Фотолиз клетке соединений позволяет получать быстрое и локализованные увеличение концентрации различных физиологически активных соединений. Здесь мы покажем, как получить патч-зажим записи в сочетании с фотолиза клетках или в клетках цАМФ Ca для изучения обонятельной трансдукции в диссоциированных мыши обонятельной сенсорных нейронов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Флэш Фотолиз клетке соединений в ресничек Обонятельные сенсорные нейроны
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Фотолиз клетке соединений позволяет получать быстрое и локализованные увеличение концентрации различных физиологически активных соединений 1. Клетке соединений молекулы, физиологически неактивных по химической клетки, которые могут быть нарушены вспышки ультрафиолетового света. Здесь мы покажем, как получить патч-зажим записи в сочетании с фотолиза клетке соединений для изучения обонятельной трансдукции в диссоциированных мыши обонятельной сенсорных нейронов. Процесс обонятельной трансдукции (рис. 1) имеет место в ресничками обонятельных сенсорных нейронов, где одоранта связывания с рецепторами приводит к повышению цАМФ, который открывает циклических нуклеотидов закрытого (СПГ) каналы 2. Са запись с помощью СПГ каналов активирует Са-активированных каналов Cl. Мы покажем, как отделить нейроны от мыши обонятельный эпителий 3 и инструкции по активации СПГ каналов или Ca-Cl активированного каналы фотолиза клетке цАМФ 4 или клетку Са 5 </ SUP>. Мы используем лампы-вспышки 6,7 применять ультрафиолетовые вспышки для цилиарной региона выпускать из клетки цАМФ или Са в то время как патч-зажим записи взяты для измерения тока в цельноклеточной напряжения зажим конфигурации 8-11.
Протокол
1. Приборы и оборудование
- Для измерения ответа обонятельных сенсорных нейронов на фотолиз «заблокированных» (caged) соединений мы используем вспышку в сочетании с типичной системой регистрации методом патч-кламп, включающей: усилитель патч-кламп, регистрирующий электрод и референтный электрод, подключенные к головному усилителю (head-stage) усилителя патч-кламп, дигитайзер, компьютер, программное обеспечение для сбора данных, микроманипуляторы, эпифлуоресцентный микроскоп, систему перфузии, антивибрационный стол и клетку Фарадея (Рисунок 2).
- Для создания высокоинтенсивной вспышки ультрафиолетового (УФ) света мы используем ксеноновую вспышку (блок R....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Флэш фотолиза клетке соединений в сочетании с патч-зажим записи является полезным методом для получения быстрого и местных скачков концентрации физиологически активных молекул внутри и вне клетки. Несколько типов клетке compounds1 были синтезированы, и эта техника может быть применена к различным типам клеток, включая культивируемые клетки выразив ионных каналов, которые могут быть активированы или модулируется фотолиза некоторые из имеющихся клетке соединений 11.
Фотолиз клетке с.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Оборудование | Компания | Номер по каталогу | Комментарии |
| Адаптер модуля лампы-вспышки с микроскопом | Рапп Оптоэлектронные | FlashCube 70 | |
| Воздух стол | TMC | МИКРО-г 63-534 | |
| Digitizer | Axon инструменты | DIGIDATA 1322A | |
| ПО для сбора данных | Axon инструменты | pClamp 8 | |
| Анализ данных программного обеспечения | WaveMetrics | Игорь | |
| Зеркало для модуль адаптера | Рапп Оптоэлектронные | M70/100 | |
| Держатель электрода | Axon инструменты | 1-HL-U | |
| Фарадея клетке | На заказ | ||
| Фильтры куб | Олимп | U-MWU | Возбуждение фильтр удален |
| Импульсная лампа | Рапп Оптоэлектронные | JML-C2 | |
| Пинцет Дюмон # 55 | Инструменты Всемирной Precision | 14099 | |
| Стекло капилляров | Инструменты Всемирной Precision | PG10165-4 | |
| Блюдо с прозрачным дном | Инструменты Всемирной Precision | FD35-100 | |
| Осветитель | Олимп | Выделите 3100 | |
| Инвертационный микроскоп | Олимп | IX70 | |
| Микроманипуляторы | Luigs и Неймана | С. М. Я | |
| Микропипетки Puller | Narishige | PP-830 | |
| Монитор | HesaVision | МТБ-01 | |
| Фильтры нейтральной плотности | Омега Оптические | меняется | |
| Цель 100X | Zeiss | Fluar 440285 | Либо Zeiss или Olympuы |
| Цель 100X | Олимп | UPLFLN 100XOI2 | Либо Zeiss или Olympus |
| Оптический фильтр УФ shortpass | Рапп Оптоэлектронные | SP400 | |
| Патч-зажим усилителя | Axon инструменты | Axopatch 200B | |
| Фотодиод Ассамблеи | Рапп Оптоэлектронные | КПК | |
| Кварцевый световод | Рапп Оптоэлектронные | меняется | Мы используем 600 мкм в диаметре |
| Серебряная проволока | Инструменты Всемирной Precision | AGT1025 | |
| Серебряная земля гранул | Warner инструменты | 64-1309 | |
| Ксеноновая дуговая лампа | Рапп Оптоэлектронные | XBL-JML |
| Реагент | Компания | Номер по каталогу |
|---|---|---|
| BCMCM-клетке цАМФ | Биолог | B016 |
| Бычий сывороточный альбумин (BSA) | Сигма | A8806 |
| CaCl2 стандартный раствор 0,1 М | Fluka | 21059 |
| Caged Ca: DMNP-ЭДТА | Invitrogen | D6814 |
| Цистеин | Сигма | C9768 |
| Конканавалин типа V (ConA) | Сигма | C7275 |
| CsCl | Сигма | C4036 |
| ДМСО | Сигма | D8418 |
| Я ДНКазы | Сигма | D4527 |
| ЭДТА | Сигма | E9884 |
| EGTA | Сигма | E4378 |
| Глюкоза | Сигма | G5767 |
| HEPES | Сигма | H3375 |
| KCl | Сигма | P3911 |
| КОН | Сигма | P1767 |
| Leupeptin | Сигма | L0649 |
| MgCl2 | Fluka | 63020 |
| Папаин | Сигма | P3125 |
| Poly-L-лизин | Сигма | P1274 |
| NaCl | Сигма | S9888 |
| NaOH | Сигма | S5881 |
| NaPyruvate | Сигма | P2256 |
Ссылки
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).
- Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction. FEBS Lett
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
