$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Настройка
- Настройка хирургических область, как показано на рис. 1А, '. Ключевые компоненты настройки включают Эппендорф Femtojet microinjector, Narishige микроманипулятора с иглодержателя, Leica steromicroscope, волоконно-оптические системы освещения, ECM 830 квадратных системы Электропорация волны с электродами, грелку и испаритель для изофлуран анестезии.
- Очистите все инструменты с Bransonic ультразвуковые Cleaner использованием Metriclean2 Низкое пенообразование решение для sonicating хирургических инструментов. Стерилизуйте инструменты в автоклаве. Стерилизованный инструмент, затем хранить в Germex.
- Подготовка шприцы с теплым стерильным физиологическим раствором и стерильные лактата раствор Рингера.
2. Анестезия
- Место животных внутри небольшой (12 см х 20 см) анестезии камеры. Использование испарителем, доставить 5% изофлуран анестезии и кислород при 1L/min (рис. 1А, '). Примечательно, что очень важно собирать изофлуран выхлопных использованием очистки системы.
- Удаление животного из камеры, когда дыхание становится глубоким и регулярным. Щипать Toe и глаз мигает рефлекс тесты используются для обеспечения полной анестезии.
- Место беременные мыши на спине в верхней части грелку (37 ° С). Грелку сначала стерилизовать вытирая с 70% этанола, а затем покрыты стерилизовать, lintless площадки марли. Используйте респиратор трубки и маски аппаратом для доставки изофлуран (2,25%) во время операции.
- Inject бупренорфин (0.1mg/kg массы тела) подкожно под кожу на затылке.
- Монитор животных всей операции для глубокого и регулярного дыхания. Животное не должно задыхаться, дышать неглубоко и быстро. Мелкие, учащенное дыхание может быть признаком легкой анестезией, и поток изофлуран должна быть увеличена. Если животное начинает задыхаться, уменьшить поток изофлуран. В случае остановки дыхания, включите изофлуран выключен, и увеличить поток кислорода, пока животное выздоравливает. Перезагрузите изофлуран по более низкой концентрации.
3. Животное Подготовка к операции
- Лента передние конечности животного на грелку и проверьте еще раз для опровержения ответа, зажимая задние ноги с тупыми щипцами.
- Использование стерильного хлопка наконечником тампоном, распространение толстый слой крема для удаления волос (например, Наир) на животе. В фирме инсультов, обеспечить подшерсток полностью покрыты. Оставить на среднем три минуты, проверяя периодически стерильным чистый тампон для удаления волос. Влажная стерильная марля площадку стерильной водой и протрите живот, пока все следы исчезли. Повторите с хлоргексидином (т.е. Stanhexidine) кожу более чистой и больше воды. Сухой живота с чистой, стерильной марли.
- Стерилизовать разреза с хлоргексидином (т.е. Stanhexidine), а затем более стерильной водой. Сухой живота с чистой, стерильной марли. Повторите этот шаг с использованием 70% этанола и свежее, стерилизованное ватным тампоном.
- Место стерильной марли площадку на животе с разрезом посередине, через которое рогов матки будет втянут во время операции.
4. Разрез и выдержки из рогов матки
- Чтобы разоблачить рогов матки, сначала найти белой линии, как слабый черту под кожу в средней линии. Использование щипцов, потяните кожу от брюшной стенки и вырезать небольшие, прямой разрез от середины живота вниз на кожу ножницами (около 1 см в длину).
- Использование изогнутые щипцы и ножницы, повторите процесс с брюшины.
- Место стерильную марлю с небольшой вертикальный разрез через разрез и смочить подогретой стерильного физиологического раствора.
- Слайд щипцов в разрез и найдите матки. Держите открытым разрез с щипцами при удалении матки рога.
- Осторожно возьмитесь матки между первым и вторым видимым эмбрионов и тянуть эмбрионов на марлю. Удалите обе стороны рога матки, размещение на стерильную марлю и посчитайте количество эмбрионов, отметив, любой резорбция или «нездоровый» (например, меньший размер тела) эмбрионов. Влажные рогов матки физиологическим раствором и осторожно вернуть половину матки в брюшную полость.
