Фотолиз клетке соединений позволяет получать быстрое и локализованные увеличение концентрации различных физиологически активных соединений. Здесь мы покажем, как получить патч-зажим записи в сочетании с фотолиза клетках или в клетках цАМФ Ca для изучения обонятельной трансдукции в диссоциированных мыши обонятельной сенсорных нейронов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Флэш Фотолиз клетке соединений в ресничек Обонятельные сенсорные нейроны
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Фотолиз клетке соединений позволяет получать быстрое и локализованные увеличение концентрации различных физиологически активных соединений 1. Клетке соединений молекулы, физиологически неактивных по химической клетки, которые могут быть нарушены вспышки ультрафиолетового света. Здесь мы покажем, как получить патч-зажим записи в сочетании с фотолиза клетке соединений для изучения обонятельной трансдукции в диссоциированных мыши обонятельной сенсорных нейронов. Процесс обонятельной трансдукции (рис. 1) имеет место в ресничками обонятельных сенсорных нейронов, где одоранта связывания с рецепторами приводит к повышению цАМФ, который открывает циклических нуклеотидов закрытого (СПГ) каналы 2. Са запись с помощью СПГ каналов активирует Са-активированных каналов Cl. Мы покажем, как отделить нейроны от мыши обонятельный эпителий 3 и инструкции по активации СПГ каналов или Ca-Cl активированного каналы фотолиза клетке цАМФ 4 или клетку Са 5 </ SUP>. Мы используем лампы-вспышки 6,7 применять ультрафиолетовые вспышки для цилиарной региона выпускать из клетки цАМФ или Са в то время как патч-зажим записи взяты для измерения тока в цельноклеточной напряжения зажим конфигурации 8-11.
Протокол
1. Приборы и оборудование
- Для измерения ответа обонятельных сенсорных нейронов на фотолиз «заблокированных» (caged) соединений мы используем вспышку в сочетании с типичной системой регистрации методом патч-кламп, включающей: усилитель патч-кламп, регистрирующий электрод и референтный электрод, подключенные к головному усилителю (head-stage) усилителя патч-кламп, дигитайзер, компьютер, программное обеспечение для сбора данных, микроманипуляторы, эпифлуоресцентный микроскоп, систему перфузии, антивибрационный стол и клетку Фарадея (Рисунок 2).
- Для создания высокоинтенсивной вспышки ультрафиолетового (УФ) света мы используем ксеноновую вспышку (блок Rapp OptoElectronic JML-C2 Flash Unit, Рисунок 3A), принцип работы которой основан на разрядке конденсатора высокого напряжения через короткодуговую вспышечную трубку, заполненную газом ксеноном6-7. Вспышка света может запускаться вручную или компьютером с помощью того же программного обеспечения, которое управляет электрофизиологической записью.
- УФ-фильтр коротких волн, оптимизированный для задач «разблокировки» (uncaging) (270-390 nm), вставляется в выходной слот вспышки, а кварцевый волоконно-оптический световод подключается к микроскопу (см. раздел 1.5).
- Интенсивность вспышки света и, следовательно, степень фотолиза можно изменять, варьируя определенные параметры:
напряжение или емкость6. Действительно, интенсивность света связана с энергией, запасенной в конденсаторе, и зависит от значения емкости и напряжения на нем согласно стандартной формуле 0.5 CV2. На передней панели нашей вспышки можно выбрать одно из трех значений емкости (C1=1000 μF, C2=2000 μF или C3=3000 μF), а напряжение может варьироваться от 100 до 385 Вольт (Рисунок 3A), что обеспечивает запасенную энергию в диапазоне от 5 до 220 J. Продолжительность вспышки составляет от 0,5 до 1 ms на полной полуширине максимума и зависит от выбранного значения емкости. Перед выбором другой емкости или установкой более низкого напряжения необходимо разрядить конденсатор, выбрав режим разрядки на передней панели вспышки (Рисунок 3A).
Однако энергия света не пропорциональна просто запасенной энергии по многим причинам, связанным с физикой газовых разрядов и нелинейными потерями в цепи при увеличении электрической энергии6. Для измерения энергии, соответствующей вспышке света, можно использовать джоульметр, такой как JM10 от RappOptoElectronics. Следует отметить, что энергия на выходе кварцевого световода с установленным УФ-фильтром находится в диапазоне 1-15 mJ на вспышку, согласно руководству пользователя блока Rapp OptoElectronic Flash Unit.
