное представление о трансмембранных доменах белков как о простых «якорях» в фосфолипидных бислоях давно было опровергнуто. Во многих случаях мембранные белки выработали высокосложные механизмы действия.1-3 Один из способов, с помощью которого мембранные белки могут модулировать свою структуру и функции, — это прямой и специфический контакт гидрофобных спиралей, приводящий к образованию структурированных трансмембранных олигомеров.4,5 Значительная часть последних работ была сосредоточена на распределении аминокислот, которые преимущественно встречаются в мембранном окружении по сравнению с водным раствором, а также на различных межмолекулярных силах, стимулирующих ассоциацию белков.6,7 Тем не менее, исследования молекулярного распознавания в трансмембранных доменах белков все еще отстают от исследований водорастворимых областей. Основным препятствием остается следующее: несмотря на поразительную специфичность и аффинность, которых может достичь трансмембранная олигомеризация,8 прямое измерение их ассоциации затруднено. Традиционные методологии, применяемые для изучения функции интегральных мембранных белков, могут быть ограничены присущей исследуемым последовательностям нерастворимостью. Биофизические данные, полученные при изучении синтетических пептидов, представляющих трансмембранные домены, могут дать полезное представление о структуре. Однако биологическая релевантность систем с детергентными мицеллами или липосомами, используемых в этих исследованиях для имитации клеточных мембран, часто ставится под сомнение: принимают ли пептиды нативную структуру в этих условиях и действительно ли их функциональное поведение отражает механизм действия внутри нативной мембраны? Для изучения взаимодействий трансмембранных последовательностей в естественных фосфолипидных бислоях лаборатория Лангоша разработала анализы с использованием ToxR-транскрипционного репортера.9 Интересующий трансмембранный домен экспрессируется в виде химерного белка с мальтозосвязывающим белком для локализации в периплазме и ToxR для сообщения об уровне олигомеризации (Рисунок 1).
За последнее десятилетие несколько других групп (например, Engelman, DeGrado, Shai) дополнительно оптимизировали и применяли этот репортерный анализ ToxR.10-13 Различные варианты анализа ToxR стали «золотым стандартом» для проверки белок-белковых взаимодействий в клеточных мембранах. В данной работе мы демонстрируем типичный ход эксперимента, проводимого в нашей лаборатории, который в основном следует протоколам, разработанным Langosch. Этот общеприменимый метод полезен для анализа самоассоциации трансмембранных доменов в E. coli, где продукция β-галактозидазы используется для оценки склонности ТМД к олигомеризации. При индуцированной ТМД димеризации ToxR связывается с промотором ctx, вызывая ап-регуляцию гена LacZ, кодирующего β-галактозидазу. Колориметрический сигнал получают путем добавления ONPG к лизированным клеткам. Гидролитическое расщепление ONPG β-галактозидазой приводит к образованию поглощающего свет соединения о-нитрофенолята (ONP) (Рисунок 2).
Протокол
1. Клонирование Соображения
- Коммерчески подготовленные олигонуклеотиды представляющих интерес TMD окружении NheI и сайтах BamHI ограничения и 5'-фосфорилированных можно лигируют pTox7 (изменение в нашей лаборатории вставки одной пары оснований непосредственно после сайта BamHI ограничение 14) (рис. 3) усваивается последовательно с BamHI и NheI. Например олигонуклеотидных приведен ниже:
5'ctagcTMDSEQUENCEg3 '
3 'gTMDSEQUENCEcctag5'
TMD последовательность должна быть 12-24 остатков (короткие последовательности, предположительно, будет удлиненный векторными закодированные остатков гидрофобных). Для того чтобы исследовать интерфейс, четыре варианта дизайна ПРО ТВД должна быть создана последовательная, где вставки остатков и сопутствующей остаток удаление приводит к вращению TMD относительно ToxR. 15,16 Наконец, концентрации арабинозы должны варьироваться от 0,001 до 0,01% (м / о) для определения концентрации, где максимальные различия в β-галактозидазы сигналов между различными TMD последовательности наблюдается; тестирования различных уровней выражение рекомендуется определить условия, при которых различные сходства можно выделить лучших. В дополнение к арабинозы и антибиотиков, 0,4 мМ IPTG может быть использован для повышения различия родства между различными TMDS. Измерение ToxR должно быть выполнено по крайней мере в четырех экземплярах. Вся процедура должна быть повторена по крайней мере в три раза с разными плазмиды преобразований.
