Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Вращающийся культуре клеток системы по правам культуры клеток: Человеческие клетки трофобласта в качестве модели

17K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/3367

⸱

18 января 2012 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Tulane University Medical School, 2Physician/Scientist Program, Tulane University Medical School, 3Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Традиционный, двумерные методы клеточной культуры часто приводит к изменены характеристики относительно дифференцирования маркеры, цитокинов и факторов роста. Трехмерная культуре клеток во вращающейся системе культуры клеток (РКЦ) восстанавливает выражение многие из этих факторов, как показано здесь с extravillous клеточной линии трофобласта.

Аннотация

Область исследований трофобласта человека способствует пониманию сложной среды, формирующейся в процессе плацентации. В силу специфики данных исследований, человеческий in vivo проведение экспериментов невозможно. Комбинация первичных культур, культур эксплантатов и линий клеток трофобласта1 способствуют пониманию механизмов инвазии в стенку матки2 и ремоделирование спиральных артерий матки3,4 экстравиллезными трофобластными клетками (ЭВТ), что необходимо для успешного установления беременности. Несмотря на обширный объем знаний, полученных с помощью таких моделей, общепризнано, что in vitro модели клеточных культур с использованием клеточных линий, подобных ЭВТ, демонстрируют измененные клеточные свойства по сравнению с их in vivo аналоги5,6Клетки, культивируемые в системе ротационной культур клеток (RCCS), проявляют морфологические, фенотипические и функциональные свойства клеточных линий, подобных экстравиллезным трофобластом (EVT), которые более точно имитируют процесс дифференцировки in utero ЭВТ с повышенной экспрессией генов, опосредующих инвазию (например, матриксных металлопротеиназ (ММП)), и дифференцировку трофобласта7,8,9Линия клеток плаценты больницы Святого Георгия-4 (SGHPL-4) (предоставленная доктором Гаем Уитли и доктором Джудит Картрайт), представляющая собой клеточную линию, подобную экстравиллезным трофобластным клеткам (EVT), была использована для тестирования в системе RCCS.

Конструкция культурального сосуда RCCS основана на принципе того, что органы и ткани функционируют в трехмерной (3-D) среде. Благодаря динамическим условиям культивирования в сосуде, включая физиологически значимый сдвиг, клетки, растущие в трех измерениях, формируют агрегаты на основе естественного клеточного сродства и дифференцируются в органотипические тканеподобные структуры10,11,12. Поддержание орбитального движения жидкости обеспечивает среду с низким сдвигом и низкой турбулентностью, аналогичную условиям in vivo. Седиментация культивируемых клеток предотвращается путем регулировки скорости вращения RCCS для обеспечения постоянного свободного падения клеток. Газообмен происходит через проницаемую гидрофобную мембрану, расположенную на задней стенке биореактора. Подобно исходной ткани in vivo, клетки, выращенные в RCCS, способны реагировать на химические и молекулярные градиенты в трех измерениях (т. е. на своих апикальных, базальных и латеральных поверхностях), поскольку они культивируются на поверхности пористых микроносителей. При выращивании в виде двухмерных монослоев на непроницаемых поверхностях, таких как пластик, клетки лишены этого важного взаимодействия на своей базальной поверхности. Следовательно, пространственные ограничения, навязанные окружающей средой, оказывают глубокое влияние на то, как клетки воспринимают и декодируют сигналы из окружающего микроокружения, что указывает на важную роль 3-D среды13.

Мы использовали RCCS для создания биологически значимых 3D-моделей различных эпителиальных тканей человека7,14,15,16. Действительно, во многих предыдущих работах было показано, что клетки, культивируемые в RCCS, могут приобретать физиологически релевантные фенотипы, чего не удавалось достичь с помощью других моделей10,17-21. Таким образом, культивирование в RCCS представляет собой простой, воспроизводимый и высокопроизводительный метод, позволяющий получать большое количество дифференцированных клеток, пригодных для различных экспериментальных манипуляций. В следующем протоколе, на примере EVTs, мы подробно описываем этапы, необходимые для трехмерного культивирования адгезивных клеток в RCCS.

