Методическая статья

Сбор и охлаждения Cryo-кристаллы мембранных белков Выращивается в липидный Мезофазы для определения структуры по кристаллографии макромолекул

27.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4001

⸱

2 сентября 2012 г.

 ,  ,  ,  , 
1Membrane Structural and Functional Biology Group, Schools of Medicine and Biochemistry & Immunology, Trinity College Dublin

В этой статье

Краткое содержание

Здесь описаны процедуры, осуществляемые в мембране Кэффри Структурно-функциональная группа биологии для уборки и крио-прохладный мембранных белков кристаллов, выращенных в липидной кубической фазы и губки для использования в составе определения макромолекулярных использованием рентгеновской кристаллографии.

Аннотация

Важный путь к пониманию того, как белки функционируют на уровне механистических должна иметь структуру белка-мишени доступны, в идеале с атомным разрешением. В настоящее время есть только один способ захвата такой информации применительно к интегральные мембранные белки (рис. 1), и они образуют комплексы, и этот метод является макромолекулярных рентгеновской кристаллографии (MX). Чтобы сделать MX кристаллов дифракция качества необходимы которая, в случае мембранные белки, не образуют легко. Метод кристаллизации мембранных белков, что связано с использованием липидных мезофаз, в частности, кубические и губки фазах 1-5, получила значительное внимание опозданием в связи с успехами она имела в G-белком рецептор поля 6-21 ( WWW . mpdb.tcd.ie ). Тем не менее, метод, далее именуемый в мезо или липидные кубический метод фазы, поставляется с собственным техническимпроблемы. Они возникают, в частности, в связи с обычно вязкий и липкий характер липидного мезофазы, в котором кристаллы, которые часто являются микро-кристаллы, расти. Управление кристаллов становится трудно в результате так и, в частности во время сбора урожая 22,23. Проблемы возникают также на этапе, который предшествует сбор, который требует, что стекло сэндвич-плиты, в которых растут кристаллы (рис. 2) 24,25 открыто разоблачать мезофазы болюса, и кристаллы в нем, для сбора урожая, крио-и возможного охлаждения X -лучей коллекции дифракционных данных.

Кубической и губки мезофазы вариантов (рис. 3), из которых кристаллы должны быть собраны имеют совершенно другой rheologies 4,26. Кубической фазы является вязким и липким похожее на толстую зубную пасту. В отличие от этого, губка фазе больше жидкости с отчетливая тенденция к потоку. Соответственно, разные подходы для открытия кристаллизации скважин containiнг выращивания кристаллов в кубической и губка фазы призвал как, впрочем, разные методы, необходимые для сбора кристаллов из двух типов мезофазы. Протоколы делать именно это были усовершенствованы и внедрены в мембране структурной и функциональной биологии (MS & FB) группы, и подробно описана в этой статье Юпитера (рис. 4). Приведены примеры ситуаций, когда кристаллы успешно собирают и крио-охлаждаются. Мы также предоставляем примеры случаев, когда возникают проблемы, которые приводят к безвозвратной потере кристаллов и описать, как эти проблемы можно избежать. В этой статье просмотра снабжен шаг за шагом инструкции для открытия стекла скважин сэндвич кристаллизации, для уборки и для крио-охлаждения кристаллы мембранных белков растет в кубической и в губки фаз.

