Методическая статья

Протеазы и кислотно-катализируемой маркировки рабочих процессов Применение

11.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/3891

⸱

20 февраля 2013 г.

 , 
1Boston Biomedical Research Institute

В этой статье

Краткое содержание

Стабильный изотоп маркировки рабочих процессов использования 18 O обогащенной воды (Leo-процессы) являются универсальными инструментами для количественного и качественного исследования протеомики. В протеазы помощь (палео) рабочих процессов, 18 O-атомы вводятся путем протеолитического расщепления и карбоксильных реакций обмена кислорода опосредовано протеаз. В кислотно-катализируемых (Aleo) рабочий процесс, 18 O-атомы вводятся карбоксильной обмен кислорода при низких рН.

Аннотация

Стабильные изотопы являются незаменимыми инструментами в биологической масс-спектрометрии. Исторически, 18Стабильные изотопы кислорода широко используются для изучения каталитических механизмов протеолитических ферментов1-3С появлением протеомики на основе масс-спектрометрии ферментативный катализ включения 18Использование атомов кислорода из стабильно изотопно-обогащенной воды стало популярным методом количественного сравнения уровней экспрессии белков (рецензировано Fenselau и Yao4Мияги и Рао5 и Ye и др.6). 18O-маркирование представляет собой простой и недорогой альтернативный метод химического (напр. iTRAQ, ICAT) и метаболические (например, методы маркировки SILAC7В зависимости от используемой протеазы, 18О-маркировка может привести к включению до двух 18Атомы O в С-концевой карбоксильной группе продукта расщепления3Реакцию мечения можно разделить на два независимых процесса: расщепление пептидной связи и реакцию обмена кислорода по карбоксильной группе.8В нашей системе PALeO (pпротеазаас поддержкой лМаркировка еприменение 18Овода, обогащенная [веществом]) адаптация ферментативной 18Для O-метки мы использовали 50% 18Вода, обогащенная O, для создания отличительных изотопных сигнатур. В сочетании с тандемной масс-спектрометрией высокого разрешения с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией и времяпролетным анализатором (MALDI-TOF/TOF MS/MS) характерные изотопные профили могут быть использованы для идентификации продуктов расщепления с высокой степенью специфичности. Ранее мы применяли методологию PALeO для обнаружения и характеристики эндогенных протеаз9 и мониторинг протеолитических реакций10-11Поскольку метод PALeO кодирует саму суть реакции протеолитического расщепления, экспериментальная установка остается простой, а этапы биохимического обогащения продуктов расщепления могут быть исключены. Метод PALeO может быть легко расширен для (i) экспериментов по изучению кинетики, позволяющих отслеживать динамику реакций протеолитического расщепления, и (ii) анализа протеолиза в сложных биологических образцах, представляющих физиологические условия. Эксперименты PALeO-TimeCourse помогают выявить лимитирующие стадии процессинга и промежуточные продукты в сложных каскадных реакциях протеолиза. Кроме того, реакция PALeO позволяет идентифицировать протеолитические ферменты, такие как сериновая протеаза трипсин, способная повторно связывать продукты своего расщепления и катализировать включение второго 18O-атом. Такие «двойномаркированные» ферменты могут быть использованы для постдигестии 18О-маркировка, при которой пептиды маркируются исключительно посредством реакции обмена по карбоксильному кислороду. Наша третья стратегия расширяет возможности маркировки с использованием 18Обогащенная кислородом вода, помимо ферментов, использует условия кислого pH для введения 18Введение O-стабильных изотопных меток в пептиды.

Протокол

Представленные Лео-процессов позволяют стабильный изотоп маркировки белков дайджесты и синтетических пептидов. Эти временные Конечно экспериментов (рис. 1) применяются к сравнительной протеомики и количественные исследования, а также протеазы исследований. Каждый рабочий процесс состоит из двух экспериментальных этапов (рис. 2): а) время решен выборки соответствующих 18 O-стабильных изотопов в кодировке реакции (протеазы катализируемой расщепления пептида; протеазы-катализируемой реакции карбоксильных обмен кислорода, кислотно-катализируемых карбоксильной обмен кислорода реакции) и B) анализ методом масс-спектрометрии и графическое представление 18 O-включение кинетики.

