Методическая статья

Эффективное Вывод прав Сердечная Прекурсоры и кардиомиоциты из плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека с малыми Индукционная Молекула

22.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/3274

⸱

3 ноября 2011 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1San Diego Regenerative Medicine Institute, 2Xcelthera, 3Department of Neurosurgery, Harvard Medical School, 4Division of SCI Research, VA Boston Healthcare System, 5Program in Stem Cell & Regenerative Biology, Sanford-Burnham Medical Research Institute, 6La Jolla IVF

В этой статье

Краткое содержание

Мы создали протокол для индукции cardioblasts прямо из плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека поддерживается при определенных условиях с малыми молекулами, что позволяет вывод большой запас человеческой сердечной прародителей и функциональные кардиомиоциты для сердечно-сосудистой ремонта.

Аннотация

На сегодняшний день отсутствие подходящего источника сердечных клеток человека стало основным препятствием для регенерации миокарда человека, будь то путем трансплантации клеток или с помощью тканевой инженерии сердца1-3. Кардиомиоциты становятся терминально дифференцированными вскоре после рождения и теряют способность к пролиферации. Нет никаких доказательств того, что стволовые клетки/клетки-предшественники, полученные из других источников, таких как костный мозг или пуповинная кровь, способны давать начало сократительным клеткам сердечной мышцы после трансплантации в сердце1-3. Потребность в регенерации или восстановлении поврежденной сердечной мышцы не была удовлетворена терапией стволовыми клетками взрослых, ни эндогенным путем, ни путем доставки клеток1-3. Генетически стабильные эмбриональные стволовые клетки человека (ЭСКч) обладают неограниченной способностью к экспансии и неограниченной пластичностью, представляя собой плюрипотентный резервуар для получения in vitro больших количеств соматических клеток человека, ограниченных определенной линией, нуждающейся в восстановлении и регенерации4,5. В связи с распространенностью сердечно-сосудистых заболеваний во всем мире и острым дефицитом донорских органов существует глубокий интерес к разработке терапии на основе ЭСКч в качестве альтернативного подхода. Однако вопрос о том, как эффективно и предсказуемо направить широкий дифференцировочный потенциал плюрипотентных ЭСКч к желаемому фенотипу, стал серьезной проблемой как для исследований развития, так и для клинического внедрения. Традиционные подходы полагаются на многолинейную предрасположенность плюрипотентных клеток посредством спонтанной дифференцировки зародышевых листков, что приводит к неэффективному и неконтролируемому определению линии, за которым часто следуют фенотипическая гетерогенность и нестабильность, и, следовательно, высокий риск туморигенности6-8 (см. схему на рис. 1A). Кроме того, неопределенные чужеродные/животные биологические добавки и/или поддерживающие клетки-фидеры, которые обычно использовались для изоляции, экспансии и дифференцировки ЭСКч, могут затруднить прямое использование таких специализированных клеточных трансплантатов у пациентов9-11. Чтобы преодолеть эти препятствия, мы определили компоненты определенной системы культивирования, необходимые и достаточные для поддержания плюрипотентности эпибласта ЭСКч, что служит платформой для получения de novo клинически пригодных ЭСКч и эффективного однородного направления таких ЭСКч в сторону клинически значимых линий с помощью малых молекул12 (см. схему на рис. 1B). После скрининга различных малых молекул и факторов роста мы обнаружили, что такие определенные условия делают никотинамид (NAM) достаточным для индуцирования спецификации кардиомезодермы напрямую из плюрипотентных ЭСКч, которые далее развивались в кардиобласты, генерировавшие сокращающиеся кардиомиоциты человека с высокой эффективностью (рис. 2). Мы определили условия для индукции кардиобластов напрямую из плюрипотентных ЭСКч без промежуточной стадии многолинейных эмбриональных телец, что позволяет осуществлять хорошо контролируемое эффективное получение большого количества сердечных клеток человека на всех этапах развития для клеточной терапии.