2. Рост бактериальных культур
- Аккуратно оттепели FHK12 компетентных клеток (200 мкл) на льду и передачи в 15 мл в пробирку. Добавить ДНК плазмиды (200 нг) и инкубировать клетки на льду в течение 30 мин.
- Теплового шока клеток инкубации в течение 90 с при 42 ° C, с последующей инкубацией на льду в течение 2 мин.
- Добавить SOC СМИ (800 мкл) и инкубировать образцов при 37 ° C при встряхивании (300 оборотов в минуту) в течение одного часа
- Привить 5 мл LB среды с хлорамфеникол (30 мкг / мл) и арабинозы (0,0025% м / о) с 50 мкл преобразования смеси в 15 мл культуры труб в трех экземплярах. Инкубируйте образцы при температуре 37 ° C при встряхивании (300 оборотов в минуту) в течение 20 ч. (В качестве альтернативы 5 мкл культуры может быть использован для инокуляции 100 мкл среды в 96-луночного планшета. Этот метод полезен при работе с большим количеством образцов, хотя ошибки будут несколько выше. Во избежание испарения, которые привели бы к ошибке, заполните внешний скважин со средствами массовой информации, но не используют их для образцов. Наконец, дважды обернуть сустав между крышкой и пластиной с парафильмом).
3. Измерение β-галактозидазы
- Разогреть пластины для считывания до 28 ° C.
- Передача Z-буфера в резервуар с большим кончиком пипетки, убедившись, что только занимают верхние (водный) слой. Передача 100 мкл свежеприготовленного Z-buffer/chloroform в лунки 96-луночного планшета. Передача 5 мкл каждой культуры в лунки пластины в четырех экземплярах. Пропустить культуры из четырех скважин, которые будут служить пустым.
- Измерить диаметр 595 пластины, чтобы определить плотность клеток.
- Добавить 50 мкл Z-buffer/SDS во все лунки пластины. Встряхните пластины в пластинчатых читателя в течение 10 мин, чтобы лизировать клетки. Убедитесь, что клеточные суспензии ясны после лизиса и повторить пожимая шаг, если требуется. Неполное лизис предлагает Z-buffer/chloroform не свежеприготовленной.
- Добавить 50 мкл свежеприготовленного Z-buffer/ONPG во все лунки и вернуть пластину к пластине читателя и измерить диаметр 405 каждые 30 секунд в течение 20 мин.
- Рассчитать β-галактозидазы, используя следующее уравнение (напомним, вычесть пустым). Отношение OD 405 / мин следует рассчитывать с использованием всех точек данных в диапазоне 405 OD 0,0 до 1,0 с помощью линейного подходят модели.
Миллер единицы отличаются иногда, когда записанные в разные дни. Таким образом, ссылки построить как ГПД следует измерять в каждом тесте. Его значения могут быть использованы для нормализации ToxR ценностей.
4. Контроль за экспрессию белка
- Выполните западных промокательной проверить даже экспрессии белка между конструкциями. Комбинат 50 мкл трех экземплярах культур и центрифуги (2000 оборотов в минуту, 4 мин) в микроцентрифужных. Удаляют супернатант пипетки и ресуспендируйте остаточных осадок в 2 х буфера загрузки образца.
- Нагрузка 7,5 мкл на стандартный 8% геля и проведение electrophoreses при 125 V в течение 1 часа 5 мин. После передачи, инкубировать с анти-MBP HRP-конъюгированных антител и визуализации; химерных белков наблюдается приблизительно в 70 кДа с некоторыми продуктами разложения иногда рассматривается около 48 кДа. Эндогенные MBP наблюдается также в 45 кДа (рис. 5).
5. Контроль за Правильная вставка Мембранные
Клеточная линия дефицит мальтозу связывающий белок используется для оценки надлежащего вставки оболочки химерных построить ПРО ТВД. При росте на средах с минимальным мальтозы в качестве единственного источника углерода, только клетки, экспрессирующие мембрана-интеграла продукт выражение с мальтозу связывающий белок правильно расположены периплазме способны расти.
- Преобразование PD28 клеток (как описано для FHK12 клеток) и привить 2 мл LB среды. Рост клеток при 37 ° C при встряхивании (300 оборотов в минуту) в течение ночи.
- Гранул клетки центрифугированием при 3500 оборотов в минуту, 10 мин, 4 ° С и стирать ресуспендирования в PBS (2 мл), осторожно пипеткой с большим наконечником или нежный вортексе. Гранул клеток (см. выше), мытье с PBS во второй раз, пеллет и, наконец, ресуспендируют в PBS (1 мл).