Вместе с блоком вспышки поставляется фотодиодный узел (Рисунок 3B), который можно использовать для оценки изменений интенсивности света в зависимости от C и V. Выходной сигнал фотодиода пропорционален интенсивности света. Согласно инструкциям в руководстве пользователя, световод подключается к входу фотодиодного узла, а выход — к осциллографу. На Рисунке 3C показано пиковое выходное напряжение фотодиода в ответ на вспышки света для трех значений емкости C1, C2 или C3, доступных в нашем блоке вспышки, в зависимости от приложенного напряжения. Эти значения будут меняться по мере износа вспышечной лампы. Рекомендуется регулярно использовать фотодиод для проверки степени износа вспышки.
Вместо изменения емкости и/или напряжения на передней панели, более точный и быстрый контроль интенсивности света достигается путем размещения нейтральных фильтров во втором слоте для фильтров вспышки (Рисунок 3A). Этот подход быстрее, и, кроме того, продолжительность вспышки, зависящая от выбранного значения емкости, остается неизменной. С использованием нейтральных фильтров с коэффициентом пропускания от 100% до 0,1 % можно быстро изменять интенсивность вспышки в широком диапазоне. - Вспышка света направляется на нейрон, выращенный на стеклянных планшетах, через кварцевый волоконно-оптический световод (Рисунок 2). Световод подключается к эпифлуоресцентной насадке инвертированного микроскопа с помощью адаптера. Модифицированный фильтр-куб без возбуждающего фильтра направляет УФ-луч на нейрон с помощью дихроичного зеркала.
- Свет фокусируется с помощью иммерсионного объектива 100x (масляная иммерсия). Область, охватываемая вспышкой, визуализируется путем вставки световода в осветитель, обеспечивающий непрерывный источник видимого света. Изображение (обозначено желтым цветом на видео) выводится на монитор через CCD-камеру, подключенную к микроскопу. На мониторе обводится контур освещенной области для локализации зоны УФ-вспышки в экспериментах. Перед подачей УФ-вспышки цилиарная область нейрона совмещается с областью, нарисованной на мониторе.
- Размер пятна УФ-света контролируется увеличением объектива, диаметром световода и положением световода сзади микроскопа. Мы используем иммерсионный объектив 100x (масляная иммерсия). Диаметр круглого пятна измеряется путем направления света от осветителя на предметное стекло с микрометром, помещенное на предметный столик микроскопа. Диаметр пятна в нашей установке составляет примерно 16, 33, 50 или 105 μm для световода диаметром соответственно 200, 400, 600 или 1250 μm.
2. Приготовление растворов
Диссекция
- Раствор Рингера: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM глюкозы, 1 mM пирувата натрия (pH 7,4, доведенное с помощью 1M NaOH).
- Стоп-микс: раствор Рингера с добавлением 0,1 mg/ml BSA, 0,3 mg/ml лейпептина и 0,02 mg/ml DNaseI.
- Без divalent-ионов раствор Рингера: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM EDTA, 10 mM глюкозы, 1 mM пирувата натрия (pH 7,4 с использованием 1M NaOH). Для ферментативной диссоциации добавить 200 μM цистеина и 2 U/ml папаина.
Примечание: растворы для диссекции следует подвергнуть стерильной фильтрации.
Растворы для регистрации методом патч-клампа
Внеклеточные растворы
- Внеклеточный раствор Рингера: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM глюкозы, 1 mM пирувата натрия (pH 7.4, доведенный с помощью 1M NaOH).
- Раствор Рингера с низким содержанием Ca: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM глюкозы, 1 mM пирувата натрия (pH 7.4, доведенный с помощью 1M NaOH).
Внутриклеточные растворы
Всегда готовьте и используйте растворы соединений в клетках при приглушенном свете, чтобы избежать их деградации под воздействием окружающего освещения. Защищайте контейнеры от света с помощью алюминиевой фольги.
Клеточный cAMP в «клетке»:
- Приготовьте внутриклеточный раствор, содержащий 145 mM KCl, 4 mM MgCl2, 0.5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1 mM MgATP и 0.1 mM NaGTP (pH 7.4, доведенный с помощью 1M KOH).
- Приготовьте стоковый раствор, растворив «заклеточный» цАМФ (BCMCM-cAMP4) в DMSO до концентрации 50 mM. Разлейте раствор в аликвоты по 5 μl. Хранить до одного года при -20°C.