Протокол

1. Решение и средства массовой информации подготовки

  1. Желатин раствор для нанесения покрытия: 0,1% (вес / объем) желатин в DDH 2 O, автоклавного и хранить при температуре 4 ° C.
  2. Матригель покрытия решений. Маточный раствор: медленное таяние Матригель (10 мл) при температуре 4 ° С в течение ночи, добавьте 10 мл ледяной DMEM или DMEM/F12, хорошо перемешать и аликвоту 1 мл / трубки под капотом стерилизованные культуры ткани, хранить при -20 ° C. Рабочий раствор: медленное таяние 1 мл Матригель аликвоту при 4 ° С в течение 1-2 часов, трансфер в 14 мл охлажденного DMEM или DMEM/F12 и хорошо перемешать под капотом стерилизованные культуры ткани непосредственно перед покрытием.
  3. Человек покрытие ламинин решение: развести 1 мл человеческой решение ламинин (0,5 мг / мл в Трис буферизацией NaCl, хранить при -80 ° С, медленно таять при температуре 4 ° С в течение 1-2 часов) с ледяной DMEM или DMEM/F12 к 12,5 мл рабочего раствора (40 мкг / мл) под капотом стерилизованные культуры ткани непосредственно перед покрытием.
  4. Фактор роста фондовых решений (500-1000X): растворить фактора роста в 10 мкг/ Мл в буфере стерилизованные (0,5% БСА, 1,0 мМ DTT, 10% глицерина, 1XPBS) и сохранять в качестве 50-100 мкл / трубка аликвоты при -80 ° C.
  5. HESC СМИ: DMEM/F12 или КО-DMEM (80%), KO сыворотке замены (20%), L-аланин-L-Gln или L-Gln (2 мМ), MEM заменимые аминокислоты (MNAA, 1X), и β-меркаптоэтанол (100 мкМ), фильтруют и хранят при температуре 4 ° С с добавлением 20 нг / мл bFGF перед использованием. Или заменить "КО сыворотке замены" с определенными компонентами: DMEM/F12 или КО-DMEM (100%), L-аланин-L-Gln или L-Gln (2 мМ), MNAA (1X), MEM незаменимых аминокислот (MEAA , 1X) и β-меркаптоэтанол (100 мкМ), фильтруют и хранят при температуре 4 ° С с добавлением bFGF (20 нг / мл), инсулин человека (20 мкг / мл), аскорбиновой кислоты (50 мкг / мл), человеческого активин (50 нг / мл), человеческий альбумин / Albumax (10 мг / мл), и человеческого трансферрина (8 мкг / мл) перед использованием.
  6. HESC сердечной СМИ дифференциации: DMEM/F12 (90%), определенный FBS (10%) и L-аланин-L-Gln или L-Gln (2 мМ).
  7. Среды, содержащие никотинамид (ДН): добавить NУтра до HESC СМИ или HESC сердечной СМИ дифференциации до конечной концентрации 10 мМ, фильтруют, хранят при температуре 4 ° C и употребить в течение 2 недель подготовки.

2. Пластина покрытия

  1. Пальто пластин с желатином: добавить 2,5 мл / лунку раствора желатина до 6 луночных и инкубировать в течение ночи в 37 ° С увлажненным инкубатора.
  2. Пальто пластин с ламинин: холод желатин пластинками, покрытыми и удалить желатин, добавить 2,5 мл / лунку Матригель или человеческого ламинина покрытие рабочего раствора предварительно охлажденное желатинизированный 6-луночных планшетов и инкубировать при температуре 4 ° С в течение ночи.