Протокол

1. Лаборатория Настройка предварительного сбора

  1. В ходе подготовки к уборке, заполните сухой пеной Дьюара с жидким азотом и поместить его рядом с микроскопом, где сбор состоится.
  2. Погрузитесь хранения шайбу, открыть в конечном итоге, в жидком азоте внутри пены Дьюара и дайте ей полностью здорово.
  3. Закрепить микро-горе размере, который соответствует кристаллу быть собраны на магнитной палочкой (рис. 5). Важно иметь под рукой несколько запасных магнитные палочки с предустановленной микро-крепления для удовлетворения ситуациях, когда необходимо собрать несколько кристаллов из одного болюса. Запасные палочки должны быть доступны в любое время.
  4. Поместите микропипетки, советы и осадителя решение, которое было использовано для роста кристаллов рядом с уборки микроскопом. Это может быть необходимо для покрытия мезофазы и для предотвращения высыхания, когда и открыто.
  5. У блокнот и ручку на скамейку рядом, и / иликомпьютер открывать. Они будут использоваться для записи замечаний, касающихся качества, внешний вид, расположение, хранение шайбу номера и т.д., кристаллы, как они собираются, крио-охлаждают и помещают в хранилище.
  6. Если помощник доступны, чтобы помочь с уборкой, что человек должен четко понимать протокол, который будет следовать, порядок, в котором различные шаги будут иметь место, и их роль в общем процессе.

Со всеми материалами и оборудованием на место нашей следующей задачей является:

2. Определить Плиты и скважин, которые содержат кристаллы

  1. Самый простой и прямой метод нахождения заготовки кристаллов заключается в проверке скважин вручную, используя микроскоп с нормальным и со скрещенными поляризованного света. Регулировка освещенности свет на микроскопом может помочь в поиске кристаллов.
  2. Кроме того, тепловизор, где плиты проверяются автоматически с нормальной и пересек поляризуютг свет, может быть использована для поиска кристаллов.
  3. Оценить на глаз записаны цифровые изображения на мониторе компьютера.
  4. Очевидно отметить те скважин с кристаллами для сбора и записи комментариев от размера, качества и расположения кристаллов в мезофазы в ноутбуке или компьютере.
  5. Снимите пластину, содержащую кристаллы для уборки от тепловизора.

3. Открытие и с кубической мезофазы. Способ 1

Пластинами, в которых растут кристаллы в в методе мезо являются стеклянные трехслойных пластин (рис. 2). Для того, чтобы получить доступ к мезофазы и кристаллы в них, необходимо, чтобы открыть хорошо. Это делается с помощью инструмента резки стекла, чтобы сократить верхний покровного стекла, что тюлени и которые затем могут быть удалены.

Есть несколько подходов для резки и снятия покровного стекла из более чем кристаллизации хорошо. Из них использовать продиктовано Type OF мезофазы, в котором находится кристалл растет. Это может быть очень вязким и липким кубической фазы (рис. 3А) или его более гибким вариантом, фаза губки (рис. 3В). В этом видео статье мы покажем, как открыть колодцы и собирать кристаллы из обоих этих материалов хостинга.

  1. Поместите кристаллизации стекла плита на сцене световой микроскоп.
  2. Используя инструмент резки стекла счетом покровного стекла слегка с двумя концентрическими кругами расположены выше распорки и только за пределами периметра хорошо. С нового режущего инструмента, забив требует минимальных приложенного давления. Заменить инструмент новый, когда давление, необходимое для оценки возрастает еще незначительно, обычно это происходит после открытия 10 скважин.
  3. Разбейте стекло в пространстве между двумя кругами забил с целью освобождения внутреннего покровного стекла. Это порождает множество осколков стекла и пыли. Очистите их прочь с смоченнуюбумажным полотенцем.
  4. Снимите освободил покровного стекла, удерживая его с тонкой наконечником пинцеты и наклоняя ее от и выключение хорошо. В этом случае кубической фазы остается застрял, и на место на плите скважины.
  5. Увеличьте масштаб, чтобы получить более четкое представление кубических мезофазы которая сейчас готова для использования в кристалле уборки урожая.

4. Открытие Ну с кубическими мезофазы. Способ 2

  1. Использование стекла режущего инструмента оценки прямые параллельные линии в покровного стекла с одной стороны хорошо, что проходят по хорошо себя. Это позволяет легче пинцетом доступа и удаления покровного стекла.