- Растворите аликвоту стокового раствора «заклеточного» цАМФ во внутриклеточном растворе до получения конечной концентрации 50 μM «заклеточного» цАМФ. Перемешайте на вортексе.
- Разлейте внутриклеточный раствор с «заклеточным» цАМФ в аликвоты по 1 ml. Хранить до двух месяцев при -20°C до использования.
Клетированный Ca:
Мы готовим внутриклеточные растворы, содержащие 3 mM DMNP-EDTA5, на 50% нагруженные 1.5 mM Ca.
- Приготовьте внутриклеточный раствор, содержащий 140 mM KCl (или CsCl) и 10 mM HEPES (pH 7.4, доведенный с помощью 1M KOH или CsOH).
- Откройте флакон с 5 mg DMNP-EDTA. Добавьте 52.8 μl стандартного раствора хлорида кальция 0.1 M и 1 ml внутриклеточного раствора. Перемешайте на вортексе.
- Чтобы предотвратить высвобождение «запертого» Ca под воздействием окружающего света, перенесите раствор в пробирку, защищенную от света алюминиевой фольгой. Добавьте внутриклеточный раствор до достижения конечного объема 3.5 ml. Перемешайте на вортексе. Разлейте внутриклеточный раствор с «запертым» Ca в аликвоты объемом около 1 ml и храните при температуре -20°C до двух месяцев до использования.
Примечания: во время проведения экспериментов защищайте растворы соединений в клетках от воздействия света с помощью алюминиевой фольги и держите их на льду. Пропустите внутриклеточный раствор через стерилизующий фильтр.
3. Диссоциация обонятельных сенсорных нейронов мыши
Работа с животными проводилась в соответствии с Итальянскими рекомендациями по использованию лабораторных животных (Decreto Legislativo 27/01/1992, no. 116) и руководящими принципами Европейского союза по исследованиям на животных (No. 86/609/EEC).
- Подготовьте три чашки со стеклянным дном, покрытые 10 mg/ml конканавалин-А и 10 mg/ml поли-L-лизина.
- Для подготовки к диссекции приготовьте 1 ml бездивалентного раствора Рингера. Заполните две чашки Петри диаметром 50 мм с покрытием Sylgard раствором Рингера и поместите их на лед. Также охладите смесь папаина с цистеином, 0,5 ml стоп-смеси и шприц с фильтром 0,22 μm, содержащий около 10 ml раствора Рингера.
- Пожертвуйте мышью путем асфиксии CO2 с последующим обезглавливанием. Удалите кожу над черепом, сделайте разрезы вдоль линий челюсти и поместите голову в чашку Петри с покрытием Sylgard.
- Поместите чашку под стереомикроскоп. С помощью скальпеля рассеките голову сагиттально по срединной линии. Поверните половину головы медиальной стороной вверх. Осторожно удалите перегородку, чтобы обнажить носовые раковины (см. также Cygnar et al., 201013).
- С помощью пинцета № 3 и скальпеля удалите носовые раковины, выстланные обонятельным эпителием. Перенесите их в чашку Петри с покрытием Sylgard.
- С помощью супертонкого пинцета № 55 отделите фрагменты обонятельного эпителия от прикрепленных частей раковин. Перенесите их в пробирку, содержащую 1 ml бездивалентного раствора Рингера. Добавьте смесь папаина и цистеина. С помощью микроножниц измельчите эпителий и инкубируйте при комнатной температуре в течение 3 минут. Снова осторожно измельчите микроножницами и подождите еще 5 минут.
- С помощью оплавленной пастеровской пипетки перенесите содержимое в пробирку, содержащую 0,5 ml стоп-смеси.
- Центрифугируйте при 300 g (1500 RPM) в течение 5 минут. Удалите супернатант и добавьте около 1 ml фильтрованного раствора Рингера. Осторожно тритурируйте оплавленной пастеровской пипеткой.
- Расположите около 0,3 ml раствора, содержащего клетки, в центре трех чашек со стеклянным дном. Дайте клеткам осесть в течение примерно одного часа при +4°C. Добавьте раствор Рингера.
4. Запись
- Изготовьте патч-пипетки из боросиликатных капилляров так, чтобы их сопротивление при заполнении внутриклеточным раствором составляло 3-7 MΩ.