3. Пассажей и посевные Недифференцированная ЭСК при определенных условиях

  1. Разрешить чЭСК колонии вырастают на 5-7 дней от роду, и возьмите пластинку чЭСК культуры рассекает микроскопом (предварительно теплой рассекает этапе до 37 ° C) под рассекает стерилизовать капотом.
  2. Выберите чЭСК колонии должны быть разделены. Морфологически эти колонии должны иметь> 75% недифференцированные ЭСК (смвсех компактных ячеек), как правило, немного непрозрачной (не белым ворсом деятельность клеток, не ясно дифференцированных клеток) с определенными края под рассекает микроскопом. Тщательно контур выбранного колоний и удалите слой дифференцированных фибробластов вокруг колонии и все дифференцированных частей (если таковые имеются) колонии с краю P2 стерильный наконечник пипетки или вытащил стеклянный капилляр.
  3. Удалите старый средах, содержащих отдельные плавающие дифференцированные клетки путем аспирации. Промыть чЭСК СМИ (без bFGF) один раз. Добавьте 3 мл / лунку свежим чЭСК среде, содержащей 20 нг / мл bFGF.
  4. Вырежьте недифференцированное колонии чЭСК на мелкие кусочки, и отделить стерильным наконечником пипетки или вытащил стеклянный капилляр.
  5. Бассейн средах, содержащих отдельные части колонии вместе в 50 мл коническую трубку. Промыть пластины один раз с 1 мл / лунку СМИ чЭСК, содержащей 20 нг / мл bFGF и бассейн вместе.
  6. Аспирируйте Матригель или человеческого ламинина решение от покрытых свежей пластинки. Алиготе 4 мл / ч иESC средах, содержащих колонии штук 6-луночный планшет. Аккуратно передачи пластины в инкубатор без встряхивания и позволяют семян колонии части ночью, не мешая в увлажненный 37 ° C инкубатор атмосфере 5% CO 2.

4. Сердечная Индукция ЭСК под определенные культуры система с Никотинамид

  1. На 3-й день после посева, удалить большую часть старых СМИ из каждой лунки пластины и оставить достаточно средств массовой информации, чтобы чЭСК колонии под воду (никогда не позволит ЭСК высохнуть). Замените 4 мл / лунку свежим чЭСК средах, содержащих 20 нг / мл bFGF и 10 мМ никотинамида (ДН).
  2. Замените старые СМИ со свежими СМИ чЭСК, содержащей 20 нг / мл bFGF и 10 мМ ДН через день, и позволяют сердечно-индуцированных колоний чЭСК вырасти до 8-10 дней. После разоблачения в ДН, все клетки в колонии претерпит изменения морфологии на больших дифференцированных клеток, которые будут продолжать размножаться. Колониях будет увеличиваться в размерах, а днем ​​8-10,г клетки начнут накапливаться в некоторых районах колоний.

5. Продолжая Сердечная Дифференциация в суспензионной культуре

  1. Возьмите чЭСК культуры пластину рассекает микроскопом (предварительно теплой рассекает этапе до 37 ° C) под рассекает стерилизовать капотом. Аккуратно наметить колоний фибробластов и удалить слой, окружающий колонию (дифференцированные клетки мигрировали из колонии) с краю P2 стерильной кончика пипетки или вытащил стеклянный капилляр.
  2. Удалите старый средах, содержащих отдельные плавающие клетки фибробластов на аспирационных. Промыть чЭСК СМИ (без bFGF) один раз. Добавьте 3 мл / лунку свежим чЭСК СМИ (без bFGF).
  3. Вырезать сердечно-индуцированных колоний чЭСК на мелкие кусочки, и отделить стерильным наконечником пипетки или вытащил стеклянный капилляр.
  4. Бассейн средах, содержащих отдельные части колонии вместе в 50 мл коническую трубку. Промыть пластины один раз с 1 мл / лунку СМИ чЭСК (без bFGF) и бассейн вместе.
  5. Алиготе 4 мл / а бессывороточной чЭСК средах, содержащих колонии штук 6-и сверхнизких пластиной крепления и инкубировать при 37 ° C увлажненный инкубатор, чтобы плавающие сотовой кластеров (cardioblasts) с образованием в течение 4-5 дней.