5. Введение ДНК в Желудочки
- Хирургические иглы готовы с Саттер Flaming микропипетки Puller использованием боросиликатного микропипетки с капиллярами (Программа: тепло = 750, Pull = 30, Vel = 90, Время = 150). Используя стерильный скальпель лезвием, иглы осторожно сбрил на 45 градусов.
- Чтобы загрузить иглы, пипетки Пастера тянутся к узким диаметром до пламени. Рот кусок прилагается к загрузке пипетки составить ~ 10 мкл 3мг/мл эндотоксина свободной ДНК смешивается с 0,01% метилового зеленого (примечание: метилового зеленого красителя позволяет инъекции ДНК для визуализации). Заполнена игла затем установлены на стенде микроманипулятора и прикреплен к Femtojet инжектора.
- Начиная с эмбрионом ближе всего к яичников, круглые щипцыиспользуются, чтобы осторожно поверните эмбриона в децидуальной так, что он расположен "лицом вперед", что позволяет инъекции происходит в ростральнее каудальном направлении. Волоконно-оптический источник света для освещения используется, чтобы помочь визуализировать средней линии эмбриональных мозг, который в окружении больших боковых желудочков в ростральной области (рис. 1B, B ').
- Эмбриона проводится в положении с помощью кругового щипцами. Игла находится над матки так, чтобы угол входа в мозг составляет около 45 градусов. Использование микроманипулятора, а также быстрое и устойчивое движение кончика иглы вводится через стенку матки и в боковой желудочек эмбриона. Инъекции направлены на боковых желудочков, третьего желудочка или субретинальной пространство для целевой конечного мозга, промежуточного мозга и сетчатки, соответственно. Обратите внимание, что эмбриональные пузырьки мозга открыты на ранних эмбриональных стадиях, что ДНК вводится в боковые желудочки будет поступать в 3-й желудочек.
- Пресс ножной педалью для введения эндотоксина свободной ДНК (1-3 мкл) с использованием Eppendorf Femtojet microinjector. Успешных инъекций легко визуализируется распространение метилового зеленого красителя всей эмбриональной желудочков мозга. Игла затем медленно удаляется рисунок резервные копии, чтобы избежать поломки.
6. Электропорация
- Вводят эмбриона (еще в матке) помещается на стерильную марлю вышележащих живот матери и мокрого тщательно с подогреваемой физиологического раствора. Пожалуйста, обратите внимание ** Помимо физиологического раствора к поверхности мембраны необходимо обеспечить эффективное прохождение электрического тока.
- GenePaddle электроды используются для захвата матки после инъекции ДНК. Пять квадратных электрические импульсы 40-50V и 50 мс поставляются в размере одного импульса в секунду, используя ECM8300 BTX электропорации системы (рис. 1С, С).
- Обложка вводили / электропорации эмбриона с защитным мокрой марли и переходите к следующему эмбриона.
- По окончании инъекции / электропорации все желаемые эмбрионов, аккуратно нажмите рогов матки обратно в брюшную полость (рис. 1D).
- Осторожно удалите другие рога матки и начать снова с эмбрионом ближе всего к яичника.
7. Шовный и сшивание
- После того как все эмбрионы обратно в матку, добавить в брюшную полость ~ 2-3 мл теплого физиологического раствора.
- Чтобы закрыть рану, начните с удаления марли на животе и определение стороны брюшины. Начните ушивание брюшины используя черный плетеный шнур шелка. Не рекомендуется использовать рассасывающиеся нити для этой процедуры, как это обычно слабее и может привести к послеоперационных кровотечений и инфекций. Якорь линии на брюшине ближе к грудине и приступить к стежка от якоря. Убедитесь, что все швы плотные, и что никакие основные органы и кожа была случайно вшиты в брюшину. Клип оставшиеся шов и выбросьте.
- Вытяните кожа покрыла шов щипцами. Использование 9 мм Reflex ™ кожи закрытия скобы, клип кожа над раной, заботясь, чтобы не основной продукт под шов, или тянуть кожу слишком сильно. Предпочтительным методом является проведение кожу вверх и в сторону от тела щипцами, и прийти в на 90 градусов с основной инструмент. Продолжайте, пока рана закрыта (примерно в три скобы). После завершения обеспечить скобы плотно, слегка нажав вместе с инструментом шов (рис. 1D).