- Поместите на предметный столик инвертированного микроскопа чашку с стеклянным дном, содержащую диссоциированные обонятельные сенсорные нейроны. Проводите перфузию раствором Рингера.
- Шприц с внутриклеточным раствором, содержащим «заблокированные» (caged) соединения, оберните алюминиевой фольгой для защиты от света и храните в холодильнике. Работайте при приглушенном свете, чтобы избежать деградации «заблокированных» соединений под воздействием окружающего освещения.
- При 100-кратном увеличении найдите изолированный обонятельный сенсорный нейрон с неповрежденными ресничками. Переместите столик микроскопа так, чтобы область ресничек оказалась внутри круга на мониторе, который обозначает зону последующей УФ-вспышки.
- С помощью гибкой иглы заполните патч-пипетку внутриклеточным раствором, содержащим «заблокированное» соединение. Удалите пузырьки воздуха из кончика пипетки. Установите пипетку в держатель на головке усилителя патч-клампа. Используя микроманипулятор, подведите пипетку к соме нейрона и примените осторожное всасывание для создания гигаомного контакта. Установите напряжение -60 mV и примените дополнительное всасывание для перехода в режим целой клетки (whole-cell mode), используя стандартные методы патч-клампа12.
- Подождите не менее двух минут для диффузии «заблокированного» соединения в реснички.
- Запустите протокол стимуляции на компьютере и запишите ответ. Используйте фильтр нижних частот с частотой отсечки 1 kHz и оцифровку с частотой дискретизации не менее 2 kHz.
- Типичный протокол стимуляции предполагает фиксацию напряжения на постоянном значении и инициирование УФ-вспышки от вспышечной лампы для фотолиза «заблокированного» соединения в области ресничек.
5. Репрезентативные результаты:
Вы должны уметь осуществлять локальный высвобождение («расклетку») заблокированного cAMP или заблокированного Ca в цилиарной области изолированного обонятельного сенсорного нейрона и регистрировать токовый ответ в конфигурации фиксации напряжения при методе локальной фиксации потенциала всей клетки (whole-cell voltage-clamp).
На рисунке 4 показан типичный входящий ток, вызванный УФ-вспышкой, которая привела к фотолизу «заблокированного» cAMP; запись проводилась при напряжении -60 mV в присутствии внеклеточного раствора Рингера с низким содержанием Ca. В данных условиях входящий ток обусловлен поступлением Na через CNG-каналы. Фаза нарастания тока была быстрой и была аппроксимирована одиночной экспоненциальной функцией с постоянной времени 3.4 ms.
На рисунках 5A-B показаны ответы другого обонятельного сенсорного нейрона в растворе с низким содержанием Ca и в растворе Рингера с 1mM Ca. Восходящая фаза тока при -60 mV стала значительно медленнее и приобрела многофазный характер (Рисунок 5 A-B). Это обусловлено воздействием Ca, поступающего в реснички через CNG-каналы и активирующего вторичный ток Cl10. Более ранний катионный компонент тока, возникающий из-за активации CNG, в растворе Рингера с 1mM Ca меньше, чем в растворе с низким содержанием Ca, из-за блока, вызванного проникающими ионами Ca, которые снижают общий ток.
Другим способом уменьшить прирост Ca в ресничках является фиксация потенциала нейрона на уровне +60 mV (Рисунок 5 C-D). Восходящая фаза ответа, вызванного высвобождением cAMP при +60 mV, хорошо описывалась одной экспонентой с постоянной времени 6.7 ms, что указывает на наличие только одного компонента тока.
Путем фотовысвобождения Ca внутри ресничек обонятельного сенсорного нейрона вы сможете измерить быстро растущий ток. Этот ток переносится ионами Cl. На рисунке 6 A показаны входящие токи при -50 mV, вызванные фотовысвобождением caged Ca в ответ на УФ-вспышки различной интенсивности. Фаза нарастания Ca-активируемых Cl-токов хорошо описывалась одной экспонентой с постоянными времени от 3.8 до 5 ms (Рисунок 6 B).
Рисунок 1. Обонятельная трансдукция в ресничках обонятельных сенсорных нейронов. Молекулы одоранта связываются с обонятельными рецепторами (OR), активируя G-белок, который, в свою очередь, активирует аденилатциклазу (ACIII), что приводит к внутриклеточному увеличению концентрации cAMP. cAMP открывает циклические нуклеотид-зависимые (CNG) каналы, обеспечивая вход ионов Na и Ca. Повышение внутриклеточного уровня Ca активирует Ca-зависимые Cl-каналы. В реснички через патч-пипетку могут быть введены «заблокированный» (caged) cAMP или «заблокированный» Ca. Вспышка УФ-света вызывает фотолиз заблокированного соединения (Модифицировано с разрешения Pifferi et al. 20062).