Протокол

1. Коллаген из бисера подготовка

  1. Перед загрузкой EVTs для 3-D клеточных культур, необходимо подготовить Cytodex-3 бусины микроносителей:
    1. Отвесить соответствующее количество Cytodex-3 бусины, необходимых для эксперимента. Этот протокол адаптирован для судна 10мл РКЦ, в котором 0,05 г из бисера не требуется. Для 50мл судна РКЦ, масштаб соответственно. В 50 мл автоклавируемый коническую трубку, смешайте 250 мг Cytodex-3 бусины с фосфатом 12 мл Дульбекко буферном растворе (DPBS). Эта сумма является достаточной для 5 РКЦ судов.
  2. Обеспечение адекватного объема присутствует в конической трубе, как автоклав процесс приведет к испарению. Свободно колпачок трубки и автоклаве в течение 10 мин при 110 ° С.
  3. Удалить конической трубе при завершении цикла автоклава и позволяют Cytodex-3 бусинки решение, чтобы охладиться.
  4. После конической трубе остынет до комнатной температуры, использование стерильных довести совокупный объем 12.5mL использованием 1X DPBS.
  5. Кап и хранения подготовленных Cytodex-3 бисером при комнатной температуре. Разрешить подготовлены бисером набухать и охладить до комнатной температуры перед использованием. Над подготовкой Cytodex-3 бусины обеспечит в течение пяти 10 мл судов РКЦ. Мы заметили, что длительного хранения Cytodex-3 бисером при комнатной температуре может привести к снижению производительности, так как коллаген дестабилизирует примерно через месяц. Cytodex-3 бусины в диапазоне размеров от 133-215 мкм.

2. Подготовка медиа

  1. Подготовка 1L РКЦ оптимизированы GTSF-2 средства массовой информации (адаптировано из 22), которая состоит из 40% MEM альфа, плюс добавки и 60% L-15 средств массовой информации в Лейбовиц (адаптировано из 22). Во-первых, подготовить 400 мл в общем объеме MEM альфа дополнен:
    21.2mM бикарбоната натрия
    0,06% пептон
    Фруктоза 0,7 мм
    1,4 мм Галактоза
    Глюкоза 5.6мм
    1% HEPES
    1% L-глютамин
    0,5% ЕЕ
    10% FBS

  2. Для подготовки исходного раствора ИТС, растворить в 5 мл стерильной подкисленных H 2 O подготовленный того ледяной уксусной кислоты (около 0.05mL). Swirl растворяться, следовать с 45 мл стерильной воды.
  3. Отвешивать достаточно L-15 порошок Лейбовиц для 600 мл среды растворяясь в ткани культуры класса H 2 O.
  4. Довести общий объем клеточной среде культуры 1L с L-15 средний Лейбовиц в. Фильтр-стерилизовать и хранить при температуре 4 ° С в темноте. Добавьте 1% пенициллин-стрептомицина индивидуально к каждому аликвоту среда, используемая.
  5. Многие формулировки средств массовой информации, кроме GTSF-2 СМИ были успешно протестированы в РКЦ. Индивидуальные лаборатории должны решить для себя, какие среды является оптимальным для эксперимента может быть исполнено.