В данной демонстрации, покровного стекла трещины в освобождении от покровного стекла липкой поверхности прокладки. В процессе покровного стекла сдвиги в положении и осадителя отделяется от кубической фазы. Когда покровного стекла поднимают некоторые из осадителя идет с ним. Нам остается открытой бОлус мезофазных без каких-либо окружающих осадителя. Сразу же добавить 1 мкл свежей осадителя в верхней части болюса помощью микропипетки, чтобы предотвратить мезофазы от высыхания и переживает этап изменений, которые могут повредить кристаллы. Болюс готов для использования в кристалле уборки урожая.

5. Открытие Ну с фазы губки. Безуспешно

Губка фазы меньше прощать работать, потому что его способности потока. Если этого потока приводит к губке фазы контакта по периметру и капиллярность обнажу мезофазы и кристаллы будут потеряны. Примером этого случая показано на этом видео.

  1. Увеличить на губку фазы и переключаться между обычным и скрещенные поляризованный свет, чтобы найти кристаллы в губку фазу.
  2. В рамках подготовки к открытию и оценки и сократить покровного стекла, как описано в разделе 3. В процессе покровного стекла трещины. В попыткеING, чтобы открыть и осадителя сдвиги в направлении трещины и в конце концов он вступает в контакт с прокладкой. С осадителя идет некоторые из фазы губки и его груз кристаллов, которые были утеряны.

В этой конкретной последовательности, поляризаторы на микроскоп не полностью пересек и кристаллы можно рассматривать как яркие объекты, в то же время, что хорошо и ее содержимое остаются видимыми.

6. Открытие Ну с фазы губки. Успешно

  1. Увеличить на губку фазы и выявления кристаллов, как в нормальных и скрещенных поляризованного света.
  2. Оценка, вырезать и удалить раздел покровного стекла охватывающий также, как и в разделе 4.1. Не полностью пересек поляризованного света используется для отслеживания кристалла.
  3. Представьте кусок сухой салфеткой через отверстие в покровного стекла, а в колодец, пока она не коснется осадителя решение. Вика от решения осторожныют, пока он почти все ушли, а затем удалить ткань. Это приводит к тому, оставшихся осадителя и губки фазы, с кристально-прежнему на месте, чтобы убрать под покровного стекла.
  4. Оценка, вырезать и удалить с помощью пинцета остальной части покровного стекла, как и в разделе 4.1. В этом случае, губки фаза распадается, а некоторые остаются в скважине и палочки для покровного стекла. Кристалла в болюсной на покровного стекла. Потому что есть очень мало осадителя настоящее время фаза губка начинает испытывать фазовый переход вероятно, из-за высыхания. Это можно рассматривать как кольцо двулучепреломления, который мигрирует к центру болюса. Сразу добавить осадителя в болюс, чтобы остановить переход. Болюс готов для использования в кристалле уборки урожая.

7. Сбор и охлаждения Cryo-кристаллов из кубической фазы

  1. Вернитесь назад и вперед между нормальным и скрещенные поляризованный свет, чтобы найти кристаллы в кубических болюса фазы в открытую хорошо. В тего видеоряд до четырех двулучепреломляющей кристаллы можно увидеть в кубической фазе болюса со скрещенными поляризованного света.
  2. Используйте установлен крио-цикла (рис. 5), чтобы исследовать свежеобнаженного мезофазы для кристаллов, выловить кристаллов, а затем погрузить их, содержащейся в крио-цикл, в жидкий азот в сосуд Дьюара сразу же после уборки урожая. В идеале, заготовки и оснастки охлаждение должно произойти в одном непрерывном и быстром движении. Как мало придерживаясь мезофазы по возможности должна быть собрана с кристаллом. По нашему опыту, крио-защитным не требуется с в мезо-выращенных кристаллов.
  3. Так как это не возможно, чтобы смотреть на кристалл в крио-цикл сразу же после сбора урожая проверку мезофазы болюса использоваться для уборки чтобы убедиться, что кристалл больше не существует, предполагая, что он был собран успешно.

