Прогнозирование ВИЧ-1 корецепторов использования (тропизм) анализом последовательности использования Генотипическая подход

Summary

Предсказание корецепторов использования ВИЧ-1 требуется для введения нового класса антиретровирусных препаратов, антагонистов т.е. корецепторов. Он может быть выполнен анализ последовательности ENV Гена и последующей интерпретации через интернет-система интерпретации (geno2pheno _{[Корецепторов]}).

Abstract

Маравирок (MVC) является первым лицензированным антиретровирусных препаратов из класса корецепторов антагонистов. Он связывается с принимающей корецепторов CCR5, который используется большинством штаммов ВИЧ, с тем, чтобы заразить человека иммунные клетки (рис. 1). Другие штаммы ВИЧ используют различные корецепторов, CXCR4. Какой рецептор используется, определяется вирусом белка Env (рис. 2). В зависимости от корецепторов используется, вирусы классифицируются как R5 или X4, соответственно. MVC связывается с рецептором CCR5 ингибирования вступления вирусы R5 в клетки-мишени. В ходе болезни, X4 вирусы могут возникать и перерастают R5 вирусы. Определение корецепторов использования (также называемый тропизм), следовательно, обязательными до введения MVC, как того требовала EMA и FDA.

Исследования для MVC эффективности мотивации, MERIT и 1029 были проведены с Trofile анализа с монограммой, Сан-Франциско, США Это высокое качество анализа на основе Sophisticated рекомбинантного испытаний. Принятие этого теста для повседневной довольно низкий за пределами США, так как европейские врачи, а, как правило, работают с децентрализованным лаборатории экспертов, которые также обеспечивают сопутствующие тестирование сопротивления. Эти лаборатории прошли несколько обеспечению качества оценок, последний был представлен в 2011 ^1.

Вот уже несколько лет мы провели тропизм определений основано на анализе последовательности из ВИЧ-ENV-V3 гена область (V3) ^2. Этот регион несет достаточно информации, чтобы выполнить надежный прогноз. Генотипического определения использования корецепторов представляет преимущества, такие как: сокращение времени оборота (эквивалент сопротивления тестирования), снижение затрат, возможность адаптировать результаты к потребностям пациентов и возможность анализа клинических образцов с очень низкой или даже вирусную нагрузку (ВН ), особенно с учетом количества проанализированных проб с ВН <1000 копий / мклпримерно увеличилась в последние годы (рис. 3).

Основные шаги для тропизм тестирования (рис. 4) показано в этом видео:

1. Коллекция образцов крови
2. Выделение РНК из плазмы и / или ВИЧ провирусной ДНК из крови мононуклеаров
3. Усиление регионе ENV
4. Усиление V3 области
5. Последовательность реакции ампликона V3
6. Очистка секвенирование образцов
7. Секвенирование очищенных образцов
8. Последовательность редактирования
9. Последовательность интерпретации данных и тропизм прогноз

Protocol

Протокол представлены на рис. 4.

1. Коллекция образцов крови

1. Соберите по крайней мере, 3 мл крови в пробирках EDTA в клинической сайта.
2. Пробы могут храниться до недели при 4 ° C.
3. Отправить ЭДТА-крови как можно скорее в лабораторию по обычной почте.

2. Выделение РНК ВИЧ и / или ДНК

1. Получить вирусной РНК и / или ДНК из 1000 мкл цельной крови, сыворотки или плазмы, используя MagNA Pure Компактный нуклеиновых изоляции кислота Я комплекта я и MagNA Pure Compact System.
2. Элюируйте получила РНК или ДНК в 50 мкл буфера ТЕ. Кроме того, другие нуклеиновых кислот процедуры могут быть использованы.

3. Усиление регионе ENV

Усиление регионе ENV (рис. 2 и 4), либо из плазмы РНК или провирусной ДНК. 1245 б.п. Длинные продукта, составляющие большинство белков Env (NT 6556-7811 Accordinг до НХВ2) порождается.