3. Клетки и бисера Инкубационный

  1. Распространить EVTs до ~ 80% слияния, trypsinize и рассчитывать с использованием принятых практик культуре клеток.
  2. Приостановить 1x10 6 EVTs в 4 мл теплойред СМИ.
  3. Аккуратно перемешайте подготовлены Cytodex-3 бусы. Использование стерильных техник, удалите 2,5 мл подготовленных бисером, используя широкий наконечник, 10 мл пипетки серологические и передачи неиспользованных 15 мл коническую трубку. Обратите внимание, что могут быть небольшие потери из бисера, как они придают пипетки.
  4. Разрешить Cytodex-3 бусины, чтобы осесть на дне пробирки. После осаждения, использование пипетки для удаления верхнего слоя DPBS, не нарушая Cytodex-3 бусы.
  5. Смешайте подготовленные 1x10 6 EVTs в средах с подготовленной Cytodex-3 бусы.
  6. Инкубируйте клеточной шарик смеси при комнатной температуре в течение 30 мин. Периодически аккуратно перемешать. Инкубировать еще 30 мин при 37 ° С и 5% CO 2. Периодически аккуратно перемешать.

4. Загрузка RWV

  1. В кабинете ламинарного потока, удалить 10 мл РКЦ из упаковки и поместить его в стерильную, 6-а культура пластина для стабильности. См. на рисунке 1 представлена ​​диаграмма помечены RCCS.
  2. Удалите большие пробки от порта.
  3. Довести общий объем инкубации клеточной шарик смеси 10 мл подогретой СМИ.
  4. Нагрузка клетки / гранулы-смесь в РКЦ через большой порт. РКЦ должна быть наклонена под углом 45 ° (крупные до порта) при загрузке, чтобы помочь в устранении потенциальных пузырьки воздуха. Не допускать накопление положительного давления, заполнив судно медленно и неуклонно.
  5. Замените пробку в крупный порт.
  6. Удалите поршни от 3-мл шприцы и пустые места шприцы на малых портов. Добавить 1-3 мл средств массовой информации для каждого шприца. Медленно откройте два клапана. Замените поршни шприцев на шприцы мягко. Добавить файлы из одного шприца, пока все пузырьки удаляются из внутренней камеры.
  7. Возьмите РКЦ и мягко нажмите на стороне, а вращая ее перед вами, чтобы проверить пузыри. Если Есть любые пузыри, вы должны получить их из камеры, как пузырьки воздуха будут мешать образованию ое агрегаты клеток и ввести поперечных сил. Удалить пузырьки поворотом РКЦ, пока пузырьки в небольшой порт. Затем осторожно надавите на шприц на противоположной стороне, чтобы заставить пузырьков в порт и из камеры.
  8. Закройте одну сторону порта. Аккуратно надавите на поршень шприца другими ввести небольшое количество положительным давлением в сосуд, который предотвращает пузырей. Закрыть второй клапан.
  9. Нагрузка РКЦ на роторе. Начало ротации на 19rpm в 37 ° C CO 2 инкубатора.

5. Изменение СМИ

  1. Изменение СМИ через день в течение первых трех дней, то каждый день после этого.
  2. Выключите ротор и удалить РКЦ. Потяните поршни, чтобы создать некоторые всасывания, удалите шприцы друг от небольшой порт и место РКЦ на угол так, чтобы урегулировать бисером противоположность большим портом.
  3. После бусины имеют все решено, открыть один из небольших клапанов ипозволяют средства массовой информации вытекать из РКЦ и в контейнер для отходов. Удалите 2 / 3 от средств массовой информации в этой манере. Будьте уверены, чтобы не беспокоить бисера и не отказаться от любых агрегатов.
  4. Закрыть небольшой клапан и откройте большой порт. Добавить файлы обратно в РКЦ через большой порт. Замените пробку в крупный порт.
  5. Повторите шаги 4.6 - 4.9.
  6. Как агрегатов увеличиваются в размерах, вам необходимо увеличить скорость вращения, чтобы держать их во взвешенном состоянии в любое время, желательно в небольшой образец кровообращения на оптимальной скорости. Как правило, увеличение скорости между 0,3-0,7 мин после каждого кормления один раз агрегаты начинают расти заметно.