8. Сбор и охлаждения Cryo-кристаллы из губки фазы

  1. Вернитесь назад и вперед между нормальным и скрещенные поляризованный свет, чтобы найти кристаллы в болюсной губки фазы в открытую хорошо. В этом видео последовательности многих двулучепреломляющей кристаллы можно увидеть в болюса при скрещенных поляризованного света.
  2. Используйте установлен крио-цикла (рис. 5), чтобы выловить кристаллов из губки фазы и окунуться них, которые содержатся или cryoloop, в жидкий азот в сосуд Дьюара сразу же после уборки урожая. Как и уборки из кубической фазы, в идеале, крио-процесс охлаждения должно произойти сразу же кристалл собирают с как можно меньше времени возможно, прошедшее между фактическим событием уборки и погружая в жидкий азот. Как мало придерживаясь фаза губки по возможности должна быть собрана с кристаллом. Как уже отмечалось, крио-защитным не требуется с в мезо-выращенных кристаллов.

9. Хранение Кристаллы в Dewars

  1. Погрузившись установлены петли в жидком Н.И.Trogen поместить его в одну из проведения слотов для хранения шайбу в пену Дьюара. Все манипуляции производятся с петлей, в верхней части магнитной палочкой и шайбу погруженной в жидкий азот.
  2. Запишите расположение и детали собирают и крио-охлаждением кристалла в ноутбук и / или на компьютере.
  3. Если шайба в пену Дьюара является полным или уборки в течение дня завершения передачи шайбу в отложены держатель шайбу в хранении или транспорте Дьюара с жидким азотом. Кристаллы могут быть отправлены в транспорте Dewars на объект синхротрон для сбора дифракционных данных.

10. Представитель Результаты

Цели сбора и крио-охлаждение упражнений показал здесь, чтобы передать кристалла от хостинга мезофазы в крио-петли, чтобы остекловывать петлю кристалла и поместить его на хранение в жидкий азот в сосуд Дьюара. Идеальной является ситуация, где сбор урожая и сРе-охлаждение сделано таким образом, что дифракционные качество кристалла сохраняется в процессе. Как мало мезофазы по возможности должна быть собрана с кристаллом. Это необходимо для того размещении кристалла и центрирования его в рентгеновский луч, который гораздо менее сложной, чтобы ускорить крио-охлаждение с целью стеклования, и свести к минимуму вмешательство фоне разброс от мезофазы во время сбора дифракционных данных. Некоторые примеры крио-охлажденных образцах, где кристалл может и не может рассматриваться показано на рисунке 6. В случае, если кристалл не видно на глаз, как правило, приходится прибегать к дифракции растеризации, чтобы найти кристалл и в центре его в луч для сбора данных 27.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Схематическое изображение биологических мембран показывает липидного бислоя и на котором арэлектронной расположены различные белки.

figure-protocol-2
Рисунок 2. Полностью загружены и опечатаны 96-а стекло сэндвич кристаллизации пластин. Каждая лунка содержит 50 нл кубической фазы и 1 мкл осадка раствор. Для ясности, кубическая фаза была окрашенных Суданом Красное и осадителя решение включает в себя метиленовый синий. Из Ссылка 5.

figure-protocol-3
Рисунок 3. Кристаллы мембранных белков, растущих в липидных мезофазы.. Кубической фазы с кристаллической бактериородопсина из H. halobium. B. губки фазу, содержащую кристаллы витамина В12 рецептор / транспортер, BtuB, от E. палочки. Из Reference 25. Кубической и губки фаз контрастной appearances как видно, сравнивая панели А и В. кубической фазы в очень вязкой и сохраняет свою первоначальную форму. Это не течь. Это особенно заметно на краях мезофазы болюса, которые имеют шероховатую внешний вид. По контракту, губки фазы значительно меньше, вязкой и течет. Таким образом, фаза губки не в состоянии сохранить свою первоначальную форму и ее края характерна гладкая. Осадителей, которые включают Jeffamine, ПЭГ 400, 2-метил-2 ,4-pentandiol, пентаэритрита пропоксилат, бутандиол и гександиол, может привести к переходу из кубической фазы губки 4,26.