- Используйте 25 мкл ресуспендировали клетки привить 5 мл минимальные средства массовой информации в трех экземплярах и инкубировать при температуре 37 ° C при встряхивании (300 оборотов в минуту). Возьмите OD 595 показания между 15-25 ч, примерно каждые 2 часа путем перевода 200 мкл каждого образца в 96-луночного планшета и чтения с помощью пластин-ридера.
6. Представитель Результаты:
Пример использования ToxR транскрипционный анализ репортер проанализировать олигомеризации склонность трансмембранных доменов в показано на рисунке 4. Ранее мы исследовали олигомеризации трансмембранных доменов из multispanning мембрана-интеграла мембранный белок скрытая белка-1 (LMP-1) различными методами, в том числе ToxR 14 трансмембранных домена пять (ТМ5) было показано, демонстрируют сильную склонность к oligomerize. Об этом свидетельствует высокая единиц Миллер, сравнимой с положительным контролем, ГПа, устоявшихся dimerizing последовательности. Вредные мутации в ТМ5, D150A, снижает способность последовательности oligomerize. LMP-1 TM1 существенно не oligomerize и экспонаты очень низкой Миллер Группа сигнал, чуть выше сигнала для пустой, нетрансформированных FHK12 клеток.
Рисунок 1. Мультфильм изображающий анализа ToxR репортер. Трансмембранного домена (ПРО ТВД) приводом олигомеризации приводит к димеризации ToxR и активации транскрипции LacZ. Ген продукт LacZ, β-галактозидазы может быть определена количественно, как мера склонности к ПРО ТВД oligomerize.
Рисунок 2. Гидролитического расщепления ONPG по β-галактозидазы результатов в производстве поглощающий свет видов о-nitrophenolate (ОНП).
Рисунок 3. Плазмиды карта pToxR7.
Рисунок 4. Представителю ToxR транскрипционного анализа репортер анализа олигомеризации склонность латентный мембранный белок-1 трансмембранных доменов. Трансмембранного домена 5 (ТМ5) oligomerizes сильно, в то время трансмембранного домена 1 (TM1) имеет лишь слабое взаимодействие. Мутация D150A в ТМ5 значительно снижает его способность oligomerize. ГПД входит в качестве позитивного шага управления для сильных димеризации. Пустые представляет непреобразованных FHK12 клеток.
Рисунок 5. Иммуноблоттинга для экспрессии белка.
Рисунок 6. PD28 дополнения анализа для контроля за правильным вставки мембраны периплазме. Отрицательный контроль представляет построить дефицит мальтозу связывающий белок.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
ToxR транскрипционного анализа репортер легкий способ идентифицировать трансмембранного последовательностей с потенциалом oligomerize. Поскольку взаимодействия, происходящие в бактериальной внутренней мембраной, этот анализ позволяет обойти проблемы, связанные с изучением действия систем в мембранно-миметического средах. Учитывая, что клонирование нескольких TMDS в единую плазмиды легко быть сделано параллельно и весь анализ может проводиться в 96-луночного формата пластины, результаты анализа могут быть использованы дл...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Мы благодарим Национальных Институтов Здоровья (1R21CA138373 и резервных до рака (SU2C) за финансовую поддержку этой работы. HY благодарен за 2009 Elion награду от Американской ассоциации исследований рака, премии Kimmel ученый из Сидни Киммель фонда Исследования Рака (SKF-08-101) и Национального научного фонда факультета Рано премии Карьера (NSF0954819).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер в каталоге | Комментарии (необязательно) |
| BamHI рестрикции | Invitrogen | 15201023 | Invitrogen ферменты оказались более эффективными, чем альтернативных поставщиков |
| NheI рестрикции | Invitrogen | 15444011 | Invitrogen ферменты оказались более эффективными, чем альтернативных поставщиков |
| 15 мл труб культуры | Fisher Scientific | 14-956-1J | |
| SOC СМИ | Teknova | S0225 | Сделано до соответствующего объема и стерилизовать в автоклаве. |
| LB СМИ | Sigma-Aldrich | L7275 | Сделано до соответствующего объема и стерилизовать в автоклаве. |
| Хлорамфеникол | Sigma-Aldrich | CO 3 78 | Маточного раствора 30 мг / мл в этаноле, хранящиеся в морозильнике |
| Арабинозы | Fluka | 10839 | Маточный раствор 2,5% (м / о) в воде хранится в морозильной камере |