6. Избиение кардиомиоцитов Созревание Фенотип в клей культуры

  1. Бассейн средах, содержащих плавающие cardioblasts вместе в 50 мл коническую трубку. Центрифуга при 1400 оборотов в минуту в течение 5 мин. Аспирируйте старые СМИ столько, сколько вы можете и добавить равное количество свежего чЭСК сердечной СМИ дифференциации, содержащего 10 мМ ДН.
  2. Внесите вверх и вниз, смешать плавающей cardioblasts и аликвоту 4 мл / лунку до 6-луночных планшетах. Передача пластин 37 ° С увлажненным инкубатор, чтобы cardioblasts приложить на ночь.
  3. Замените чЭСК сердечной СМИ дифференциации, содержащего 10 мМ ДН через день.
  4. На 8-й день, замените чЭСК сердечной СМИ дифференциации без ДН, и далее использоваться для замены HESC сердечной дифференциации СМИ электроннойОчень другой день. Избиение кардиомиоцитов начнут появляться примерно через 1-2 недель непрерывного культивирования после отмены ДН и увеличение числа со временем, и может сохранить сильную и ритмические сокращения в течение более 3 месяцев.

7. Представитель Результаты:

Никотинамид (ДН) оказывается достаточным, чтобы вызвать ЭСК сохраняются в системе культуры определен переход от плюрипотентности исключительно cardiomesodermal фенотип (рис. 2В). Под воздействием недифференцированных ЭСК в ДН, все клетки в колонии претерпит изменения морфологии на больших дифференцированные клетки, которые подавляют экспрессию Oct-4 и начать, чтобы выразить сердечную специфический фактор транскрипции (CSX) Nkx2.5 и α- актинина, в соответствии с cardiomesoderm фенотип (рис. 2В). Эти дифференцированные клетки будут продолжать размножаться и колонии увеличиваются в размерах. Увеличение интенсивности Nkx2.5 будетбыть обычно наблюдается в районах колонии, где клетки начинают накапливаться (рис. 2В). После индивидуальный ДН обработанных ЭСК составит плавающей сотовой кластеров (cardioblasts) в суспензионной культуре продолжать сердечной процесс дифференциации. После разрешения cardioblasts приложить и продолжить лечение с ДН в течение 1 недели, победив кардиомиоцитов начнут появляться примерно через 1-2 недель непрерывного культивирования после отмены ДН с резким увеличением эффективности по сравнению с спонтанной мульти-линии дифференциации ЭСК без лечения за тот же период времени (рис. 2). Клетки в избиении кардиомиоцитов кластеров будет выражать характерные маркеры кардиомиоцитов, в том числе Nkx2.5 и α-актинина (рис. 2). Сокращения кардиомиоцитов избиения были подтверждены электрических профилей должен быть сильным, ритмичный, хорошо скоординированной и хорошо увлекаются, с регулярными импульсами напоминает р-QRS-T комплексов видно из электродов поверхности тела в клинической ЭКГ (рис. 2, см. также видео). Кардиомиоцитов может сохранять свои сильные сократимости в течение более 3 месяцев.

Рисунок 1
Рисунок 1. Целом схемы традиционного подхода по сравнению с низкомолекулярных индукции подход для дифференциации человеческих плюрипотентных стволовых клеток в направлении специализированных функциональных клеток. (А) схема традиционного подхода с использованием мульти-линии наклона стволовых клеток человека плюрипотентных через добровольные дифференциации слой зародыша. (Б) схема хорошо контролируемых эффективной индукции стволовых клеток человека плюрипотентных исключительно частности клинически соответствующие линии от простого предоставления небольших молекул.

Рисунок 2
Рисунок 2. Никотинамид вызывает сердечные спецификация линии прямой плюрипотентности при определенных условиях и движение к избиении кардиомиоцитов. () Схематическое изображении линии протокол время направлены сердечной дифференциации ЭСК. (Б) При воздействии недифференцированных ЭСК в Никотинамид (ДН) в установленном системе культуры, большой дифференцированной октября-4 (красный) негативные клетки в колонии стали возникать, по сравнению с макетом лечение (ДМСО) ЭСК, как контроль. ДН-индуцированной октября-4-негативные клетки начали выражать Nkx2.5 (зеленый) и α-актинина (красный), в соответствии с ранней сердечной дифференцировке. Постепенное повышение интенсивности Nkx2.5, как правило, наблюдается в районах колонии, где клетки начали накапливаться. Все клетки обозначены DAPI окрашивания их ядер (синий). (С) ДН-индуцированные сердечно-совершенных ЭСК дали избиения кардиомиоцитов с резким увеличением эффективности, по оценкам сотовых кластеровTERS, что отображается ритмических сокращений (см. электрофизиологические профиля и видео), а иммунопозитивных для Nkx2.5 (зеленый) и α-актинина (красный). Фазы образы представителей большого избиения кардиомиоцитов кластеров и изображений высокого сила представитель договаривающихся сердечной мышцы показано (см. также соответствующее видео). Стрелки указывают на большое скопление кардиомиоцитов избиении используется для электрофизиологических записи. Электрофизиологические профиля избиения кардиомиоцитов показывает регулярные, увлекаются, ритмические импульсы напоминают р-QRS-T комплексов наблюдаются в клинике электрокардиограммы. Шкала бары: 0,1 мм.