figure-protocol-4
Рисунок 4. Схеме приведены этапы производства, сбора и крио-охлаждение в мезо-выращенных кристаллов мембранного белка (А). Только те шаги, окруженные красной пунктирнойлинии, и подробно описан в (B), которые описаны в этой статье Юпитера. Панель от Reference 3. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

figure-protocol-5
Рисунок 5. Пустые крио-цикл установлен на булавку, которая удерживается на месте на магнитной палочкой. Расширенное видом на штифт (A) и микро-крепление (B) этого важного инструмента для уборки и крио-охлаждение показано на рисунке. Пустой цикл в конце микро-горе в B составляет 30 мкм в диаметре. Хотя с не проверял другие типы цикла широко, мы находим, что MiTeGen петли показаны хорошо работают как с кубической и губки фаз.

figure-protocol-6
Рисунок 6. Заготовленные и крио-охлажденных кристаллах мембранных белков в крио-цикл, если смотреть с в линию микроскоп на синхротроне beamline. A, B. Примеры собранных кристаллов (Caa3 цитохромоксидазы 34 (А), диацилглицерол киназы, DgkA (B)), где кристаллы (синяя стрелка) видны через крио-охлажденного мезофазы на крио-цикла. C. Пример, где кристалл заготовленной не видна в крио-охлажденного мезофазы на крио-цикла. Кончик цикла отождествляется с красной стрелкой. Соблюдение крио-охлажденного мезофазы отождествляется с синими стрелками.

Обсуждение

В этом видео статье мы показали, как кристаллы, выращенные в липидных мезофазы собирают и крио-охлаждали в подготовке для использования в коллекцию дифракционных данных и в конечном итоге для определения структуры. Мезофазы хостинг может быть вязким и липким кубической фазы или больше жидкости губкой фазы 4. Как стеклянных пластин сэндвич открыты и, как кристаллы собирают очень многое зависит от мезофазы типа. Поэтому важно знать, какую из двух речь идет о заранее. Личность хостинг липидов и осадителя использовали важны в этом отношении, и внешность мезофазы болюса при кристаллизации также может быть использован, чтобы сказать им друг от друга (рис. 3). Сбор от обоих типов мезофазы было показано в этой статье.

Уборочная мелких кристаллов из липидных мезофазы в стеклянных пластин бутерброд кропотливый процесс, который требует времени, умения, экспериментовience, терпение и твердая рука. Важно, чтобы выделить достаточное количество времени для сбора урожая и создать лабораторию, чтобы все материалы и оборудование под рукой заранее. Второй человек, чтобы помочь с уборкой урожая не является необходимым, но рекомендуется. Этот человек может помочь с предоставлением заранее отмеченные пластины на отдельные делают заготовки, а также размещения крио-охлаждением установлены петли с кристаллами собраны в хранилище шайбу. Помощник может также играть важную роль в поддержке документирования наблюдений на кристаллы сделанные во время сбора урожая, которые могут сыграть решающую роль в процессе сбора дифракционных данных. При отсутствии помощников, голосовые аудио-и записывающее устройство может быть использовано для преимуществ для документации.