1. Образцы РНК: RT-PCR реакции
   1. Вирусная РНК представляет собой очень сложную вторичную структуру (рис. 4), которые могут препятствовать реакции RT. Чтобы избежать этой проблемы, инкубировать 10 мкл РНК при 65 ° C в течение 10 минут (уже в ПЦР-пробирку и в машине ПЦР), а затем уменьшить температуру до 50 ° C.
   2. Добавить 40 мкл PCR Master Mix в том числе грунтовки Env-F и Env-R.
      
      Мастер Mix для RT-PCR В Доме-системы:
      

      	объем / реакцию (мкл)	Конечная концентрация
      РНКазы H 2 O	14,4
      5x буфера (Qiagen OneStep RT-PCR Kit)	10	1x
      5x Q-решений	10	1x
      дНТФ Mix (10 мМ каждого)	2	400 мкМ каждого дНТФ
      Энзим-Mix (Qiagen OneStep RT-PCR Kit)	2
      Primer Env-F (100 мкм)	0,3	0,6 мкМ
      Primer Env-R (100 мкм)	0,3	0,6 мкМ
      Ингибитор РНКазы (RNasin)	1	5 шт / реакцию

      
      
      Env-F: 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3 '(NT 6556 → 6586 по НХВ2)
      
      Env-R: 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 '(NT 7785 ← 7811)
   3. Запустить реакцию RT при температуре 50 ° С в течение 30 минут.
   4. Запуск первой ПЦР следующим образом:
      
      

      95 ° C, 15 мин	1 х
      95 ° C, 30 сек 50 ° C, 30 сек 72 ° C, 2 мин
      95 ° C, 30 сек 56 ° C, 30 сек 72 ° C, 2 мин	38 х
      72 ° C, 10 мин 4 ° C ∞

      1 х
2. Образцы ДНК: ПЦР
   
   Для провирусной образцы ДНК, первоначальная реакция РТ необходимо, и ПЦР можно непосредственно начать.
   1. Добавить 40 мкл ПЦР Mix Master до 10 мкл provial ДНК.
      
      
      Мастер Mix для ПЦР-In-House-System:
      

      	объем / реакцию (мкл)	Конечная концентрация
      РНКазы H 2 O	15,4
      5x буфера (HotStarTaq ДНК-полимеразы)	10	1x
      5x Q-решений	10	1x
      дНТФ Mix (10 мМ каждого)	2	400 мкМ каждого дНТФ
      Энзим-Mix (HotStarTaq ДНК-полимеразы)	2
      Primer Env-F (100 мкм)	0,3	0,6 мкМ
      Primer Env-R (100 мкм)	0,3	0,6 мкМ

      
      
      Env-F: 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3 '(NT 6556 → 6586)
      
      Env-R: 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 '(NT 7785 ← 7811)
   2. Выполнить условия ПЦР, как описано выше для образцов РНК (шаг 3.1.4).

4. Усиление V3 региона: ПЦР

1. Для ПЦР, используйте 5 мкл из первой реакции ПЦР (без предыдущий анализ в агарозном геле) в качестве шаблона и добавить 95 мкл ПЦР-MasСмешать тер.
   
   Master Mix на вложенный-In-House PCR

   	объем / реакцию (мкл)	Конечная концентрация
   H 2 O	61,9
   10x ПЦР буфер	10	1x
   5x Q-решений	20	1x
   дНТФ Mix (10 мМ каждого)	2	200 мкМ каждого дНТФ
   Primer Env-2F (100 мкм)	0,3	0,6 мкМ
   Primer Env-2R (100 мкм)	0,3	0,6 мкМ
   HotStarTaq ДНК-полимеразы	0,5	2,5 ЕД / реакция

   
   
   Env-2F: 5'-GTCCAAAGGTATCCTTTGAGCCAATTC -3 '(NT 6838 → 6864)
   
   
2. Запуск ПЦР следующим образом:

