Анализируя сотовой Интернализация наночастиц и бактерий нескольких спектральных изображений проточной цитометрии

Summary

В этой статье мы опишем метод с использованием нескольких спектральных изображений проточной цитометрии для количественного определения интернализации polyanhydride наночастиц или бактерий RAW 264.7 клеток.

Abstract

Наночастиц системы появились как ценный инструмент в вакцинации благодаря их способности эффективно доставлять грузы, в том числе белков, антиген представляющих клеток ^1-5. Интернализация наночастиц (NP) на антиген представляющих клеток является важным шагом в создании эффективного иммунного ответа на антиген инкапсулированные. Чтобы определить, как изменения в функции воздействия наночастиц разработки, мы стремились развивать высокую пропускную способность, количественного экспериментального протокола, совместимое с обнаружением интернализованной наночастиц, а также бактерии. На сегодняшний день два независимых методов микроскопии и проточной цитометрии, были методы, используемые для изучения фагоцитоза наночастиц. Высокая пропускная способность природы проточной цитометрии создает надежные статистические данные. Однако, из-за низкого разрешения, он не точно количественно внутреннюю против клетки связанных наночастиц. Микроскопии генерирует изображения с высоким пространственным разрешением, чowever, это отнимает много времени и включает в себя небольшие размеры образцов ^6-8. Multi-спектральных изображений проточной цитометрии (MIFC) является новой технологией, которая включает в себя аспекты как микроскопии и проточной цитометрии, который выполняет многоцветные спектральные флуоресценции и светлого поля изображения одновременно через ламинарный ядра. Эта функция обеспечивает точный анализ интенсивности флуоресцентного сигнала и пространственных отношений между различными структурами и клеточных функций на высокой скорости.

Здесь мы опишем метод с использованием MIFC для характеристики клеточных популяций, которые усвоили polyanhydride наночастиц или Salmonella enterica серовар Typhimurium. Мы также опишем приготовление суспензии наночастиц, мечения клеток, приобретение по системе ImageStream ^X и анализа данных с использованием идей применения. Мы также продемонстрировать применение метода, который может быть использован для отличать интернализации рathways для наночастиц и бактерий с помощью цитохалазином-D в качестве ингибитора актин-опосредованного фагоцитоза.

Protocol

1. RAW 264.7 культуре клеток

1. Урожай RAW 264.7 клеток от колб, когда они достигают слияния, очищая их осторожно ячейки скребком. Граф и пластины им в 24-и клеточных культур блюдо с плотностью 5 × 10 ⁵ клеток / лунку в 0,5 мл полного изменения Дульбеко Eagle Средний (cDMEM, 10% тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 2 мМ Glutamax, и 10 мМ HEPES) и инкубировать в течение ночи при 37 ° С в 5% СО ₂ инкубатора.

2. Патогенные сальмонеллы enterica серовар Typhimurium 14028 трансформации и культуры

1. Внедрение рекомбинантных плазмид, выразив зеленый флуоресцентный бел....

Discussion

Исследования показали, что биоразлагаемые наночастицы на основе поли (молочной-со-гликолевой кислоты (PLGA) или полиангидриды могут быть использованы для доставки антигенов или инкапсулированных препаратов к клеткам-мишеням. Поглощение этих наночастиц фагоцитирующих клеток имеет важное значение для их эффективности, в результате чего количественный . анализа интернализации решающее значение в разработке новых систем доставки наночастиц При использовании этого метода, дифференциальные поглощения наночастиц различных типо.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
RAW 264.7 клеточной линии	Американская коллекция типовых культур (АТСС)	TIB-71
Дульбекко изменения Eagle среднего (DMEM)	CellGro	10-013-CV
Эмбриональной телячьей сыворотки	Атланты биологические	S 11150	Премиум класса
Glutamax	Гибко	35050-061
HEPES	Гибко	15630-080
24-луночного планшета	ТЭС	92024
Колбы клеточных культур	ТЭС	90151
Сотовые скребок	ТЭС	99002	24 см
Сальмонеллы enterica серовар Typhimurium	ATCC	14028
BTX ECM630 Electro Манипулятор сотовых	BTX Гарвардского аппарата
MOPS	Fisher Scientific	BP308
Фосфатного буфера (PBS)	CellGro	21-040-CV
Ультразвуковые жидкости процессор	Misоникс	S-4000
Цитохалазином-D	Sigma-Aldrich,	C8273
Формальдегид	Polysciences	04018
Вымойте буфер	2% тепла инактивированной FBS, 0,1% азида натрия в PBS.
Пермский край / промывочный буфер	BD Biosciences	554714
Прозрачный колпак микропробирок оснастки	Сигма	T4816
Alexa Fluor 660 фаллоидином	Invitrogen	A22285
ImageStream X	Amnis CorporaТион	100200	Опции: 658nm лазер, автоматический пробоотборник
Азид натрия	Fisher Scientific	S 227I-500