В соответствии с протоколом, описанным в этой статье, поможет получить средства просмотра и работает с кристаллом уборки урожая. Тем не менее, важно понимать, что этот процесс не простой и, что праctice необходимо перед запуском в уборке ценные кристаллы белков мембраны. Поэтому рекомендуется, что тест пластины с кристаллами белки, которые не являются особенно ценными быть экспериментировал с первым. Это обеспечит неофита с ценный опыт в резке стекла, удаляя осколки стекла, поднимая покровного стекла из более чем мезофазы, с помощью поляризационных функций на микроскоп, чтобы увидеть кристаллы и отслеживать их во время сбора урожая, и, наконец, обработку различных типов мезофаз и сбор урожая от них. Текстура мезофазы, и расширением легкость, с которой кристаллы могут быть собраны, меняется со временем в процессе кристаллизации. Поэтому важно, чтобы практиковать уборки с менее ценных кристаллов, но с теми, которые росли в тех же условиях, как и более ценными. Это позволит выращивать кристаллы лизоцима и тауматин в в мезо или липидные кубический метод фазового 28 и это следует рассматЭред путем получения знакомство с материалами и метод. Следует также рассмотреть вопрос о сотрудничестве с белком без мезофазы первыми узнавать своих капризов.

Процедуры продемонстрировали здесь было все сделано на комфортном 20 ° C или около того. Это можно выращивать кристаллы в методе мезо при низких температурах. Таким образом, моноолеина как хостинг липидов в метастабильное фазовое состояние может быть использована при 4 ° С 1,2,29,30. Альтернативой является использование рационально разработан 7,9 MAG для низкой температуры кристаллизации 31. Мы делаем низких температур crysallogenesis регулярно с определенными целями мембранного белка. В этом случае, рост кристаллов и сбор урожая производится в душевой 4 ° C холодильнике. Работая в таких условиях имеет свои собственные проблемы, не последним из которых является потребность в теплой и удобной одежде.

Следующим шагом в общем процессе определения структуры использования макромолекулярных кристалловtallography является сбор данных дифракции на кристаллах собраны и оснастка охлаждается, как показано в этой статье. в мезо-выращенных кристаллов, как правило, небольшие. Тем не менее, полезно дифракции сбора данных стало возможным с кристаллов с максимальным размером 20 мкм 9. Для этого, микро-лучевой синхротронного рентгеновского излучения используется и находится в центре внимания отдельной статьи Юпитер в этой серии 32,33.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Есть многие, кто вклад в эту работу, и большинство из мембраны Кэффри Структурно-функциональная группа биологии, как прошлых, так и нынешних членов. Для всех, и особенно для Jingquan Тан и Джозеф Лайонс, мы выражаем нашу искреннюю благодарность и признательность. Эта работа была частично поддержана грантами Научный фонд Ирландии (07/IN.1/B1836), Национального института здоровья (GM75915, P50GM073210 и U54GM094599), и FP7 COST и Мари Кюри (CM0902 и ПМЭФ-GA-2009 -235612).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге Компоненты
Изогнутый пинцет Сигма F4142 Инструмент
Одноразовые наконечники Gilson Различный Одноразовый
Пена Дьюара Spearlab FD-500 Инструмент
Контейнеры Стеклянные и металлические отходы Daniels Здоровье DD479OL Инструмент
Уборочная петли MiTeGen Различный Инструмент
Уборочная микроскопом Nikon SMZ1500 Инструмент
Лаборатория ноутбуков Различный Не Доступно Инструмент
Магнитные толчокКнопка загрузки образца палочки Hampton Research / Молекулярная Размеры HR4-729/MD7-411 Инструмент
Оригинальный Puck (для использования с ALS-стиле роботов только) Системы позиционирования кристалла CP-111-035 Инструмент
Пипетки Gilson Различный Инструмент
Осадителя решения Различный Различный Реагент
Puck Бент Cryo-Тонг Системы позиционирования кристалла CP-111-030 Инструмент
Puck отложен Cane доставка (оригинал ALS-стиль) с крючковатым ручку и замок стержня Системы позиционирования кристалла CP-111-029 Инструмент
Дистиллированная вода Millipore Реагент
Защитные очки Различные Не Доступно Инструмент
Примеры Основы Pin - магнитный (без меди) Системы позиционирования кристалла CP-111-015 Инструмент
Доставка Дьюара Taylor-Wharton CX100 Инструмент
Ткани Не Доступно Не Доступно Одноразовый
Карбида вольфрама стеклорез (TCT Scriber) Silverline Инструменты (Yeovil, Великобритания) 633657 Инструмент