Видео: Договаривающиеся кардиомиоциты отличаются от ДН-индуцированной ЭСК. Видео 1 и 2 представителя большого избиения кардиомиоцитов кластеры примерно в 1 и 3 месяца после вложения. Видео 3 и 4 представителя договаривающихся сердечной мышцы при более высокой мощности. Видео 5 показывает Typicaл небольшого кластера кардиомиоцитов избиения спонтанно отличаются от ЭСК без ДН лечения в качестве контроля.

Нажмите сюда, чтобы посмотреть видео 1.
Нажмите сюда, чтобы посмотреть видео 2.
Нажмите сюда, чтобы посмотреть видео 3.
Нажмите сюда, чтобы посмотреть видео 4.
Нажмите сюда, чтобы посмотреть видео 5.

Обсуждение

Одной из основных задач в области развития и исследования и клинические перевод был как канал широкие возможности дифференциации плюрипотентных стволовых клеток человека, чтобы желаемый фенотип эффективно и предсказуемо. Хотя такие клетки могут дифференцироваться спонтанно в пробирке в клетки всех зародышевых листков, пройдя через несколько линия совокупного этапе, в чЭСК полученных мульти-линии агрегаты (эмбриоидные тела), только очень небольшая часть клеток (<2%) спонтанно дифференцироваться в кардиомиоциты 13-15 (рис. 1А). После иммунологическая, обогащенного популяции кардиомиоцитов были в состоянии функционировать как биологические кардиостимуляторы, чтобы спасти функцию поврежденного миокарда механическим и электронным после инъекции в сердце животных моделях 13. В грызунов инфаркта моделей, привиты чЭСК происхождения сердечной потомства смогли выжить и зрелых до 12 недель, а частично remuscularИзе ранения сердца и улучшению сократительной функции 14,15. Тем не менее, неэффективность в формировании человека сердечно-совершенных клеток через мульти-линии дифференциации плюрипотентных клеток и высоким риском туморогенность после трансплантации препятствуют дальнейшие клинические перевода. Разработка стратегии обеспечения канал широкий потенциал дифференциации плюрипотентных ЭСК исключительно и предсказуемо для сердечной фенотипа является жизненно важным для использование энергии чЭСК биологии в самом сердце области. Для того чтобы добиться равномерно преобразования человека плюрипотентных стволовых клеток к определенной линии, мы использовали определенную культуру системы, способной страхования размножения недифференцированных ЭСК определить условия для хорошо контролируемых эффективной индукции плюрипотентных ЭСК исключительно частности клинически соответствующую линию от простого предоставления малых молекул (рис. 1б). Мы обнаружили, что никотинамид индуцированные сердечно-линии обязательств непосредственно из рluripotent ЭСК при определенных культурой, что дальнейший прогресс в избиении кардиомиоциты с высокой эффективностью (рис. 2). Nkx2.5 является эволюционно сохраняется фактор транскрипции гомеобокс необходимы для нормальной сердечной развития и мутации гена связаны с человеческим врожденным пороком сердца (ИБС), наиболее распространенный врожденный дефект человека 16. Выражение Nkx2.5 является самым ранним маркером клетки сердечной предшественником у всех позвоночных к настоящему времени изучены и является жизненно необходимым для сердечной septation и образование / созревания электрической проводимости системы 16. У позвоночных, начало и характер ранней Nkx2.5 выражении примерно совпадают со сроками и область сердечной спецификацию в начале эмбриогенеза, и Nkx2.5 ген продолжает быть выражены через развитие в сердце 16. В нашей модели чЭСК, ДН появился, чтобы вызвать сердечный индукции непосредственно из плюрипотентных ЭСК путем содействия выражение сердечной конкретных transcription фактор Nkx2.5 в процесс, который может эмулировать спецификации cardiomesoderm из плюрипотентных эпибласта в человеческих эмбриональных cardiogenesis. Будущие исследования позволят выявить генетические и эпигенетические молекул управления в развитии человека сердце в качестве альтернативы, которая может проложить путь для малых молекул-опосредованного прямого контроля и модуляции чЭСК судьба плюрипотентных при выводе клинически соответствующих линий для регенеративной терапии. Без лечения ДН, <2% ЭСК подвергнется спонтанной дифференцировке в кардиомиоциты избиения 12-15. При лечении ДН, мы были способны генерировать> 95% эмбриональной сердечной прекурсоров и> 50% кардиомиоцитов побои от ЭСК поддерживается под определить культуру в процесс, который может эмулировать человеческий эмбрионального развития сердца 12. В последнее время известные сердечно-судьба определения генов, были использованы для transdifferentiate фибробластов мыши в послеродовой избиения кардиомиоцитов с низкой эффективностью <0,5% 17, 18 </ SUP>. Тем не менее, перепрограммировать соматические клетки были исторически связаны с аномальной экспрессии генов и ускоренное старение с нарушением терапевтическую полезность 19-21. Наконец, протокол мы установили здесь ограничивается плюрипотентных ЭСК происходит от внутренней клеточной массы (ICM) или эпибласта из человеческой бластоцисты 4,5, могут не распространяться на другие клетки плюрипотентные, в том числе животного возникли эмбриональные клетки, ЭСК производным от ранее морулы (восемь-клетки) стадии эмбриона 22, и искусственно перепрограммировать клетки 23.