   93 ° C, 15 мин	1 х
   95 ° C, 30 сек 50 ° C, 30 сек 72 ° C, 90 сек	1 х
   95 ° C, 30 сек 56 ° C, 30 сек 72 ° C, 90 сек	43 х
   72 ° C, 10 мин 4 ° C ∞

3. Анализ ПЦР-продукта на 1% агарозном геле (рис. 4). Ожидается продукта 902 п.н.-долго.
4. Очистка секвенирование образцов.
   1. Очищают продуктов ПЦР с Qiagen ПЦР-комплект очистки с использованием протоколов, решений и микро-столбцы предоставляемых поставщиком. Элюировать в 30-100 мкл буфера PE, в зависимости от интенсивности полос.
   2. Кроме того, образцы могут быть очищены с использованием экзонуклеазаЯ и быстрого доступа (Thermo щелочной фосфатазы). Для этого, добавить 6 мкл Exo-AP Mix до 15 мкл продукта ПЦР и инкубировать 15 минут при 37 ° C.

      580 мкл H 2 O

      66 мкл быстрых AP

      13,4 мкл Exo я

5. Последовательность реакции ампликона V3

1. Последовательность реакций состоит из реакции ПЦР, используя только одну из следующих праймеров:
   
   Env-2: 5'-GTACAATGYACACATGGAATTAGGC -3 (NT 6959 → 6980)
   Env-5: 5'-AAAATTCCCCTCCACAATTA - 3 '(NT 7352 ← 7371)
   Env-6: 5'-GGCCAGTAGTATCAACTCAAC - 3 '(NT 6979 → 7000)
   Env-7: 5'-TGTCCACTGATGGGAGGGGC - 3 '(NT 7530 ← 7549)
   Env-10: 5 '- GCAGAATAAAACAAATTATAAACATGTGGC - 3' (NT 7478 ← 7507)
   Env-11: 5 '- TACATTGCTTTTCCTACTTTCTGCCAC - 3' (NT 7638 ← 7664)
   Первый выбор праймеров являются: Env-2, Env-6 или Env-7, Env-11
2. Используйте 1 мкл из очищенного V3 ампликона как шаблон и добавить 9 мкл ПЦР-смеси.
   
   Секвенирование Master Mix:

   4 мкл смеси последовательности (генотипирования ВИЧ-Kit)

   4 мкл H 2 O

   1 мкл праймера (100 пмоль / мкл)

3. Выполнить последовательность реакций следующим образом:

   96 ° C, 10 сек
   50 ° C, 10 сек	36 х
   60 ° C, 45 сек
   4 ° C ∞

6. Очистка секвенирование образцов

Очищают последовательности УЗИнг Sephadex G-50 тончайший.

1. Заполнить соответствующее количество скважин в "колонке погрузчика" с Sephadex G-50 тончайший. Передача Sephadex с фильтром MAHVN4510 пластины переворота.
2. Добавить 300 мкл Milli-Q H ₂ O в каждую лунку в фильтр пластины, и выдержать его в течение не менее 3 ч при температуре 2-8 ° C.
3. Центрифуга пластин в течение 5 мин при 910Xg и 4-15 ° C. Откажитесь от проточных.
4. Добавить 10 мкл H ₂ O на продукт последовательности, а затем пипеткой последовательности на распухла пластины Sephadex.
5. Для получения очищенного продукта, центрифуги пластине в течение 5 мин. в 910Xg и 4-15 ° C и собирать проточные.

7. Секвенирование очищенных образцов на секвенсор ABI Prism 3130 XL

1. Перед каждым запуском, изменить буфера и проверить объем полимера (POP7). При необходимости, заменить старую колбу полимера нового.
2. Использование сохраненных выполнения условий, включая инъекции время 18 секунд.
3. В этой машине, сбор сигнала данных за один проход с 16 образцами последовательности занимает около 60 мин (36 см капиллярной) или 150 мин (50 см капилляра).