6. Сбор Размножается Клетки

  1. Удалить из РКЦ ротора. Удалить шприцы друг от небольшой порт и место РКЦ на угол так, чтобы гранулы могут поселиться противоположность большим портом.
  2. После бусины имеют все решено, открыть один из малых клапанов и позволяют СМИ вытекать изиз РКЦ и в контейнер для отходов. Удалить 1 / 3 от средств массовой информации в этой манере.
  3. Закрыть небольшой клапан и откройте большой порт. Аккуратно водоворот судна для разгона агрегатов обратно в раствор. Пустые жидкую смесь в стерильный 50 мл коническую трубку. Разрешить собранных агрегатов, чтобы обосноваться в конической трубе, прежде чем использовать супернатант тщательно мыть культуры судно максимального восстановления агрегатов. Агрегаты могут быть использованы для последующих анализов сразу же, как проточная цитометрия, вторжение анализы, иммунофлюоресценции и другие.

7. Представитель Результаты

Примером ЭВТ-подобных клеток (SGHPL-4 трофобласта клеточной линии), выращенных в РКЦ на Cytodex-3 бусины показано на рисунке 2. ЭВТ-как клеточная линия отображает прогнозы расширения от основного кластера и присоединения к соседней кластеров. Многие из бисера полностью покрыты распространяющихся клеток. После извлечения из РКЦ и плаТед на внеклеточного матрикса, ЭВТ-как 3-D выросла клетки агрессивно вторгаются и / или миграции (рис. 3). RT-PCR данные подтверждают повышенную экспрессию ММП увидеть в 3-D агрегатов, в отличие от традиционной культуре клеток монослоя (рис. 4). Интересно, что гены не связаны с вторжением также upregulated в РКЦ (табл. 1) и может помочь в разграничении таких областях, как иммунные взаимодействия с вторжением трофобласта клеток.

Рисунок 1
Рисунок 1. Мультфильм изображение вращающейся системе культуры клеток (РКЦ).

Рисунок 2
Рисунок 2. Фазового контраста микрофотография представитель совокупности через 5 дней роста в РКЦ. Стрелки указывают вторжения клетки и * означает Cytodex-3 бусины микроносителей.

figure-protocol-3 Рисунок 3. РКЦ Выращенные агрегаты были встроены в гели фибрина. Вторжение через геля фибрина наблюдается уже в () 24 часов после фибрина вложения и (B) продолжалось в течение 48 часов. Стрелки указывают вторжения клетки и * означает Cytodex-3 микроносителей бисером (адаптировано с разрешения из работы. 7).

Рисунок 4
Рисунок 4. Сравнительный желатин zymogram монослоя и РКЦ распространяется SGHPL-4 ЭВТ-подобных клеток. Про-и активные формы MMP-2 и ММП-9 выделяется РКЦ выросли клетки трофобласта (адаптировано с разрешения из работы. 7).

Таблица 1
Таблица 1. Резюме микрочипов результаты SGHPL-4 клеток, выращенных в РКЦ (адаптировано с разрешения из работы. 7).

  2. Показывает, гены, которые были ниже предела обнаружения в монослоев.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Культура техника, представленные здесь дает следователям с высоко инвазивный ЭВТ-подобных клеток. В настоящее время признано, что потеря дифференциация происходит в монослоя за счет ингибирования клеточных реакций на химические и молекулярные сигналы в трех измерениях (верхушечные, базальные и боковые поверхности клетки) 10,13. Этот метод отражает характеристики отметил внутриутробно от вторжения EVT клеток. Так как процедура имитирует обычные монослоя ткани кинетики культуры времени, но обеспечивает...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нам нечего раскрывать.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке американского Национального института здоровья грант NIH / NICHD # HD051998 (для CAM).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер по каталогу Комментарии
Cytodex микроносителей бисером Sigma-Aldrich C3275
Вращающейся системе культуры клеток (РКЦ) Synthecon РКЦ-D Включает в себя ротор база, блок питания, 4 одноразовых единиц РКЦ
РКЦ Одноразовые единиц Synthecon Контакт Synthecon
3 мл Луер-Лок кончике шприца BD 309585
10мл широким кончиком пипетки серологические BD 357504
MEM Альфа Invitrogen 12561-072
L-15 Лейбовиц в среду, порошок Invitrogen 41300-039
H 2 O, эндотоксина свободный Рыболов MT-25-055-СМ
Бикарбонат натрия Sigma-Aldrich S-7795
Пептон Fisher Scientific BP1420-100
Фруктоза Sigma-Aldrich F3510-100
Галактоза Sigma-Aldrich G5388-100
Глюкоза Sigma-Aldrich G7528-250
HEPES Invitrogen 15630-080
L-глютамин Invitrogen 25030
Инсулин-трансферрина-селенит натрия (ИТС) Sigma-Aldrich I1884
FBS Invitrogen 10437
Пенициллин-Стрептомицин Invitrogen 15140

