Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Биолюминесценция Визуализация активности NADPH оксидазы на различных животных моделях

16.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/3925

⸱

22 октября 2012 г.

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Departments of Medicine and Immunology, Roswell Park Cancer Institute, 3Department of Medicine, University at Buffalo School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

NADPH оксидазы является основным источником активных форм кислорода (АФК) в фагоцитов. Из-за эфемерность ROS, это трудно для измерения и мониторинга уровня АФК в живых животных. Минимально инвазивных методов для последовательного количественного АФК в живых мышей описано.

Аннотация

НАДФН-оксидаза является важнейшим ферментом, который опосредует антибактериальную и противогрибковую защиту организма. Помимо своей роли в антимикробной защите хозяина, НАДФН-оксидаза выполняет критические сигнальные функции, модулирующие воспалительный ответ 1. Таким образом, разработка метода измерения в «реальном времени» кинетики генерации АФК, производных НАДФН-оксидазы, представляет собой ценный исследовательский инструмент для понимания механизмов, имеющих значение для защиты организма, воспаления и повреждения тканей.

Хроническая гранулематозная болезнь (ХГБ) представляет собой наследственное заболевание, связанное с нарушением работы NADPH-оксидазы, которое характеризуется тяжелыми инфекциями и избыточным воспалением. Активация NADPH-оксидазы фагоцитов требует транслокации ее цитозольных субъединиц (p47phox, p67phox и p40phox) и Rac к мембраносвязанному флавоцитохрому (состоящему из гетеродимера gp91phox и p22phox). Мутации с потерей функции в любом из этих компонентов NADPH-оксидазы приводят к развитию ХГБ. Подобно пациентам с ХГБ, мыши с дефицитом gp91phox и мыши с дефицитом p47phox имеют дефектную активность NADPH-оксидазы фагоцитов и нарушенную защиту организма 2, 13. Помимо фагоцитов, содержащих вышеописанные компоненты NADPH-оксидазы, различные другие типы клеток экспрессируют разные изоформы NADPH-оксидазы.

В данной работе мы описываем метод количественного определения продукции АФК у живых мышей и определения вклада НАДФН-оксидазы в генерацию АФК в моделях воспаления и повреждения. Этот метод основан на реакции АФК с L-012 (аналогом люминола) с испусканием люминесценции, которая регистрируется с помощью прибора на основе прибора с зарядовой связью (ПЗС). В первоначальном описании зонда L-012 было показано, что зависимая от L-012 хемилюминесценция полностью подавлялась супероксиддисмутазой, что указывает на то, что основным видом АФК, обнаруживаемым в этой реакции, был супероксид-анион 14. Последующие исследования показали, что L-012 может обнаруживать и другие свободные радикалы, включая активные формы азота 15, 16. Kielland et al. 16 продемонстрировали, что местное применение форболмиристата ацетата, мощного активатора НАДФН-оксидазы, приводило к НАДФН-оксидаза-зависимой генерации АФК, которую можно было обнаружить у мышей с помощью люминесцентного зонда L-012. В этой модели они показали, что зависимая от L-012 люминесценция отсутствовала у мышей с дефицитом p47phox.

Мы сравнили генерацию АФК у мышей дикого типа и мышей с дефицитом НАДФН-оксидазы p47phox-/- 2 в следующих трех моделях: 1) интратрахеальное введение зимозана — провоспалительного продукта из клеточной стенки грибов, способного активировать НАДФН-оксидазу; 2) перевязка и пункция слепой кишки (CLP) — модель внутрибрюшного сепсиса с вторичным острым воспалением и повреждением легких; и 3) пероральное введение четыреххлористого углерода (CCl4) — модель АФК-зависимого повреждения печени. Эти модели были специально выбраны для оценки НАДФН-оксидаза-зависимой генерации АФК в контексте неинфекционного воспаления, полимикробного сепсиса и токсического повреждения органов соответственно. Сравнение биолюминесценции у мышей дикого типа и мышей p47phox-/- позволяет нам определить конкретный вклад АФК, генерируемых НАДФН-оксидазой, содержащей p47phox, в биолюминесцентный сигнал в данных моделях.