| Na 2 HPO 4 | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaH 2 PO 4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| KCl | Химические вещества Mallinckrodt | 6858-06 | |
| MgSO 4 .7 H 2 O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Додецилсульфата натрия (SDS) | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| 2-нитрофенил β-D-галактопиранозид (ONPG) | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Z-буфера | 16,1 г Na 2 HPO 4 5,5 г NaH 2 PO 4 0.75g KCl 0.246g MgSO 4 Сделать до 1 л, рН 7,0 | ||
| Z-buffer/chloroform | 200 мл β-меркаптоэтанол, 2 мл хлороформа, составляют до 20 мл с Z-буфера. Vortex в течение 1 мин, центрифуги в течение 1 мин при 800 оборотах в минуту. Сделать свежее для каждой пластины. | ||
| Z-buffer/SDS | 160 мг SDS растворяют в 10 мл Z-буфера | ||
| Z-buffer/ONPG | 40 мг ONPG в 10 мл Z-буфера. Сделать свежее для каждой пластины | ||
| β-меркаптоэтанол | Calbiochem | 444203 | |
| Анти-MBP моноклональное антитело (HRP сопряженных) | NEB | E8038S | |
| Минимальная сред с мальтозы | 1 х M9 соли, 0,4% мальтозы, 1 мг / мл, тиамин, 2 мМ MgSO 4 | ||
| 96-луночного плоской пластине нижней | Sarstedt | 83.1835.300 | |
| Пластина-ридер | Beckman Coulter | DTX880 Многомодовые детектор | |
| Водяная баня | VWRI | 89032-204 | |
| Shaking инкубатор | FormaScientific |
Ссылки
- Parker, M. S. Oligomerization of the heptahelical G protein coupling receptors: a case for association using transmembrane helices. Mini Rev Med Chem. 9, 329-339 (2009).
- Mo, W., Zhang, J. T. Oligomerization of human ATP-binding cassette transporters and its potential significance in human disease. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 1049-1063 (2009).
- von Heijne, G. Membrane-protein topology. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 909-918 (2006).
- Van Horn, W. D. Solution nuclear magnetic resonance structure of membrane-integral diacylglycerol kinase. Science. 324, 1726-1729 (2009).
- Hattori, M. Mg(2+)-dependent gating of bacterial MgtE channel underlies Mg(2+) homeostasis. Embo J. 28, 3602-3612 (2009).
- Ulmschneider, M. B., Sansom, M. S. Amino acid distributions in integral membrane protein structures. Biochim Biophys Acta. 1512, 1-14 (2001).
- Deber, C. M., Goto, N. K. Folding proteins into membranes. Nat Struct Biol. 3, 815-818 (1996).
- Gerber, D., Shai, Y. In vivo detection of hetero-association of glycophorin-A and its mutants within the membrane. J Biol Chem. 276, 31229-31232 (2001).
- Langosch, D., Brosig, B., Kolmar, H. p, Fritz, H. J. Dimerisation of the glycophorin A transmembrane segment in membranes probed with the ToxR transcription activator. J Mol Biol. 263, 525-530 (1996).
- Russ, W. P., Engelman, D. M. TOXCAT: a measure of transmembrane helix association in a biological membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 863-868 (1999).
- Berger, B. W. Consensus motif for integrin transmembrane helix association. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 703-708 (2010).
- Oates, J., King, G., Dixon, A. M. Strong oligomerization behavior of PDGFbeta receptor transmembrane domain and its regulation by the juxtamembrane regions. Biochim Biophys Acta. 1798, 605-615 (2010).
- Sal-Man, N., Gerber, D., Shai, Y. Hetero-assembly between all-L- and all-D-amino acid transmembrane domains: forces involved and implication for inactivation of membrane proteins. J Mol Biol. 344, 855-864 (2004).
- Sammond, D. W. Transmembrane peptides used to investigate the homo-oligomeric interface and binding hot-spot of the oncogene, latent membrane protein 1. , Forthcoming (2010).
- Li, R. Dimerization of the transmembrane domain of Integrin alphaIIb subunit in cell membranes. J Biol Chem. 279, 26666-26673 (2004).
- Ruan, W., Becker, V., Klingmuller, U., Langosch, D. The interface between self-assembling erythropoietin receptor transmembrane segments corresponds to a membrane-spanning leucine zipper. J Biol Chem. 279, 3273-3279 (2004).
- Finger, C., Escher, C., Schneider, D. The single transmembrane domains of human receptor tyrosine kinases encode self-interactions. Sci Signal. 2, ra56-ra56 (2009).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