Ссылки

  1. Knofler, M. Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion. Int. J. Dev. Biol. 54, 269-269 (2010).
  2. Cartwright, J. E. Remodelling at the maternal-fetal interface: relevance to human pregnancy disorders. Reproduction. 140, 803-803 (2010).
  3. Harris, L. K. IFPA Gabor Than Award lecture: Transformation of the spiral arteries in human pregnancy: key events in the remodelling timeline. Placenta. 32, Suppl 2. S154-S154 (2011).
  4. Whitley, G. S., Cartwright, J. E. Trophoblast-mediated spiral artery remodelling: a role for apoptosis. J. Anat. 215, 21-21 (2009).
  5. Apps, R. Genome-wide expression profile of first trimester villous and extravillous human trophoblast cells. Placenta. 32, 33-33 (2011).
  6. Bilban, M. Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures. Placenta. 31, 989-989 (2010).
  7. LaMarca, H. L. Three-dimensional growth of extravillous cytotrophoblasts promotes differentiation and invasion. Placenta. 26, 709-709 (2005).
  8. Jovanovic, M., Stefanoska, I., Radojcic, L., Vicovac, L. Interleukin-8 (CXCL8) stimulates trophoblast cell migration and invasion by increasing levels of matrix metalloproteinase (MMP)2 and MMP9 and integrins alpha5 and beta1. Reproduction. 139, 789-789 (2010).
  9. Husslein, H. Expression, regulation and functional characterization of matrix metalloproteinase-3 of human trophoblast. Placenta. 30, 284-284 (2009).
  10. Barrila, J. Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions. Nat. Rev. Microbiol. 8, 791-791 (2010).
  11. Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 281, 12-12 (2001).
  12. Unsworth, B. R., Lelkes, P. I. Growing tissues in microgravity. Nat. Med. 4, 901-901 (1998).
  13. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J. Cell. Sci. 116, 2377-2377 (2003).
  14. Bentrup, H. önerzu, K, Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes. Infect. 8, 1813-1813 (2006).
  15. Carterson, A. J. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infect. Immun. 73, 1129-1129 (2005).
  16. Myers, T. A. Closing the phenotypic gap between transformed neuronal cell lines in culture and untransformed neurons. J. Neurosci. Methods. 174, 31-31 (2008).
  17. Hjelm, B. E. Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model. Biol. Reprod. 82, 617-617 (2010).
  18. Straub, T. M. In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg. Infect. Dis. 13, 396-396 (2007).
  19. Nickerson, C. A. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infect. Immun. 69, 7106-7106 (2001).
  20. Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell. Microbiol. 7, 1771-1771 (2005).
  21. Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection. Virol. J. 6, 103-103 (2009).
  22. Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).
  23. Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).
  24. GE Healthcare. Microcarrier Cell Culture - Principles and Methods. Handbooks. , Available from: http://www.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/service_and_support~documents_and_downloads~handbooks (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

3D
Вращающийся культуре клеток системы по правам культуры клеток: Человеческие клетки трофобласта в качестве модели
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.