8. Последовательность редактирования

1. Используйте программу Lasergene (ДНК-Star) для выравнивания и редактирования последовательности (рис. 5). Другие программы для редактирования последовательности могут быть использованы. Используйте "V3-консенсусом B" и окр консенсусной последовательности как ссылки.
2. Lasergene создает консенсусной последовательности анализируемого образца, используя все исходные данные и сохранить его как файл FASTA. FASTA файл представляет собой текстовый файл, который включает в себя заголовок с именем образца и нуклеотидной последовательности.

9. Последовательность интерпретации данных и тропизм прогноз

1. Последовательность интерпретации данных осуществляется через веб-интерфейс системы интерпретации geno2pheno _{[корецепторов]} ( http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php). Для тропизм прогнозирования, различные настройки FPR могут быть выбраны. По умолчанию в соответствии с германо-австрийской руководящие принципы терапии. Для FPR ≥ 20%, вирус классифицируется как R5, когда FPR ≥ 20% и X4 для FPR <12,5%.
2. Добавить FASTA файл на сервер. Этот сервер преобразует последовательность нуклеотидов в аминокислоты, выравнивает его с V3-консенсусом B последовательности и производит классификацию подтипов. Кроме того, она порождает предсказания использования корецепторов (рис. 4) выражается как процент ложных срабатываний (FPR).

10. Представитель Результаты

Geno2pheno _{[корецепторов]} Выходные данные показывают, градуированная интерпретации тропизм. В зависимости от вероятности корецепторов использования, интерпретации текста и цвет фона меняется от зеленого (<20% FPR), что свидетельствует о безопасной администрации MVC, до желтого, предполагая, возможно, низкий риск и, наконец, на красный. Красный цвет предлагатьING не предписывать MVC. Кроме того, сервер генерирует отчет в формате PDF, который можно распечатать, заполнить с пациентом и выборочных данных, и послал к врачу. Примеры geno2pheno выход _{[корецепторов]} приведены на рис. 6.

Рис. 1. Схема репликации ВИЧ. Вириона необходимо привязать к сотовому CD4 рецептор, как и ни к CCR5 или CXCR4 как корецепторов. Корецепторов CCR5 может быть заблокирован антагонистов CCR5, как Маравирок (MVC, Celsentri, Selzentry). После слияния вирусных и клеточных мембран, вирусных нуклеокапсида выходит в цитоплазму. Нуклеокапсида разбирает и вирусной РНК комплекса высвобождается в цитоплазму. Вирусной обратной транскриптазы (RT) транскрибирует геномной РНК в провирусной ДНК, которая затем транспортируется в ядро ​​и интегрироваться в геном хозяина по интегразы ВИЧ. Сотовый РНК-полимеразы траnscribe вирусного генома и РНК, с провирусной генома. Вирусные белки производятся в цитоплазме и транспортируются на поверхность клетки. Бутон вирусных частиц, как незрелая, не инфекционных вирионов из клетки. Протеазы ВИЧ расщепляет белки производству инфекционных частиц. Ингибирование один из шагов приводит к прерыванию цикла репликации.

Антиретровирусные препараты и репликации шаг, который они подавляют отмечены красным цветом.

Вирусной РНК и провирусной ДНК (материал, используемый для анализа тропизма или сопротивления) отмечены зеленым.

Рисунок 2. ВИЧ провирусной генома. Частицы ВИЧ построен с различными структурными белками и домов, различных ферментов и белков, как от вирусного и клеточного происхождения. На рисунке шоуS расположения генов в геном вируса. Поверхностные белки gp120 и gp41 представляет собой шипами на поверхности вириона и обратиться в клетки человека для выполнения слияния мембран. В нижней части рисунка, ПЦР-амплификации продукты и праймеры, используемые в нашем протоколе показано на рисунке.

Рисунок 3. Доля пациентов с низкой вирусной нагрузкой (ВН) измерений анализируются на лекарственную устойчивость или тропизм определения в Институт вирусологии, Университет Кельна (Германия).