Рисунок 2. Система для регистрации методом патч-клампа и вспышечного фотолиза. Компоненты установки включают усилитель для патч-клампа, компьютер, дигитайзер, эпифлуоресцентный микроскоп, ксеноновую вспышку, ПЗС-камеру и монитор. Синие и фиолетовые линии обозначают пути видимого и УФ-излучения соответственно.
Рисунок 3. Ксеноновая импульсная лампа. (A) Источник света, используемый для вспышечного фотолиза заблокированных соединений. (B) Модуль фотодиода, используемый для оценки интенсивности световой вспышки. (C) Световод от импульсной лампы был подключен к входу фотодиода, а выходной сигнал визуализировался на осциллографе. На переключателе передней панели импульсной лампы было выбрано одно из трех доступных значений емкости (C1, C2 или C3), а напряжение изменялось поворотом ручки на передней панели. Выходное напряжение фотодиода в ответ на разную интенсивность вспышек было построено в зависимости от приложенного напряжения для каждого значения емкости: C1 = 1000 μF, C2 = 2000 μF или C3 = 3000 μF. Использовался световод диаметром 600 μm.
Рисунок 4. Регистрация методом patch-clamp в ответ на фотолиз «заблокированного» cAMP в растворе с низкой концентрацией внеклеточного Ca. (A) Ответ всего тока, индуцированный в изолированном обонятельном сенсорном нейроне фотолизом «заблокированного» cAMP, локализованного в ресничках. УФ-вспышка была произведена в момент, указанный стрелкой. Потенциал удержания составлял -60 mV. (B) Фаза нарастания тока была хорошо аппроксимирована одиночной экспоненциальной функцией (пунктирная линия) с постоянной времени 3.4 ms.
Рисунок 5. Токовые ответы, вызванные фотолизом «заблокированного» cAMP в растворах с низким содержанием Ca и в растворе Рингера. (A) Обонятельный сенсорный нейрон находился в растворе Рингера, содержащем 1 mM Ca, или в растворе с низким содержанием Ca при удерживающем потенциале -60 mV. УФ-вспышка была подана в момент, указанный стрелкой. (B) Токовые ответы, построенные в расширенном временном масштабе, продемонстрировали многофазную фазу нарастания в растворе Рингера, в то время как фаза нарастания для ответа, зарегистрированного в растворе с низким содержанием Ca, хорошо описывалась одной экспоненциальной функцией (пунктирная линия) с постоянной времени 3.5 ms. (C) Токовые ответы того же нейрона, показанного на (A), находящегося в растворе Рингера при удерживающих потенциалах -60 и +60 mV. (D) Токовые ответы, построенные в расширенном временном масштабе, продемонстрировали многофазную фазу нарастания при -60 mV, тогда как при +60 mV фаза нарастания хорошо описывалась одной экспонентой с постоянной времени 6.7 ms (пунктирная линия).
Рисунок 6. Ответы на фотолиз клеткированного Ca. (A) Токи всего ствола клетки, индуцированные фотолизом клеткированного Ca при -50 mV. УФ-вспышки подавались в моменты времени, отмеченные стрелкой. Интенсивность вспышек варьировалась с помощью фильтров нейтральной плотности. (B) Увеличенный временной масштаб показывает быстрый рост тока после фотовысвобождения Ca. Токи хорошо аппроксимировались одной экспоненциальной функцией (пунктирные линии) с постоянными времени 5, 4,8, 3,8 ms. (Перепечатано с разрешения Boccaccio & Menini, 200710).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Флэш фотолиза клетке соединений в сочетании с патч-зажим записи является полезным методом для получения быстрого и местных скачков концентрации физиологически активных молекул внутри и вне клетки. Несколько типов клетке compounds1 были синтезированы, и эта техника может быть применена к различным типам клеток, включая культивируемые клетки выразив ионных каналов, которые могут быть активированы или модулируется фотолиза некоторые из имеющихся клетке соединений 11.