Эксперименты А. TimeCourse

I. Палео-TimeCourse: протеазы катализируемой маркировки протеолитических раскол

  1. (Необязательно) дисульфидные связи белков (10 мкМ) и пептидов (250 мкм) уменьшается с DTT (конечная концентрация 2,5 мм)в 25 мМ NH 4 HCO 3 (как свежеприготовленный) путем инкубации в течение 30 мин при 50 ° С.
  2. (Необязательно) бесплатно цистеина алкилируют с иодацетамида (конечная концентрация 10 мМ) в 25 мМ NH 4 HCO 3 путем инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте.
  3. В зависимости от протеазы интерес, белка / пептида решения должны быть очищены, до удаления остатков буфера и алкилирования агента. Используйте PepClean C-18 спин столбцов (Thermo) для очистки пептидов и Vivaspin центробежные концентраторы (Sartorius) для обмена буферов для образцов белка.
  4. Растворяться / обмена пептидов / белков в 20 мкл буфера для реакции протеазы (ECE-1: 50 мМ MES-KOH, рН 5,5; трипсин: 25 мм NH 4 HCO 3, рН 8,0), содержащего 1:1 (объем / объем) окончательное H 2 18 O (95%, Sigma ISOTEC).
  5. Вывод нулевой точки отбора проб время до добавления протеазы: смешайте 0,5 мкл реакционной смеси и 0,5 мкл альфа-циано-4-гидроксикоричнойМатрица кислоты (10 мг / мл в 50% ацетонитрила, 0,1% TFA). Пятно образца на Opti-TOF 384 MALDI мишень (AB SCIEX) и оставить капель растворителя при комнатной температуре до полного высыхания (примерно 5 минут).
  6. Сплит реакции раствора на две аликвоты. Первый аликвоты будет инкубировали с протеазы интерес (ЕЭК-1: 75 нм; трипсин: 0,04 нм) при комнатной температуре или рекомендуемая температура для данного фермента. Вторая аликвота будет инкубировали без протеазы и будет служить контрольным образцом. Первый аликвоты представляет собой стандартный образец для протеазы катализируемой 18 O маркировки и могут быть использованы для пептидов и белков идентификации, обнаружения протеолитической деятельности и мониторинга протеолитических реакций расщепления. Вторая аликвота используется, чтобы показать, что 18 O-включение индуцированный протеазы, поэтому ни маркировки, ни декольте, как ожидается, для этого образца.
  7. Следуйте реакции путем удаления реакции аликвоты и кровянистые выделения их в качестве де-описанными в пункте 5 в интервалах времени, как кажется нужным. Условия реакции, описанные выше, используются для мониторинга протеолитических реакций в течение четырех дней (около 24 мест). Начало отбора проб каждые 5 мин до 30 мин, затем определить каждые 30 мин до 2 ч, затем каждый час до 8 час и каждые 8 ​​часов до 4 дней. Расщепление продукты должны появиться в течение первых 12 ч и при нанесении должна быть полностью гидролизованных после 24 часов. Срок инкубации реакцию позволяют определить стабильные продукты реакции, которые являются дискретными от реакции промежуточных продуктов, которые подвергаются дальнейшей обработке. В зависимости от вопроса исследования и приблизительно фермент-субстратных пар, кровянистые выделения времени и температуры инкубации должны быть модулированный для обеспечения оптимального отбора проб реакции.
  8. После последнего момента времени реакции заметили или между расширенным интервалом кровянистые выделения, пластина MALDI цель представляется MALDI-TOF/TOF MS / MS анализа, как описано ниже (раздел B).