Раскрытие информации

Авторы заявляют конкурирующих интересов. XHP является основателем Xcelthera. XHP и EYS иметь интеллектуальную собственность, связанные с ЭСК.

Благодарности

XHP было поддержано Национальным институтом здоровья (NIH) гранты от Национального института по проблемам старения (NIHK01AG024496) и Юнис Кеннеди Шрайвер Национального института детского здоровья и человеческого развития (NIHR21HD056530).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер по каталогу Комментарии (необязательно)
Желатин Сигма G1890
Матригель BD биологических наук 356231 Рост фактора снижается
Человек ламинин Сигма L6274
Никотинамид Сигма N0636
DMEM/F12 Invitrogen 10565042
DMEM Invitrogen 31053036
DMEM-KO Invitrogen 10829018
Плей-сыворотка замены Invitrogen 10828028
MEM несущественные аминокислот раствор кислоты (MNAA, 100X) Invitrogen 11140050
MEM аминокислоты решение кислот (MEAA, 100X) Invitrogen 11130050
β-меркаптоэтанол Invitrogen 21985023
Albumax Invitrogen 11020021
Аскорбиновая кислота Сигма A4403
Трансферрина человека Сигма T8158
Человек bFGF PeproTech AF-100-18B
Инсулина человека Invitrogen 12585014
Человек активин PeproTech 120-14E
Определено FBS Hyclone SH30073-03
6-и сверхнизких привязанности пластины Гранулирование 3471
6-луночный планшет Гранулирование 3516