8. Послеоперационный уход
- Для мониторинга наркозом восстановления, включите женщин на живот и выключите изофлуран. Хранение морду животного внутри дыхательный аппарат, включите кислорода до 3%, чтобы помочь восстановлению от наркоза. Животного должен быть сделан на чистую сухую площадку марлю сверху грелку, чтобы предотвратить переохлаждение.
- Хотя животное любящим выпить, вводят 2 мл раствора Рингера подкожно под кожу шеи животного.
- Продолжайте удерживать животное под поток кислорода в течение нескольких минут и колодки потепления марли для того, чтобы поднять животное. Короткие всплески движения от животных следует рассматривать как он возвращается в нормальную структуру дыхания. Соблюдайте несколько минут, пока животное кажется сознательное и бодрствования.
- Спрей животе самки с Гентамицин спрей и заверните животное в стерильной марли площадку.
- Передача животных в стерильных клетку с автоклавного постельные принадлежности и картона жилья.
- Бутылки с водой должны быть тщательно очищены, стерилизовать и заполнена стерильной водой. К 500 мл воды, добавить 2 мл sulfamethazine антибиотик (25% акций).
- Администрирование 0,05 мг / кг подкожно бупренорфин следующее утро после операции.
- Монитор женщин тесно в течение первых 24 часов после операции. Если животные находятся более 24 часов, женщины переехали в новые стерИль клеток на 2-й день.
9. Представитель Результаты
Неокортекс
Неокортекс области центральной нервной системы, которая отвечает за визуальное и сенсомоторной обработки и высших когнитивных функций. Она состоит из нейронов глутаматергической проекции и ГАМК-интернейронов, которые вытекают из спинной и брюшной конечного мозга, соответственно. Для решения роли различных генов в развитии коры головного мозга, которые мы используем в внутриутробно электропорации либо misexpress или блок выражении (то есть за счет использования конструкции shRNA) различных генов в спинной или вентральной конечного мозга 1,3,4. Для misexpress генов в эмбриональных конечного мозга, мы используем вектор bicistronic выражение (pCIG2), содержащих ЦМВ-βactin промоутер-усилитель и внутренний сайт рибосомы въезд (IRES)-расширенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP, в pCIG2) кассету, что позволяет трансфицированных ячейки, которые будут обнаружены epifluorescence (рис. 2-C). Мы использовали эту технологию ввести выражение конструкции в конечном мозге от E11.5 к E15.5 (Приведенные данные являются на E12.5;. Рис. 2). Позволяя эмбрионов разработать несколько дней после электропорации, мы имеем возможность отслеживать дифференциации и миграции GFP-меченых предшественников. Как дифференциации доходов, 3-х дней после электропорации GFP + клеток дифференцироваться и мигрировать из желудочковой зоны (ВЗ), субвентрикулярной зону (СВЗ) и промежуточную зону (из) и в кортикальной пластинки (ф;. Рис 2С). Если мозги электропорации на E12.5 анализируются после 24 часов, мы можем контролировать более ранних событий в созревании предшественников и миграцию нейронов путем совместного маркировки с маркерами апикального прародителей (т.е. Pax6;. Рис 2А), базально-предшественников (т.е. Tbr2; . Рис 2B) и постмитотических неокортекса нейронов (то есть, Tbr1;. Рис 2С).