II. Палео-TimeCourse: Postdigestion маркировки протеолитических концах

  1. (Необязательно) дисульфидные связи белков (10 мкМ) и пептидов (250 мкм) уменьшается с DTT (конечная концентрация 2,5 мМ) в 25 мМ NH 4 HCO 3 (как свежеприготовленный) путем инкубации в течение 30 мин при 50 ° С.
  2. (Необязательно) бесплатно цистеина алкилируют с иодацетамида (конечная концентрация 10 мМ) в 25 мМ NH 4 HCO 3 путем инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте.
  3. В зависимости от протеазы интерес, белка / пептида решения должны быть очищены, до удаления остатков буфера и алкилирования агента. Используйте PepClean C-18 спин колонки для очистки пептидов и Vivaspin центробежные концентраторы для белка буфер обмена.
  4. Растворяться / обменять очищенных пептидов товаров / белков в 20 мкл буфера для реакции протеазы (например, трипсин: 25 мм NH 4 HCO 3, рН 8,0) и дайджест протеазы, представляющих интерес для завершения (например, трипсин: 0,04 нм 3;7 ° C; 12 ч).
  5. Очистка продуктов расщепления с PepClean C-18 спин столбцов. Этот шаг позволит устранить остаточные деятельности протеазы.
  6. Растворяться / обменять очищенных пептидов продукцию в 20 мкл буфера для реакции протеазы (трипсин: 25 мм NH 4 HCO 3, рН 8,0), содержащего 1:1 (объем / объем) окончательное H 2 18 O.
  7. Вывод нулевой точки отбора проб время до того фермента: Смешать 0,5 мкл реакционной смеси и 0,5 мкл альфа-циано-4-гидроксикоричной кислоты матрицы (10 мг / мл в 50% ацетонитрила, 0,1% TFA). Пятно образца на мишень MALDI и оставить капель растворителя при комнатной температуре до полного высыхания (примерно 5 минут).
  8. Сплит реакции раствора на две аликвоты. Первый аликвоты будет инкубировали с протеазы интерес (например, трипсин: 0,04 нм) при комнатной температуре или рекомендуемой температуры для конкретного фермента. Вторая аликвота будет инкубировали без протеазы и будет служить в качестве контроля. ПервыйАликвоту представляет собой стандартный образец для протеазы катализируемой 18 O-postdigestion маркировки и могут быть использованы для пептидов и белков количественной оценке. Вторая аликвота используется, чтобы показать, что 18 O-включение катализируется протеазы, поэтому нет маркировки, как ожидается, для этого образца.
  9. Следуйте реакции путем удаления реакции аликвоты и определение их, как описано в шаге 7.) На интервалах времени, как кажется нужным. Например, мы определили первоначально каждые 5 мин до 30 мин и каждые 15 мин после этого контролировать карбоксильной реакции обмена кислорода, катализируемой трипсином.
  10. После последнего момента времени реакции заметили или между расширенным кровянистые выделения интервалов пластины MALDI цель представляется MALDI-TOF/TOF MS / MS анализа, как описано ниже (раздел B).

III. Aleo-TimeCourse: кислотно-катализируемой маркировки карбоксильных групп

  1. Инкубируйте отдельных пептидов (50 нм) с 1:1 (объем / объем) 18 O-обогащенных вод в тОн наличии или отсутствии (контроль) 0,1% (V / V) окончательный трифторуксусной кислоты (общий объем 30 мкл).
  2. Примеры продуктов реакции ежедневно в течение 48 дней со-кровянистые выделения на 0,5 мкл смеси с 0.5μl альфа-циано-4-гидроксикоричной кислотой матрицей (10 мг / мл в 50% ацетонитрила, 0,1% TFA) непосредственно на целевую MALDI пластину.
  3. Между кровянистые выделения интервалов и после кровянистые выделения из конечной точке времени реакции представить MALDI мишень для MALDI-TOF/TOF MS / MS анализа, как описано ниже в разделе В.