Ссылки

  1. Jawad, H., Ali, N. N., Lyon, A. R., Chen, Q. Z., Harding, S. E., Boccaccini, A. R. Myocardial tissue engineering: a review. J. Tissue. Eng. Regen. Med. 1, 327-342 (2007).
  2. Passier, P., van Laake, L. W., Mummery, C. L. Stem-cell-based therapy and lessons from the heart. Nature. 453, 322-329 (2008).
  3. Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. Human embryonic stem cells and cardiac repair. Transplant Rev. 23, 53-68 (2009).
  4. Parsons, X. H., Teng, Y. D., Snyder, E. Y. Important precautions when deriving patient-specific neural elements from pluripotent cells. Cytotherapy. 11, 815-824 (2009).
  5. J, J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. , 282-1145 (1998).
  6. Aubry, L., Bugi, A., Lefort, N., Rousseau, F., Peschanski, M., Perrier, A. L. Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16707-16712 (2008).
  7. Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. A. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nature Medicine. 12, 1259-1268 (2006).
  8. Wernig, M., Zhao, J. P., Pruszak, J., Hedlund, E., Fu, D., Soldner, F., Broccoli, V., Constantine-Paton, M., Isacson, O., Jaenisch, R. Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5856-5861 (2008).
  9. Richards, M., Fong, C., Chan, W., Wong, P., Bongso, A. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nature. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).
  10. Xu, C., Inokuma, M. S., Denham, J., Golds, K., Kundu, P., Gold, J. D., Carpenter, M. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
  11. Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nature Methods. 2, 185-190 (2005).
  12. Parsons, X. H., Teng, Y. D., Moore, D. A., Snyder, E. Y. Patents on technologies of human tissue and organ regeneration from pluripotent human embryonic stem cells. Recent Patents on Regenerative Medicine. 1, 142-163 (2011).
  13. Kehat, I., Khimovich, L., Caspi, O., Gepstein, A., Shofti, R., Arbel, G., Huber, I., Satin, J., Itskovitz-Eldor, J., Gepstein, L. Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 22, 1282-1289 (2004).
  14. Laflamme, M. A., Chen, K. Y., Naumova, A. V., Muskheli, V., Fugate, J. A., Dupras, S. K., Reinecke, H., Xu, C., Hassanipour, M., Police, S., O'Sullivan, C., Collins, L., Chen, Y., Minami, E., Gill, E. A., Ueno, S., Yuan, C., Gold, J., Murry, C. E. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infracted rat hearts. Nat. Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
  15. Caspi, O., Huber, I., Kehat, I., Habib, M., Arbel, G., Gepstein, A., Yankelson, L., Aronson, D., Beyar, R., Gepstein, L. Transplantation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes improves myocardial performance in infarcted rat hearts. J. Am. Coll. Cardiol. 50, 1884-1893 (2007).
  16. Akazawa, H., Komuro, I. Cardiac transcription factor Csx/Nkx2-5: Its role in cardiac development and diseases. Pharmacol. Ther. 107, 252-268 (2005).
  17. Leda, M., Fu, J. D., Delgado-Olguin, P., Vedantham, V., Hayashi, Y., Bruneau, B. G., Srivastava, D. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142, 375-386 (2010).
  18. Efe, J. A., Hilcove, S., Kim, J., Zhou, H., Ouyang, K., Wang, G., Chen, J., Ding, S. Conversion of mouse fibroblasts into cardiomyocytes using a direct reprogramming strategy. Nat. Cell. Biol. 13, 215-222 (2011).
  19. Kim, K., Doi, A., Wen, B., Ng, K., Zhao, R., Cahan, P., Kim, J., Aryee, M. J., Ji, H., Ehrlich, L. I. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467, 285-290 (2010).
  20. Gore, A., Li, Z., Fung, H. L., Young, J. E., Agarwal, S., Antosiewicz-Bourget, J., Canto, I., Giorgetti, A., Israel, M. A., Kiskinis, E. Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells. Nature. 471, 63-67 (2011).
  21. Feng, Q., Lu, S. J., Klimanskaya, I., Gomes, I., Kim, D., Chung, Y., Honig, G. R., Kim, K. S., Lanza, R. Hemangioblastic derivatives from human induced pluripotent stem cells exhibit limited expansion and early senescence. Stem Cells. 28, 704-712 (2010).
  22. Klimanskaya, I., Chung, Y., Becker, S., Lu, S. -J., Lanza, R. Derivation of human embryonic stem cells from single blastomeres. Nat. Protocols. 2, 1963-1972 (2007).
  23. Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи