Методическая статья

Пространственно-временные манипуляции малых активность ГТФ на субклеточном уровне, и на шкале времени секунды в живых клетках

DOI:

10.3791/3794

⸱

9 марта 2012 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, Center for Cell Dynamics, Johns Hopkins University, 2Graduate School of Pharmaceutical Sciences, University of Tokyo, 3Biomedical Engineering, Johns Hopkins University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод пространственно-временной контроль деятельности малого ГТФ света описывается. Этот метод основан на рапамицин вызванных FKBP-FRB гетеродимеризации и фото-останов системы. Оптимизация светового облучения позволяет пространственно-временном управлять активацией малых ГТФаз на субклеточном уровне.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Динамическое регулирование семьи Ро малого triphosphatases гуанозин (GTPases) с большой пространственно-временной точностью имеет важное значение для различных клеточных функций и мероприятий 1, 2. Их spatiotemporally динамичный характер был выявлен по визуализации их деятельности и локализации в реальном времени 3. Для того чтобы получить более глубокое понимание их роли в различных клеточных функций на молекулярном уровне, то следующим шагом должно быть возмущение белка деятельность в точном внутриклеточной локализации и времени.

Для достижения этой цели мы разработали метод светоиндуцированного, пространственно-временное контролируемое активации малых ГТФаз путем объединения двух методов: (1) рапамицин вызванных FKBP-FRB гетеродимеризации и (2) фото-останов метод рапамицина. С помощью рапамицина опосредованного FKBP-FRB гетеродимеризации, мы разработали метод быстрого индуцибельной активации или инактивации малых ГТФаз includiнг Rac 4, Cdc42 4 RhoA 4 и Рас-5, в котором рапамицин вызывает перемещение FKBP слившихся GTPases или их активаторов, к мембране, где ФРС на якорь. В связи с этим гетеродимеризации системы, мы также разработали фото-останов системы рапамицина аналогов. Фото-клетках соединение маленькие молекулы, чья деятельность подавляется с photocleavable защиты группы, известной как удерживание группы. Для подавления гетеродимеризации деятельность полностью, мы разработали в клетке рапамицина, которые привязаны к макромолекуле такие, что в результате большого комплекса не может пересечь плазматической мембраны, что приводит к практически без фоновой активности в качестве химического dimerizer внутри клеток 6. На рисунке 1 показана схема нашей системы. Благодаря сочетанию этих двух систем, мы набранных на местах Rac активатора плазматической мембраны на шкале времени в секундах и достигли светоиндуцированного Rac активации на субклеточном левэль-6.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Трансфекция ДНК плазмиды

  1. Добавить плазмидных ДНК, 0,5 мкг мембранного привязанные ФРБ (далее LDR) и 0,5 мкг FKBP-Tiam1 (Т-клеточной лимфомы вторжения и метастаза вызывающие белок 1: Rac активатор) помечены флуоресцентным белком до 37,5 мкл дН 2 O. Добавить 1 мкл FuGENE HD.
  2. Vortex и инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут. Между тем, приступить к шаги 1.3-1.8.
  3. Промыть каждую лунку 8-и камеру с 50 мкл поли-D-лизина.
  4. Вымойте центр каждой лунки с дН 2 O.
  5. Trypsinize 80-85% сливной NIH-3T3 клеток и развести до 10 мл питательной среды (DMEM с 10% FBS).
  6. Удалить 375 мкл суспензии и центрифуги при 1750 оборотов в минуту в течение 3 минут.
  7. Аспирируйте средствах массовой информации, стараясь не нарушать гранул.
  8. Добавить 750 мкл DMEM Вт / 10% FBS и ресуспендируют.
  9. Добавить клеточной суспензии для дН 2 O / ДНК / FuGENE HD решение и аккуратно перемешать.
  10. Добавьте 250мкл клеточной ДНК / подвески в каждую лунку (заполнить до 3-х скважин).
  11. Инкубируйте трансфицированных клеток при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 15-18 часов.

2. Подготовка CRB-решения

  1. Обобщить клетке рапамицин-биотин аддукт (CRB). См. "Синтетические схемы сгь" для подробностей. Короче говоря, останов и биотин фрагментов готовят отдельно. Останов часть является то, конъюгированных с рапамицин (LC лаборатории), продукт в дальнейшем связан с остатком биотина на средства клик реакция 7 позволить себе CRB.
  2. Подготовить 1 мкМ фондовый решение сгь в ДМСО.
  3. Растворите 1 мг авидин в 250 мкл PBS в 0,5 мл трубки Эппендорф.
  4. Добавить 1 мкл исходного раствора сгь для растворения авидин. Смешайте путем обращения в несколько раз.
  5. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут, чтобы дать CRB-авидин сопряжены (CRB-) Решение.
  6. Исключить несвязанных малых молекул и очистить CRB-помощью гель-колонки.

3. Микроскопии и свет Освещение на субклеточном уровне

  1. Сыворотка голодать трансфицированных клеток в DMEM без FBS в течение 12 часов.
  2. Осторожно аспирации средства массовой информации от клетки и добавить 250 мкл подготовленного 400 нм CRB-решения (начиная с шага 2.6).
  3. Для визуализации динамики белков в живых клетках в субклеточных разрешение до и после лечения свет, вращение диска микроскопии (рис. 2а). УФ-освещенности достигается за счет сочетания оптики УФ-светодиодной (365 нм) с эпи-флуоресценции (рис. 2б).
  4. Метаморфизма программное обеспечение было использовано для захвата изображений флуоресценции трансфицированных клеток каждые 15 секунд.
  5. Определить координаты и размеры освещение места с помощью стеклянной пластинки покрыта флуоресцентными красителями возбуждается ультрафиолетовым светом. Размер можетбыть изменены путем применения объектива с различными увеличениями и выбрав оптического волокна с различными размерами ядра.
  6. После определения фонового уровня мембранного ероша, свет УФ облучение на периферии клетки. Следующие два шага, чтобы противопоставить предшествующий локализованных эффектов.
  7. Глобально облучение клеток с 365 нм свет обеспечивается ртутной лампы.
  8. Растворите uncaged, таким образом, первоначальный рапамицина в ДМСО, а затем в ФСБ (400 нМ финал), и добавьте решение изображения камеры, чтобы вызвать глобальные последствия.

4. Представитель Результаты

В качестве примера представитель результатов показано на рисунке 3. УФ-облучения светом в малой области вблизи сотовых края быстро индуцированного образования локализованных оборками и только у облученных области. Чтобы убедиться, что это действительно местное деятельности, то мы глобально облученных клеток с УФ, или добавлять рапамицин с объемной информации, как беч индуцированного формирования глобальной раздражение всей мембране. Для количественного анализа, мы разделили клетки-мишени на четыре квадранта, и рассчитывали частоту ряби формирование в каждом секторе на местном, так и после глобального стимулирования в различных условиях, в том числе управления (рис. 4). Только такое сочетание УФ-облучения, CRB-и соответствующие FKBP-FRB конструкции, вызывает местное рассердило.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Схема пространственно ограниченных белка в клетке димеризации использования рапамицина-авидин сопряжены (CRB-A) и ультрафиолетового излучения. УФ-облучение расщепляет линкер между рапамицина и биотин, что приводит к высвобождению химических dimerizer (HE-Рапа, C40-O-(2-гидроксиэтил) рапамицин), и его побочных продуктов. Выпустила dimerizer затем диффундирует в клетки и вызывает димеризации между FKBP-POI (белок) и плазменных коррRane якорь ФРБ только в непосредственной близости от области облучения (синий круг). Без УФ-облучения, FKBP и ФРС не связывают (красный крест), следовательно, производить никакого эффекта. (Copyright @ ACS2011) 6

figure-protocol-2
Рисунок 2. Изображение настроенных конфокальной флуоресцентной микроскопии. (А) Фронтальный вид на конфокальной микроскопии (в виде перевернутой Axiovert 200, Zeiss). (Б) Крупный план, вид сверху соединительное устройство для РПИ флуоресценции и ультрафиолетового освещения.

figure-protocol-3
Рисунок 3. Пространственно ограничивается рябить образования в трансфицированных NIH3T3 клетки индуцированные локализованных УФ-облучения. Конфокальной флуоресцентной изображения NIH3T3 клетки фибробластов, которые трансфицированных YFP с метками FKBP-Tiam1 (Rac активатор) и LDR (мембраны закреплены ФРС) подверглись облучению в ограниченном пространстве вблизи ее края с LED свет при 365 нм в течение 15 секунд, начиная с 210 сек при наличии CRB-сопряженных в объеме средств массовой информации. Это обращение последовало глобальное освещение с ртутной лампой в течение 1 сек на 1063 секунд и глобальных добавление рапамицина окончательной 400 Нм при 1560 сек. Клеток показали, почти не шевелил деятельность в начале (а), но показал, пространственно ограниченных ероша после локализованного освещения (желтый круг) (б). Клеток показали глобальное образование раздражение после глобального освещения и добавление рапамицина (CD), что указывает на формирование местных раздражение было вызвано пространственно ограниченных активации Rac. Шкала бар: 10 мкм. (Copyright @ ACS2011) 6

figure-protocol-4
Рисунок 4. Частота рябить образование в квадрантах трансфицированных NIH3T3 клеток. Местное УФ-излучение с CRB-и следующие глобальные УФ-облучения были выполнены на 13 клеток. CRB- CRB-без УФ-облучение или локальном облучении УФ-с или без авидин в объеме средств массовой информации. Мы собрали данные из клеток с низким формирование ряби фона, но имели возможность рапамицина вызванных рябить образование, которое мы проверяли после каждого эксперимента, подтверждающие формирование глобальной рябить в результате того рапамицина (конечная 400 нм). Эти результаты показали, что CRB-и локального облучения УФ необходимые для формирования местных рябить в клетках. (Copyright @ ACS2011) 6