B. MALDI-TOF/TOF MS / MS сбора и анализа данных

  1. Масс-спектры приобретенные на 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer (AB SCIEX).
  2. Перед проведением анализа, прибор откалиброван смесью пептидов стандартов (Mass комплект стандартов для калибровки AB SCIEX TOF / TOF инструменты), максимальная масса которых погрешность измерений допуск ± 50 промилле и минимальное число шесть пиков, чтобы соответствовать.
  3. MS спектра (диапазон масс400 - 4000 м / г), приобретенных в трех экземплярах использованием режиме положительных ионов с регулируемой интенсивности лазерного (3400 - 3800; шаг 50) с приемлемыми основной пик интенсивности диапазоне 2,000 - 45,000. Одиночные выстрелы приобретены для суб-спектров, с 400 общей кадров / спектра, остановить условия вступают в силу после 800 суб-спектры приобретенных (или не пройти) или 400 суб-спектры критерии принятия проход. В случае низкого обильные образцов или в присутствии сложных биологических фоны нижней части диапазона обнаружения MS должна быть увеличена до 800 м / г. Кроме того, это может быть необходимо для удаления соли и других мешающих соединений с шагом образца очистки, как описано выше, или путем разделения LC.
  4. MS файлы данных (. Сахарным диабетом 2 типа файлов) вывозимых с 4000 Series Проводник программного обеспечения сбора данных и импортировать в нашей собственной лаборатории информационной системы, которая использует MASCOT Distiller программного обеспечения (Matrix Science) для спектральной обработки и пик обнаружения. Изотопный конвертыявляются деконволюции и 18 O-включение отношений определяется автоматически с помощью алгоритма, похожий на тот, описывается Mason и соавт. 12 и адаптировать нашу группу 9. Кроме того, программные средства, такие как ZoomQuant 13 и Viper 14, а также коммерческие пакеты программного обеспечения, таких как BioWorks Xpress (Thermo Fisher Scientific) и талисман Distiller количественного Toolbox (Matrix Science) может deconvolute 18 O-тип данных 15,16. 18 O-включение отношения выражаются в относительных вкладов отдельных видов пептидов изотоп (например, пептиды, содержащий 16 O, 18 O 1 или 18 O 2) на всю изотопного конверт.
  5. Для каждого TimeCourse эксперимент, молекулярной массы ([M + H] +) для всех обнаруженных видов пептидов, взяты из соответствующих файлов MS данных и значения сегментирования на 100 ширина массы промилле.
  6. По меньшей мере три [M + H] +, которые будут доступны необходимые для заполнения корзины. В случае известных субстратов, фильтруют бен список сравнивается со списком протеолитических продуктов расщепления предсказать, исходя из последовательности пептида подложке с использованием ExPASy инструмент FindPept 17 ( http://au.expasy.org/tools/findpept.html ) и 200 частей на миллион массы ошибки принятия терпимости.
  7. MS / MS спектр приобретаемых для всех значений масс продуктов расщепления предсказано FindPept инструментом и для бен значения, которые имеют 18 O-инкорпорации связанных с ними. MS / MS данных, приобретенных на 4800 MALDI TOF / TOF анализатор в 1кВ отражатель режиме положительных ионов с фиксированной интенсивности лазерного 4200 и CID-газа в автономном режиме. 50 выстрелов приобретенные в рандомизированном картины в суб-спектров до в общей сложности 40 суб-спектров в месте (уступая в общей сложности 2000 выстрелов / место).
  8. MS / MS файлы данных (. Сахарным диабетом 2 типа файлов) экспортируется из серии 4000 ExploRER данных приобретение программного обеспечения и импортировать в нашей собственной информационной системы лаборатории, пики обнаружены и MS / MS пик списки, связанные с соответствующими сегментирования данных MS.
  9. Для идентификации пептидов, MS / MS пик списки искали против SwissProt базы данных с помощью двигателя MASCOT поиска со следующими параметрами поиска: нет фермента специфику, 150 млн иона предшественника и 0,2 Da фрагмент допуски масса иона.
  10. Пептиды идентификации может быть дополнительно проверены с использованием программного обеспечения Data Explorer (AB SCIEX), подтвердив, характерный 18 O-включению моделей по Y-серии осколочные ионы, как описано Шевченко и др.. 18.

С. Подготовка спектральной Время и 18 O-включение участков

Спектральных участках времени: MS файлы данных (. Сахарным диабетом 2 типа файлов) для каждой точки времени реакции на экспорт из программы Data Explorer, как ASCII-файлов с помощьюмакро-и импортируется в анализ данных и графической программного обеспечения (например, происхождение от OriginLab) и отображается в виде водопада участков (рис. 3).

18 O-включение участков: Для каждого сегментирования продуктов расщепления пептида, относительный вклад отдельных видов изотопов пептид (16 O, 18 O 1 или 18 O 2) извлекаются во всех точках времени реакции и зависимости от времени (рис. 4).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы использовали Палео-TimeCourse рабочего процесса для динамического наблюдения за включение 18 O-стабильных изотопов в продуктах расщепления пептида порожденных протеолитических ферментов. Изложенный подход является универсальным инструментом для изучения сравнительно протеолитические пути обработки для различных подложки и протеазы комбинаций. Путем отбора проб протеолитических реакций неоднократно в течение реакции, Палео-TimeCourse эксперимент предоставляет временным разрешением снимков субстрата и продук...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Объединив стабильного изотопа и маркировки высокого разрешения масс-спектрометрии в времяразрешенных образом, Палео-TimeCourse метод позволяет динамический анализ поколение пептидов продукции. Анализ может быть использован для создания стабильной меченных изотопами пептидов для количественного и качественного протеомики исследований и оценки кинетики которые proteotypic пептиды образуются. Кроме того, Палео-TimeCourse предназначен для оценки протеолитических путей при определенных, соответствующих физиологически ест...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эта работа была поддержана NIH / NIDCR Грант 1R01DE019796.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название материала Компания Номер в каталоге
PepClean C-18 Спин Столбцы Thermo 89870
Opti-TOF 384 MALDI мишень AB SCIEX 1016629
4800 MALDI TOF / TOF AB SCIEX