Результаты биолюминесцентной визуализации, продемонстрировавшие повышенный уровень АФК у мышей дикого типа по сравнению с мышами p47phox-/-, указали на то, что NADPH-оксидаза является основным источником генерации АФК в ответ на воспалительные стимулы. Данный метод представляет собой минимально инвазивный подход для мониторинга генерации АФК в режиме реального времени при воспалении in vivo.

Протокол

1. Животные модели

  1. Мыши: Используйте phox p47-/ - мышей и возрасту и полу C57BL6/DBA мышей. Получить разрешение на эксперименты с Институциональные уходу и использованию животных комитета.
  2. Анестезия: Используйте непрерывную изофлуран системы управления для анестезии. Система испаритель (VetEquip) заполнена изофлурана (2-3%). Убедитесь, что мышь полностью под наркозом, наблюдая дыхание, движение, и роговичного рефлекса в ответ на внешние раздражители.
  3. Хирургические методы лечения: хирургический скраб области (настольный) с 70% этанола. Носите стерильные перчатки и чистую хирургический халат и маску. Подготовка мышей, закрепляя волосы и применении бетадин чередуются с 70% этанола в район, где разрез будет сделан. Выполнить операцию на стерильной поверхности и использовать стерильные инструменты. Монитор мышей после операции, пока спит и свободно перемещаться.
  4. Интратрахеальное администрации зимозан
    1. Администрирование анестезиикак описано в разделе 1.2.
    2. Лечить хирургической области (шея) с бетадин и 70% этанола и подвергать трахеи хирургического вскрытия.
    3. Пирс трахеи с 27-иглы и ввести зимозан (St. Louis, MO) в дозе 1 мкг / г с использованием 0,5 мкг / мкл раствора (общий объем 50 мкл на 25 мышей г) растворяют в стерильном PBS.
    4. Закрыть рану шеи мышей с 5-0 стерильных нитей шелка в асептических условиях.
    5. Изображение после 4 часов и 24 часа в сутки.
  5. Слепой кишки перевязки и пункции
    1. Администрирование анестезии, как описано в 1.2.
    2. Зажим для волос в хирургической области (живот) и дезинфекции бетадин и 70% этанола.
    3. Выполните средней линии лапаротомии и выявлению слепой кишки.
    4. Лигируют дистального 50% подвергается слепой кишки с 4-0 шва шелка и прокол слепой кишки дистальнее перевязки с одним проходом 21-иглу.
    5. Закрыть разрез с 4-0 стерильных нитей шелка.
    6. Изображение после 4 ч и24 часа в сутки.
  6. Устные четыреххлористого углерода (CCl 4) Администрация
    1. Администрирование анестезии, как описано в 1.2.
    2. Администрирование CCl 4 (2 мкг / г, Сент-Луис, Миссури), растворенного в кукурузном масле через желудочный зонд. Процедура CCl4 администрация должна проводиться в специально отведенном месте в соответствии с МКБ / EHS политики.
    3. Изображение после 4 часов и 24 часа в сутки.

2. Приобретение Bioluminescent изображения

  1. Инициализация ИВИС 200 (Xenogen Corporation, Аламеда, штат Калифорния) Imaging System, установите режим свечения, и ждать, пока прибор с зарядовой связью (CCD) температуры до упора.
  2. Выберите время экспозиции, биннинга (средний) и F / Stop (8) параметры.
  3. Место мышей в положении лежа на изображение камеры на стадии подогревом для поддержания нормальной температуры тела. Администрирование анестезии, как описано в 1.2 через носовой конус в то время как мыши в камере ИВИС изображения.
  4. Администрирование L-012 (20 мкг / г) растворяют в стерильной PBS (10 мкг / мкл) вводили через ретро-орбиту в каждый момент времени выбран для работы с изображениями.
  5. Захват изображений начиная с 2 мин после L-012 инъекций. Обычно мы используем 40 секунд воздействия.