Фотолиз клетке с...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Оборудование | Компания | Номер по каталогу | Комментарии |
| Адаптер модуля лампы-вспышки с микроскопом | Рапп Оптоэлектронные | FlashCube 70 | |
| Воздух стол | TMC | МИКРО-г 63-534 | |
| Digitizer | Axon инструменты | DIGIDATA 1322A | |
| ПО для сбора данных | Axon инструменты | pClamp 8 | |
| Анализ данных программного обеспечения | WaveMetrics | Игорь | |
| Зеркало для модуль адаптера | Рапп Оптоэлектронные | M70/100 | |
| Держатель электрода | Axon инструменты | 1-HL-U | |
| Фарадея клетке | На заказ | ||
| Фильтры куб | Олимп | U-MWU | Возбуждение фильтр удален |
| Импульсная лампа | Рапп Оптоэлектронные | JML-C2 | |
| Пинцет Дюмон # 55 | Инструменты Всемирной Precision | 14099 | |
| Стекло капилляров | Инструменты Всемирной Precision | PG10165-4 | |
| Блюдо с прозрачным дном | Инструменты Всемирной Precision | FD35-100 | |
| Осветитель | Олимп | Выделите 3100 | |
| Инвертационный микроскоп | Олимп | IX70 | |
| Микроманипуляторы | Luigs и Неймана | С. М. Я | |
| Микропипетки Puller | Narishige | PP-830 | |
| Монитор | HesaVision | МТБ-01 | |
| Фильтры нейтральной плотности | Омега Оптические | меняется | |
| Цель 100X | Zeiss | Fluar 440285 | Либо Zeiss или Olympuы |
| Цель 100X | Олимп | UPLFLN 100XOI2 | Либо Zeiss или Olympus |
| Оптический фильтр УФ shortpass | Рапп Оптоэлектронные | SP400 | |
| Патч-зажим усилителя | Axon инструменты | Axopatch 200B | |
| Фотодиод Ассамблеи | Рапп Оптоэлектронные | КПК | |
| Кварцевый световод | Рапп Оптоэлектронные | меняется | Мы используем 600 мкм в диаметре |
| Серебряная проволока | Инструменты Всемирной Precision | AGT1025 | |
| Серебряная земля гранул | Warner инструменты | 64-1309 | |
| Ксеноновая дуговая лампа | Рапп Оптоэлектронные | XBL-JML |
| Реагент | Компания | Номер по каталогу |
|---|---|---|
| BCMCM-клетке цАМФ | Биолог | B016 |
| Бычий сывороточный альбумин (BSA) | Сигма | A8806 |
| CaCl2 стандартный раствор 0,1 М | Fluka | 21059 |
| Caged Ca: DMNP-ЭДТА | Invitrogen | D6814 |
| Цистеин | Сигма | C9768 |
| Конканавалин типа V (ConA) | Сигма | C7275 |
| CsCl | Сигма | C4036 |
| ДМСО | Сигма | D8418 |
| Я ДНКазы | Сигма | D4527 |
| ЭДТА | Сигма | E9884 |
| EGTA | Сигма | E4378 |
| Глюкоза | Сигма | G5767 |
| HEPES | Сигма | H3375 |
| KCl | Сигма | P3911 |
| КОН | Сигма | P1767 |
| Leupeptin | Сигма | L0649 |
| MgCl2 | Fluka | 63020 |
| Папаин | Сигма | P3125 |
| Poly-L-лизин | Сигма | P1274 |
| NaCl | Сигма | S9888 |
| NaOH | Сигма | S5881 |
| NaPyruvate | Сигма | P2256 |
Ссылки
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).
- Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction. FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).
- Bozza, T. C., Kauer, J. S. Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons. J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).
- Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).
- Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).
- Rapp, G. Flash lamp-based irradiation of caged compounds. Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).
- Gurney, A. M. Flash photolysis of caged compounds. Microelectrodes: Theory and Applications. Montenegro, I., Queiros, M. A., Daschbach, J. L. , Proc. NATO Adv. Study Inst. Portugal. (1991).
- Lagostena, L., Menini, A. Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse. Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).
- Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., Menini, A. Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase. J. Gen. Physiol. 128, 171-184 (2006).
- Boccaccio, A., Menini, A. Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons. J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).
- Sagheddu, C., Boccaccio, A., Dibattista, M., Montani, G., Tirindelli, R., Menini, A. Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16B-transfected HEK 293T cells. J. Physiol. 588, 4189-4204 (2010).
- Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).
- Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording. J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).
- Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution. Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