Ссылки

  1. Caffrey, M. Crystallizing membrane proteins for structure determination: use of lipidic mesophases. Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).
  2. Caffrey, M., Li, D., Dukkipati, A. Membrane protein structure determination using crystallography and lipidic mesophases - recent advances and successes. Biochemistry. , Forthcoming (2012).
  3. Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat. Protocols. 4, 706-731 (2009).
  4. Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases. J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).
  5. Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases. Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).
  6. Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Setvens, R. C. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
  7. Chien, E. Y., Liu, W., Zhao, Q., Katritch, V., Han, G. W., Hanson, M. A., Shi, L., Newman, A. H., Javitch, J. A., Cherezov, V., Stevens, R. C. Structure of the human dopamine D3 receptor in complex with a D2/D3 selective antagonist. Science. 330, 1091-1095 (2010).
  8. Granier, S., Manglik, A., Kruse, A. C., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Weis, W. I., Kobilka, B. K. Structure of the delta-opioid receptor bound to naltrindole. Nature. 485, 400-404 (2012).
  9. Haga, K., Kruse, A. C., Asada, H., Yurugi-Kobayashi, T., Shiroishi, M., Zhang, C., Weis, W. I., Okada, T., Kobilka, B. K., Haga, T., Kobayashi, T. Structure of the human M2 muscarinic acetylcholine receptor bound to an antagonist. Nature. 482, 547-551 (2012).
  10. Hanson, M. A., Roth, B., Jo, E., Griffith, M. T., Scott, F. L., Reinhart, G., Desale, H., Clemons, B., Cahalan, S. M., Schuerer, S. C. Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptor. Science. 335, 851-855 (2012).
  11. Jaakola, V. P., Griffith, M. T., Hanson, M. A., Cherezov, V., Chien, E. Y., Lane, J. R., Ijzerman, A. P., Stevens, R. C. The 2.6 angstrom crystal structure of a human A2A adenosine receptor bound to an antagonist. Science. 322, 1211-1217 (2008).
  12. Kruse, A. C., Hu, J., Pan, A. C., Arlow, D. H., Rosenbaum, D. M., Rosemond, E., Green, H. F., Liu, T., Chae, P. S., Dror, R. O. Structure and dynamics of the M3 muscarinic acetylcholine receptor. Nature. 482, 552-556 (2012).
  13. Manglik, A., Kruse, A. C., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Mathiesen, J. M., Sunahara, R. K., Pardo, L., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Granier, S. Crystal structure of the micro-opioid receptor bound to a morphinan antagonist. Nature. 485, 321-326 (2012).
  14. Rasmussen, S. G., Choi, H. J., Fung, J. J., Pardon, E., Casarosa, P., Chae, P. S., Devree, B. T., Rosenbaum, D. M., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Schnapp, A., Konetzki, I., Sunahara, R. K., Gellman, S. H., Pautsch, A., Steyaert, J., Weis, W. I., Kobilka, B. K. Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor. Nature. 469, 175-180 (2011).
  15. Rasmussen, S. G. F., Devree, B. T., Zou, Y., Kruse, A. C., Chung, K. Y., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Chae, P. S., Pardon, E., Calinski, D. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
  16. Rosenbaum, D. M., Cherezov, V., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Yao, X. J., Weis, W. I., Stevens, R. C. GPCR engineering yields high-resolution structural insights into beta2-adrenergic receptor function. Science. 318, 1266-1273 (2007).
  17. Rosenbaum, D. M., Zhang, C., Lyons, J. A., Holl, R., Aragao, D., Arlow, D. H., Rasmussen, S. G., Choi, H. J., Devree, B. T. Structure and function of an irreversible agonist-beta(2) adrenoceptor complex. Nature. 469, 236-240 (2011).