3. Анализ данных использовании области интереса

  1. Анализ данных с помощью программного обеспечения Живые изображения v.4.2 (Xenogen Corporation, Аламеда, штат Калифорния).
  2. Откройте изображение и выберите пункт измерения области интереса инструментов.
  3. Выберите регион форме процентов и размер на груди и / или живота после наложения псевдо-цветного цифрового изображения (представляющих регистрации фотонов) по сравнению с фотографическим изображением мыши.
  4. Количественно интенсивность сигнала (поток фотонов) из области интересов.

4. Статистика

  1. Использование статистических пакетов программного обеспечения для анализа выполнения двустороннего ANOVA с Bonferroni пост-тестирования в отдельных точках времени.
TLE "> 5. Результаты представитель

Зимозан является про-воспалительных клеток дрожжей продукт стены и мощным активатором NADPH оксидаза 3. Ранее мы показали, что интратрахеального зимозан индуцирует более надежные нейтрофильного воспаления легких и провоспалительных цитокинов производства в phox p47-/ - по сравнению с мышами дикого типа 1. Здесь нашей целью было сравнить АФК в легких дикого типа и p47 phox-/ - мышей после зимозан проблемой. В 4 часа после интратрахеального администрации зимозан, мы наблюдали значительное увеличение испускания фотона на груди мышей дикого типа по сравнению с исходным, а также увеличение испускания фотона в дикого типа по сравнению с p47 phox-/ - мышей через 4 часа и 24 часа в сутки. В отличие от биолюминесценции сигналов в phox p47-/ - мыши оставались на базовом уровне в 4 часа после зимозан лечения (рис. 1 AB). Таким образом, NADPH оксидазы кажется, бэлектронной основным источником генерации АФК в легких после введения зимозан.

Далее мы оценивали АФК в CLP-индуцированной сепсисом модели. Сепсис является опасным для жизни синдром, связанный с конечным повреждения органов, в том числе острого повреждения легких (ОПЛ) и острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) 4, 5. ROS-опосредованной травмы были считаться важным фактором, сепсис-индуцированной полиорганной дисфункции. Мы обнаружили, что АФК были значительно увеличены на грудь (4 часа) и на животе (24 часа) после CLP мышей дикого типа по сравнению с исходным. Тем не менее, ROS уровней в phox p47-/ - мыши были похожи на базовом уровне в обеих временных точках (рис. 2 AC). Эти результаты показывают, что АФК в CLP-индуцированной модели мыши сепсиса NADPH оксидаза-зависимыми.

Наконец, мы использовали биолюминесцентного изображений для обнаружения АФК в CCl 4-индуцированного повреждения печени режимел. CCl 4 приводит гепатоцеллюлярный некроз, и была использована для моделирования и острого повреждения печени и фиброз печени 6. В отличие от описанных выше моделях воспаления и травмы, мы обнаружили, что АФК в живот был умеренно (около 35%) увеличилась по сравнению с исходными в phox p47-/ - мышей через 4 часа после CCl 4 администрацию. Тем не менее, величина CCl 4-индуцированные АФК было значительно больше мышей дикого типа, чем в phox p47-/ - мыши (рис. 3 AB). Эти данные позволяют предположить, что оба p47 phox содержащих NADPH оксидаза-зависимые и независимые АФК протекать в острой CCl 4-индуцированного повреждения печени.

figure-protocol-1
Рисунок 1. АФК в легких после лечения зимозан. А) представитель bioluminescenCE изображений продукции АФК. Обратите внимание, что в дополнение к груди, свечение можно обнаружить на животе и в дикого типа и p47 phox-/ - мыши и брюшной свечения не меняется при лечении зимозан. B) фотоотсчетов от груди дикого типа и p47 phox-/ - мышей после однократного интратрахеального (IT) введение зимозан. Биолюминесценции изображений проводилась в начале исследования, 4 ч. и 24 мин. Световое излучение из области интересов на груди была определена с использованием указанного псевдо-цветовой гаммы. Результаты представлены как среднее ± SE, п = 6-9 в группе, * = р <0,05. Нажмите для увеличения рисунка .

figure-protocol-2
Рисунок 2. ROS после обнаружения CLP. А) представитель биолюминесценции изображений АФК, B) Фотоотсчетов от груди, и C) фотоотсчетов из живота дикого типа и p47 phox-/ - мыши в исходном состоянии, 4 ч и 24 ч после CLP. Результаты представлены как среднее ± SE; п = 4-5 в группе, * = р <0,05. Нажмите для увеличения рисунка .