Промежуточный мозг
Гипоталамус лежит в вентральной базе центральной нервной системы и функции шлюза между эндокринной и вегетативной нервной системы. Во время разработки, несколько ядер, которые составляют зрелые гипоталамус отличить от общей зоны предшественников, что линии вентральной-область эмбриональных промежуточного мозга. В настоящее время молекулярные пути, которые регулируют пролиферацию клеток предшественников, нейронная дифференциация и формирование ядер гипоталамуса мало изучены. Мы использовали внутриутробно электропорации на целевое выражение гена-репортера в эмбриональном промежуточного мозга путем введения ДНК в 3-й желудочек E12 embryos.We затем следуют распределения GFP в дифференциации нейронов в E14. С помощью этой методологии, мы успешно целевых GFP выражение таламус, предварительно таламуса и гипоталамуса (рис. 3А). Анализ корональные разделы показывает, что мы успешно целевых GFP выражение клеток-предшественников, что линия желудочковой зоны 3-го желудочка и нейронов, которые мигрируют из мантии в зоне формирования ядер (рис. 3В)
Сетчатка
Сетчатка нейронных слой глаза, отвечает за преобразование фотонов света в электрические импульсы передаются в мозг. Он развивается, как outpocketing эмбрионального промежуточного мозга, и, следовательно, является производным от нервной трубки. Нейронных сетчатки развивается из апикальной отсек предшественника, который лежит рядом с субретинальной пространство, которое отделяет полость глаза от головы мезенхимы. Ориентация на ДНК-конструкции для сетчатки прародителей, следовательно, требует, что инъекции делаются в небольшой площади цели. Использование микроманипуляторами, нам удалось успешно цель этой небольшой площади у эмбрионов от E13.5 к E15.5 (показана E15.5 electroporations из PCIC с корреспондентом mCherry, рис 4.). Если электропорации сетчатки рассматриваются 24 часа после трансфекции, заметим, что наиболее mCherry + клеток расположены в наружном слое нейробластов (onbl), где деление предшественников расположены, а не в сетчатке слоя клеток ганглия (ГКЛ, вставка изображения), где постмитотических клетки локализовать.
Рисунок 1. Введение в внутриутробно электропорации настройки и методологии. () Ключевых компонентов хирургической настройки включают Эппендорф Femtojet microinjector (1), Narishige микроманипулятора с иглодержателя (2), Leica steromicroscope (3), волоконно-оптических осветительных приборов системы (4), ECM 830 квадратных системы Электропорация волны с электродами (5) и грелку (6). (') Животных под наркозом использованием испаритель для изофлуран анестезии. (В, В ') Короче говоря, после анестезии, рогов матки подвергаются и ДНК смешивается с прочным зеленым вводят в эмбриональные пузырьки мозга. Успешное введение визуализируется отслеживание быстро зеленого красителя (В '). (С, С ') После ДНК успешно вводят внутривенно, весла электроды расположены по обе стороны от матки, positioning эмбрион так, что ДНК будет притягиваться к положительному полюсу в области мозга выбора. (D, D ') После того как все желаемые эмбрионы вводят внутривенно, матки выталкивается обратно в брюшную полость (D), брюшины зашивается, а кожа сшиты (D'). Беременная самка затем позволили восстановить и электропорации щенков собраны в нужном моменты времени.
Рисунок 2. Представитель пример спинной telencephalic электропорации. (AC) Микрофотография корональных разрез E13.5 спинной конечного мозга электропорации на E12.5 с pCIG2. Электропорации GFP + клеток анализируются для их выражения маркеров апикальной прародителей (Pax6 +, красный,), базально-прародителей (Tbr2 +, красный, Б) и постмитотических нейронов (Tbr1 +, красный, С). ср, кортикальной пластинки; СВЗ, субвентрикулярной зоны, В. З.; желудочковой зоны.
Рисунок 3. Представитель пример диэнцефальных электропорации. () Вентрально E14 мозга, который был электропорации на E12 с pCIG2. GFP epifluorescence видна в таламус, предварительно таламуса и гипоталамуса, демонстрируя распространение microinjected pCIG2 плазмиды течение 3-го желудочка. (B) Микрофотография корональных разрез электропорации мозга, показывая миграции GFP + клеток из желудочков зоне и в зоне мантии, где ядрах гипоталамуса будет форме. 3В, третьего желудочка; Т, таламус, Hy, гипоталамус, тг, мантии зоны; тел, конечного мозга; Pret, prethalamus; В.З., желудочковой зоны.
Рисунок 4. Представитель пример сетчатки электропорации. Корональные разрез глаз E16.5 электропорации с PCIC на E15.5 показывающие накопление mCherry +-клеток в наружный слой нейробластов, а не в Brn3b + ганглиозных клеток сетчатки в слое ганглиозных клеток. Вставкой, большем увеличении образ коробку области. GCL, сетчатки слоя клеток ганглия; ле, линзы; onbl, внешний слой нейробластов; ре, сетчатки.