Таблица 1. Материалов

Название реагента Компания Номер в каталоге
Альфа-циано-4-гидроксикоричной кислоты Sigma Aldrich 70990-1G-F
Бычий сывороточный альбумин (BSA) Sigma Aldrich A3294-10G
Dithiothreitol (DTT) Acros 16568-0050
Иодацетамида (IAM) Sigma Aldrich 1149-5G
Эндотелина-превращающего фермента-1 (ECE-1) R & D Systems 1784-ZN
Трипсин золото Promega V5280
Вода-18 O, 97% атома 18 O Sigma Aldrich 329878-1G
Трифторуксусной кислоты (ТФК) Thermo 28904
Массовый набор стандартов для калибровки AB SCIEX TOF / TOF инструменты AB SCIEX 4333604

Таблица 2. Реагенты

Ссылки

  1. Bender, M., Kemp, K. Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters. Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).
  2. Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).
  3. Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange. European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).
  4. Fenselau, C., Yao, X. 18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report. Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).
  5. Miyagi, M., Rao, K. C. S. Proteolytic 18O-labeling strategies for quantitative proteomics. Mass Spectrom. Rev. 26, 121-136 (2007).
  6. Ye, X., Luke, B., Andresson, T., Blonder, J. 18O stable isotope labeling in MS-based proteomics. Brief Funct. Genomic Proteomic. 8, 136-144 (2009).
  7. Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389, 1017-1031 (2007).
  8. Yao, X., Afonso, C., Fenselau, C. Dissection of proteolytic 18O labeling: endoprotease-catalyzed 16O-to-18O exchange of truncated peptide substrates. Journal of Proteome Research. 2, 147-152 (2003).
  9. Robinson, S., Niles, R. K., Witkowska, H. E., Rittenbach, K. J., Nichols, R. J., Sargent, J. A., Dixon, S. E., Prakobphol, A., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples. Proteomics. 8, 435-445 (2008).
  10. Cottrell, G. S., Padilla, B. E., Amadesi, S., Poole, D. P., Murphy, J. E., Hardt, M., Roosterman, D., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling. The Journal of Biological Chemistry. 284, 22411-22425 (2009).
  11. Subramanian, S., Hardt, M., Choe, Y., Niles, R. K., Johansen, E. B., Legac, J., Gut, J., Kerr, I. D., Craik, C. S., Rosenthal, P. J. Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3. PLoS ONE. 4, e5156(2009).
  12. Mason, C., Therneau, T., Eckel-Passow, J., Johnson, K., Oberg, A., Olson, J., Nair, K., Muddiman, D. C., Bergen, H. A method for automatically interpreting mass spectra of 18O-labeled isotopic clusters. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 305-318 (2007).
  13. Hicks, W. A., Halligan, B. D., Slyper, R. Y., Twigger, S. N., Greene, A. S., Olivier, M. Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application "ZoomQuant". J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).
  14. Qian, W. -J., Petritis, B. O., Nicora, C. D., Smith, R. D. Trypsin-catalyzed oxygen-18 labeling for quantitative proteomics. Methods Mol. Biol. 753, 43-54 (2011).
  15. Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling. Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).
  16. Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry. Proteomics Clin. Appl. 5, 636-643 (2011).
  17. Gattiker, A., Bienvenut, W., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. Proteomics. 2, 1435-1444 (2002).
  18. Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. Rapid 'de novo' peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer. Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).
  19. Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides. Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).
  20. Bender, M., Stone, R., Dewey, R. Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water. Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).
  21. Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. Scoring proteomes with proteotypic peptide probes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

18PALeOMALDI TOF MS

Похожие статьи