figure-protocol-3
Рисунок 3. АФК в животе после CCl 4-индуцированного повреждения печени. А) представитель изображений биолюминесценции ROS производства и B) фотоотсчетов из живота дикого типа и p47 phox-/ - мыши в исходном состоянии, 4 часа и 24 часа после приема CCl 4 лечении. Результаты представлены как среднее ± SE;. П = 4-5 в группе, * = р <0,05 Нажмите здесь для увеличения рисунка .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

"Реального времени" измерения активных форм кислорода (АФК) в живых животных может быть достигнуто с помощью флуоресцентных зондов и хемилюминесцентных. В то время как флуоресцентные зонды страдают от того, слабая сигнал-шум 12, изображениями методике, описанной более чувствителен для обнаружения светового излучения после химической реакции АФК с люминол-субстрат L-012. Как и все биолюминесцентного методы визуализации, эта методика ограничена зависит от длины волны поглощения света и рассеивать по о...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эта работа финансировалась NIH RO1 AI079253 и Департамент по делам ветеранов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге Комментарии
L-012 Wako Chemicals USA, Inc 120-04891
Зимозан Sigma, Сент-Луис, Миссури Z4250
четыреххлористого углерода Sigma, Сент-Луис, Миссури 289116

Ссылки

  1. Segal, B., Han, W., Bushey, J. NADPH oxidase limits innate immune response in the lungs in mice. PLoS ONE. 5, e9631(2010).
  2. Jackson, S., Gallin, J., Holland, S. M. The p47phox mouse knock-out model of chronic granulomatous disease. J. Exp. Med. 182, 751-758 (1995).
  3. Gantner, B. N., Simmons, R. M., Underhill, D. M. Collaborative induction of inflammatory responses by dectin-1 and Toll-like receptor 2. J. Exp. Med. 197, 1107-1117 (2003).
  4. Dejager, L., Pinheiro, I., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis. Trends Microbiol. 19, 198-208 (2011).
  5. Tsiotou, A. G., Sakorafas, G. H., Bramis, J. Septic shock; current pathogenetic concepts from a clinical perspective. Med. Sci. Monit. 11, 76-85 (2005).
  6. Fujii, T., Fuchs, B. C., Tanabe, K. K. Mouse model of carbon tetrachloride induced liver fibrosis: Histopathological changes and expression of CD133 and epidermal growth factor. BMC Gastroenterology. 10, 79-90 (2010).
  7. Kubo, H., Morgensterm, D., Doerschuk, C. M. Preservation of complement-induced lung injury in mice with deficiency of NADPH oxidase. J. Clin. Invest. 97, 2680-2684 (1996).
  8. Segal, B., Sakamoto, N., Bulkley, G. B. Xanthine oxidase contributes to host defense against Burkholderia cepacia in the p47(phox-/-) mouse model of chronic granulomatous disease. Infect Immun. 68, 2374-2378 (2000).
  9. Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiological reviews. 82, 47-95 (2002).
  10. Jones, D. Radical-free biology of oxidative stress. American journal of physiology. Cell physiology. 295, C849-C868 (2008).
  11. Hubbard, W. J., Choudhry, M., Chaudry, I. H. Cecal ligation and puncture. Shock. 24, 52-57 Forthcoming.
  12. Wardman, P. Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and nitrosative species in cells and tissues: progress, pitfalls, and prospects. Free Radic. Biol. Med. 43, 995-1022 (2007).
  13. Pollock, J. D., Williams, D. A., Gifford, M. A. Mouse model of X-linked chronic granulomatous disease, an inherited defect in phagocyte superoxide production. Nat. Genet. 9, 202-209 (1995).
  14. Aramaki, Y., Y,, Yoshida, H. A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 554-559 (1993).
  15. Daiber, A., Oelze, M., August, M. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radic. Res. 38, 259-269 (2004).
  16. Kielland, A., Blom, T., Nandakumar, K. S. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

L 012P47phox
Биолюминесценция Визуализация активности NADPH оксидазы на различных животных моделях
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.