Сокращения:

FKBP: FK506-связывающий белок
ФРБ: FKBP-рапамицин-связывающий белок
Tiam1: Т-клеточная лимфома вторжения и метастаза вызывающие белок 1 (Rac ГЭФ)
LDR: Лин-DSAG компоновщика-FRB (Lyn: N-концевых 11 аминокислот из Лин-киназы)
HE-Рапа: C40-O - (2-гидроксиэтил) рапамицина
сгь: в клетке рапамицин с остатком биотина
CRB-: сгь сопряженных с авидином

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описали технику, которая использует новые соединения в клетках вместе с FKBP-FRB гетеродимеризации системы для того, чтобы манипулировать Rho ГТФ деятельность в точном внутриклеточной локализации на временной шкале в секундах.

Существуют три ограничения данного подхода. Во-первых, потому, что метод основан на предотвращение или разрешение диффузии dimerizer через плазматическую мембрану, цель сотовой место должно быть мембране или его окрестностях. Дальнейшая оптимизация химической структ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано НИЗ финансирования научных исследований (DK090868 и GM092930 ТИ). Существует в ожидании патента на клетке рапамицин аналог.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента / оборудование Компания Номер по каталогу
Рапамицина Tecoland RAPA99
FuGENE HD Roche 04709691001
Авидин Сигма A9275-10мг
ДМСО Сигма D2650-5X5ML
Гель-колонки GE Healthcare Спин Trap G-25
С прозрачным дном 8-и камера Thermo Scientific 12-565-47
Перевернутый флуоресцентный микроскоп Zeiss Axiovert200M
УФ-светодиодный источник света Рапп Opto Electronics UVILED
Конфокальной вращающийся диск Корпорация Yokogawa Electric CSU10
CCD камеры Hamamatsu Photonics ORCA-ER
Объектив 100x Zeiss План Apochromat

Синтетическая схема CRB (Copyright ACS2011) 6

figure-materials-1
Синтетические условиям: (а) BnBr, K 2 CO 3, DMF (б) f.HNO 3 АсОН (с) ТФК (г) пропаргил-Br, K 2 CO 3, DMF, (д), глицерин, кот. PTSA, толуол (е) NaBH 3 CN, TiCl 4, MeCN (г) Т 2 O, пиридин (H) метанол HCl, (я) LiAlH 4, ТГФ (к) TsCl, пиридин, CH 2 Cl 2 (к) NaN 3, DMF (л) 8, 2,6-ди-трет-butylpyridine, CH 2 Cl 2 (м) 13, CuSO 4, аскорбиновая кислота, 2-пропанол, H 2 O, CH 2 Cl 2.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420, 629-635 (2002).
  2. Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T. Small GTP-binding proteins. Physiol. Rev. 81, 153-208 (2001).
  3. Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M. Spatiotemporal regulation of small GTPases as revealed by probes based on the principle of Forster Resonance Energy Transfer (FRET): Implications for signaling and pharmacology. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 51, 337-358 (2011).
  4. Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways. Nat. Methods. 2, 415-418 (2005).
  5. Komatsu, T. Organelle-specific, rapid induction of molecular activities and membrane tethering. Nat. Methods. 7, 206-208 (2010).
  6. Umeda, N., Ueno, T., Pohlmeyer, C., Nagano, T., Inoue, T. A photocleavable rapamycin conjugate for spatiotemporal control of small GTPase activity. J. Am .Chem. Soc. 133, 12-14 (2011).
  7. Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 2004-2021 (2001).
  8. Kennedy, M. J. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat. Methods. 7, 973-975 (2010).
  9. Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461, 997-1001 (2009).
  10. Wu, Y. I. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461, 104-108 (2009).
  11. Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nat. Biotechnol. 27, 941-945 (2009).
  12. Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. Chemically controlled protein assembly: techniques and applications. Chem. Rev. 110, 3315-3336 (2010).
  13. Suh, B. C., Inoue, T., Meyer, T., Hille, B. Rapid chemically induced changes of PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels. Science. 314, 1454-1457 (2006).
  14. Varnai, P., Thyagarajan, B., Rohacs, T., Balla, T. Rapidly inducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact living cells. J. Cell. Biol. 175, 377-382 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Light Induced ActivationRapamycin HeterodimerizationPhoto Caged RapamycinSubcellular LocalizationUV Light ManipulationMembrane Ruffling AnalysisSpinning Disc ConfocalFKBP FRB SystemRAC Activator Recruitment

Похожие статьи