Рисунок 4. Общая схема эксперимента .. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5. Последовательность редактирования с Lasergene. Ампликона V3 секвенируют по крайней мере одна вперед и один обратный праймер. Lasergene alignes ". ABI" файлы, полученные из секвенсора со ссылкой последовательности "V3-консенсусом B" и окр. Lasergene создает консенсусной последовательности, используя все строки данных. Ссылка последовательности могут быть отмечены (и затем отображаются серым цветом), так что они не вносят вклад в консенсусной последовательности образца.

Рисунок 6. Тропизм прогноз отчеты, генерируемые geno2pheno _{[корецепторов]} tool.The отчеты формируются как PDF файлов, которые могут быть сохранены и завершится в компьютер. Дополнительные данные названия такого пациента нас, дата крови добычи и т.д., можно вручную включить помощью программы PDF писатель. Конкретные замечания могут быть также добавлены. Фесэлектронной данных исключительно на компьютере пользователя, а не на geno2pheno сервера _{[корецепторов].} Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию этой фигуры.

Discussion

V3 последовательности позволяет надежно вирусных прогноз тропизм, как показано в клинических исследованиях, ^3-9. В самом деле, генотипические определения предполагается в текущем европейском и немецко-австрийская принципов ^10.

По сравнению с фенотипическими тестирования, не только время оборота короче (эквивалентное сопротивление тестирования), но и являются расходы. Кроме того, основным преимуществом генотипического тестирования является то, что результаты оценивались как FPR и, следовательно, могут быть адаптированы к потребностям пациентов. Trofile результатов, с другой стороны, просто R5 или X4 отчетов, а также доступ к необработанным данным не дано.

В настоящее время европейские принципы предполагают, FPR отключения 20% ^10, в то время как австро-германские руководящие принципы позволяют адаптировать FPR отсечения специально для потребностей каждого пациента ^11. В соответствии с этим для пациентов с широким спектром вариантов антиретровирусных препаратов, более высокий FPR отключений (> 20%) Рекомендзакончился. Наоборот, для сильно предварительно обработанных пациентов с ограниченными терапевтические возможности, снизить FPR отключений (> 5%) может быть использована. Этот вид терапии руководство в настоящее время продолжается сопротивлением тестирования НИОТ, ННИОТ, ИП, и ИНИС, где частично активные препараты могут быть включены в лечении пациентов со сниженной терапевтических возможностей. Кроме того, с ростом числа генотипически наведением терапии изменениям, клинически значимых FPR отключений постоянно регулируется с помощью панели bioinformaticians, вирусологи и врачи.

Еще одним важным преимуществом генотипической тестирования тропизм является возможность анализа клинических образцов с очень низкой или даже вирусную нагрузку (ВН). В этом случае, когда плазма РНК не амплифицируемым, провирусной ДНК могут быть упорядочены и использовать для надежных прогнозов ^9,12. Следует отметить, что число пациентов с низким или вирусную нагрузку резко возросло в последние годы. На сегодняшний день Trofile анализа только позволяет проводить анализ образцов от пациентов с ВН <1000 копий / мл. Тем не менее, предварительные исследования показали, что провирусной ДНК может быть также adecuate должна быть протестирована на Trofile ^13.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
MagNA Pure Компактный нуклеиновых Kit изоляции кислота я	Roche Diagnostics	04 802 993 001
MagNA Pure Compact System	Roche Diagnostics	03731146001
T3000 Термоциклеры	Biometra	050-723
One Step RT-PCR Kit	Qiagen	210215
HotStarTaq Mix Master Kit	Qiagen	203445
QIAquick ПЦР Очистка Kit	Qiagen	28106
Экзонуклеаза I (Exo I)	Fermentas	EN0582
Fastap термочувствительного щелочной фосфатазы	Fermentas	EF0651
BigDye Terminator v3.1 циклического секвенирования Kit	Applied Biosystems	4337457
Sephadex G-50 Superfine	GE Healthcare	17-0041-01
ABI Prism 3130 XL капиллярной секвенсор	Applied Biosystems	3130XL