Модели инвазии опухоли клетки в трехмерном внеклеточного матрикса лучше отражать В естественных условиях Ситуацию, чем двумерные анализов подвижности. Использование матрицы вторжения тестов в сочетании с конфокальной микроскопии флуоресцентно-меченых клеток, подробную информацию о вторжении режимы и конкретный вклад ведущих против следующих клетки могут быть получены.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Моделирование и обработка изображений 3-мерная коллективной Вторжение сотовый
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Определяющей характеристикой рака злокачественности инвазии и метастазирования 1. В некоторых видов рака (д г. Глиомы 2), местной инвазии в окружающие здоровые ткани является основной причиной болезни и смерти. Для других видов рака (д г. Молочной железы, легких и т.д..), То процесс метастазирования, в котором клетки опухоли перейти от основной массы опухоли, колонизировать дистальных участках и в конечном счете способствовать отказу органов, которые в конечном итоге приводит к заболеваемости и смертности 3. Было подсчитано, что инвазии и метастазирования несут ответственность за 90% смертей от рака 4. В результате, наблюдается повышенный интерес в выявлении молекулярных процессов и критических посредников белка инвазии и метастазирования в целях улучшения диагностики и лечения 5.
Задача ученых рака является развитие вторжения анализов, которые достаточно похожи в естественных условиях ситуациячтобы точного моделирования болезни 6. Двумерные анализов клеточной подвижности носят информативный об одном аспекте вторжения и не принимают во внимание внеклеточного матрикса (ECM), белка ремоделирования, который также является важным элементом. В последнее время исследования изысканные наше понимание опухолевой инвазии клеток и показали, что отдельные клетки могут перемещаться по удлиненные или округлые режимах 7. Кроме того, было оценить ее вклад коллективного вторжения, при котором клетки вторгнуться в нити, листы и кластеры, особенно в наиболее дифференцированных опухолей, которые поддерживают эпителиальных характеристики, распространение рака 8.
Мы представляем более совершенный метод 9 для изучения вклада кандидата белков коллективного вторжения 10. В частности, на основе технического отдельные пулы клеток, чтобы выразить различные флуоресцентные белки, можно молекулярно анализировать деятельность и Протейнс требуется в ведущих клетки против тех, которые требуются в следующих клеток. Использование РНК-интерференции обеспечивает молекулярный инструмент для экспериментально разбирать процессы, связанные с отдельными вторжения клеток, а также в различных положениях коллективного вторжения. В этой процедуре, смеси флуоресцентно-меченых клеток высевали на нижней части вставки Transwell ранее заполненную белка Матригель ECM, то разрешено вторгаться "вверх" через фильтр и в Матригель. Реконструкция Z-серии изображений стеки, полученные конфокальной микроскопии, в трехмерных представлений позволяет для визуализации коллективно вторжения пряди и анализ представления флуоресцентно-меченых клеток в сравнении с ведущими следующие позиции.
Протокол
1. Ретровирусные маркировки клеток с флуоресцентными белками
- Пластина ретровирусных клетки тары (например Phoenix) из уровне 0,25 х 10 6 клеток на лунку 6-а блюдо в 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) / DMEM.
- Трансфекции клеток с ретровирусной ДНК через 48 часов клетки, используя Effectene в соответствии с инструкциями производителя.
- Промыть скважин в два раза со средней через 24 часа, затем добавьте 1,5 мл 10% FBS / DMEM на лунку.
- Сбор упакованных вирусов в культуре ткани средой через 48 часов с помощью пипетки и передачи до 2 мл пробирок микроцентрифужных.
- Центрифуга пр....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Анализы Матригель вторжения традиционно были созданы с клетками помещали на слой внеклеточных белков матрицей с хемоаттрактант вызванных моторики навстречу и через фильтр, в нижней части. Инвазивности был забит как функция, сколько ячеек можно было пересчитать по нижней стороне фильтра. Хотя практически нет большой разницы с "обратной" вторжение анализа, описанного выше, существует значительно больше информации о процессе вторжения, которые могут быть определены посредством визуализации вторжения в клетки, как.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Финансирование данного исследования от исследований рака Великобритании.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер по каталогу | |
| DMEM (Medium Дульбеко изменения Орла) | GIBCO | 21969 | |
| Эмбриональной бычьей сыворотки | ПАА | А15-101 | |
| Пенициллин Стрептомицин | GIBCO | 15140 | |
| 200 мМ L-глутамина (100x) | GIBCO | 25050-032 | |
| Пуромицин | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| 0,05% трипсина ЭДТА | GIBCO | 25300 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | AL-118 | |
| Lipofectamine 2000 реагентов | Invitrogen | 11668019 | |
| 6,5 мм Transwells, 8,0 мкм размер пор | Гранулирование | 3422 | |
| Полное Матригель | BD Biosciences | 354234 | |
| Кальцеин AM | Invitrogen | C1430 | |
| РНКазы | Qiagen | 19101 | |
| Пропидия йодидом | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| Конфокальной microcope | Leica | SP2MP |
Ссылки
- Olson, M. F., Sahai, E. The actin cytoskeleton in cancer cell motility. Clin. Exp. Metastasis. 26, 273-287 (2008).
- Hoelzinger, D. B., Demuth, T., Berens, M. E. Autocrine factors that sustain glioma invasion and paracrine biology in the brain microenvironm....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