  18. Shimamura, T., Shiroishi, M., Weyand, S., Tsujimoto, H., Winter, G., Katritch, V., Abagyan, R., Cherezov, V., Liu, W., Han, G. W., Kobayashi, T., Setvens, R. C., Iwata, S. Structure of the human histamine H1 receptor complex with doxepin. Nature. 475, 65-70 (2011).
  19. Thompson, A. A., Liu, W., Chun, E., Katritch, V., We, H., Vardy, E., Huang, X. P., Trapella, C., Guerrini, R., Calo, G., Roth, B. L., Cherezov, V., Stevens, R. C. Structure of the nociceptin/orphanin FQ receptor in complex with a peptide mimetic. Nature. 485, 395-399 (2012).
  20. Wu, B., Chien, E. Y., Mol, C. D., Fenalti, G., Liu, W., Katritch, V., Abagyan, R., Brooun, A., Wells, P., Bi, F. C., Hamel, D. J., Kuhn, P., Handel, T. M., Cherezov, V., Stevens, R. C. Structures of the CXCR4 Chemokine GPCR with Small-Molecule and Cyclic Peptide Antagonists. Science. 330, 1066-1071 (2010).
  21. Wu, H., Wacker, D., Mileni, M., Katritch, V., Han, G. W., Vardy, E., Liu, W., Thompson, A. A., Huang, X. P., Carroll, F. I. Structure of the human kappa-opioid receptor in complex with JDTic. Nature. 485, 327-332 (2012).
  22. Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets. Methods Mol. Biol. 654, 141-168 (2010).
  23. Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. J. Vis. Exp. , (2011).
  24. Cherezov, V., Caffrey, M. Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins. J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).
  25. Cherezov, V., Caffrey, M. Picolitre-scale crystallization of membrane proteins. J. Appl. Cryst. 39, 604-606 (2006).
  26. Wöhri, A. B., Johansson, L. C., Wadsten-Hindrichsen, P., Wahlgren, W. Y., Fischer, G., Horsefield, R., Katona, G., Nyblom, M., Oberg, F. A Lipidic-Sponge Phase Screen for Membrane Protein Crystallization. Structure. 16, 1003-1009 (2008).
  27. Cherezov, V. Rastering strategy for screening and centring of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 microm size X-ray synchrotron. 6, 587-597 (2009).
  28. Caffrey, M. A lipid's eye view of membrane protein crystallization in mesophases. Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 486-497 (2000).
  29. Briggs, J., Chung, H., Caffrey, M. The temperature-composition phase diagram and mesophase structure characterization of the monoolein/water system. J. Phys. Ii. 6, 723-751 (1996).
  30. Qiu, H., Caffrey, M. The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects. Biomaterials. 21, 223-234 (2000).
  31. Misquitta, Y., Cherezov, V., Havas, F., Patterson, S., Mohan, J. M., Wells, A. J., Hart, D. J., Caffrey, M. Rational design of lipid for membrane protein crystallization. J. Struct. Biol. 148, 169-175 (2004).
  32. Caffrey, M., Porter, C. Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases. J. Vis. Exp. , e1712(2010).
  33. Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophase. J. Vis. Exp. , e4000(2012).
  34. Lyons, J. A., Aragao, D., Slattery, O., Pisliakov, A. V., Soulimane, T., Caffrey, M. Structure insights into electron transfer in caa(3)-type cytochrome oxidase. Nature. 10, (2012).

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Кристаллизация мембранных белковметод липидной мезофазысбор кристалловпроцедура криоохлаждениястеклянные сэндвич-пластиныработа с кубической фазойработа с губчатой фазойприготовление осадительного растворатехника использования криопетлихранение в жидком азоте
Сбор и охлаждения Cryo-кристаллы мембранных белков Выращивается в липидный Мезофазы для определения структуры по кристаллографии макромолекул
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.