Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Иммуногистохимического окрашивания B7-H1 (PD-L1) на Парафиновые Слайды из ткани поджелудочной железы аденокарцинома

22.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4059

⸱

3 января 2013 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Oncology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Dermatology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 5The Sol Goldman Pancreatic Cancer Center, The Johns Hopkins University School of Medicine, 6Yale Cancer Center, Yale School of Medicine, 7The Skip Viragh Center for Pancreatic Cancer, The Johns Hopkins University School of Medicine, 8Department of Pathology, The Johns Hopkins University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

B7-H1 (PD-L1) и его привязка к PD-1 обеспечивает основной опухоли индуцированные иммуносупрессивной сигнала в микроокружение опухоли. Иммуногистохимического техники окрашивания, чтобы охарактеризовать выражением и локализации B7-H1 поджелудочной железы аденокарцинома описано здесь.

Аннотация

B7-H1/PD-L1, член B7 семьи иммунной нормативно поверхности клеток белков, играет важную роль в негативной регуляции клеточного иммунного ответа через его взаимодействие с рецептором, запрограммированной смерти-1 (PD 1) 1,2. Избыточная B7-H1 опухолевыми клетками было отмечено в ряде опухолей человека, в том числе меланомы, глиобластомы и рака легкого, молочной железы, толстой кишки, яичников, почек и клетки, и было показано, нарушить противоопухолевых Т- клеточного иммунитета 3-8.

Недавно B7-H1 выражение ткани поджелудочной железы аденокарцинома была определена в качестве потенциального прогностическим маркером 9,10. Кроме того, блокада B7-H1 в мышиной модели рака поджелудочной железы был показан по производству противоопухолевого ответа 11. Эти данные свидетельствуют о важности B7-H1 в качестве потенциальной терапевтической мишени. Anti-B7-H1 антитела блокады, следовательно, проходят клинические испытания для мноКратные человека солидных опухолей, включая меланомы и рака легких, толстой кишки, почек, желудка и поджелудочной железы 12.

Для того, чтобы в конечном итоге быть в состоянии идентифицировать пациентов, которые выиграют от B7-H1 таргетинга терапии, важно исследовать связь между выражением и локализации B7-H1 и реакции пациента на лечение B7-H1 антитела блокады. Изучение экспрессии B7-H1 в человеческой аденокарциномы поджелудочной ткани через иммуногистохимии даст лучшее понимание того, как это сотрудничество ингибирующее сигнальная молекула участвует в подавлении противоопухолевого иммунитета в микроокружение опухоли. Анти-B7-H1 моноклональных антител (клон 5Н1) разработал Чэнь и его коллеги была показана для получения надежных результатов окрашивания в cryosections несколько типов человеческих опухолевых тканях 4,8, но окрашивание на парафин слайды были проблемы, пока Недавно 13-18. У нас есть разработчикасбежала B7-H1 окрашивания протокол парафин слайды ткани поджелудочной железы аденокарцинома. B7-H1 окрашивания протокол, описанный здесь, производит последовательную мембранных и цитоплазматических окрашивания B7-H1 с небольшим фоном.

Протокол

B7-H1/PD-L1, член B7 семьи иммунной нормативно поверхности клеток белков, играет важную роль в негативной регуляции клеточного иммунного ответа через его взаимодействие с рецептором, запрограммированной смерти-1 (PD 1) 1,2. Избыточная B7-H1 опухолевыми клетками было отмечено в ряде опухолей человека, в том числе меланомы, глиобластомы и рака легкого, молочной железы, толстой кишки, яичников, почек и клетки, и было показано, нарушить противоопухолевых Т- клеточного иммунитета 3-8.

Недавно B7-H1 выражение ткани поджелудочной железы аденокарцинома была определена в качестве потенциального прогностическим маркером 9,10. Кроме того, блокада B7-H1 в мышиной модели рака поджелудочной железы был показан по производству противоопухолевого ответа 11. Эти данные свидетельствуют о важности B7-H1 в качестве потенциальной терапевтической мишени. Anti-B7-H1 антитела блокады, следовательно, проходят клинические испытания для нескольких человексолидных опухолей, включая меланомы и рака легких, толстой кишки, почек, желудка и поджелудочной железы 12.

Для того, чтобы в конечном итоге быть в состоянии идентифицировать пациентов, которые выиграют от B7-H1 таргетинга терапии, важно исследовать связь между выражением и локализации B7-H1 и реакции пациента на лечение B7-H1 антитела блокады. Изучение экспрессии B7-H1 в человеческой аденокарциномы поджелудочной ткани через иммуногистохимии даст лучшее понимание того, как это сотрудничество ингибирующее сигнальная молекула участвует в подавлении противоопухолевого иммунитета в микроокружение опухоли. Анти-B7-H1 моноклональных антител (клон 5Н1) разработал Чэнь и его коллеги была показана для получения надежных результатов окрашивания в cryosections несколько типов человеческих опухолевых тканях 4,8, но окрашивание на парафин слайды были проблемы, пока Недавно 13-18. Мы разработали B7-H1 stainiнг протокол парафин слайды ткани поджелудочной железы аденокарцинома. B7-H1 окрашивания протокол, описанный здесь, производит последовательную мембранных и цитоплазматических окрашивания B7-H1 с небольшим фоном.

1. Де-parafinization

  1. Выпекать скользит при 55 ° С в течение 20 мин.
  2. В химической капот, погружают слайды в ксилоле в течение 10 мин.
  3. Погрузитесь слайды в свежем ксилола в течение 10 мин.
  4. Погрузитесь скользит в 100% этаноле в течение 5 мин.
  5. Погрузитесь скользит в свежем 100% этанола в течение 5 мин.
  6. Погрузитесь скользит в 95% этаноле в течение 5 мин.
  7. Погрузитесь скользит в 80% этаноле в течение 5 мин.
  8. Погрузитесь скользит в деионизированной воде в течение 5 мин.

2. Антиген поиска

  1. Погрузитесь слайды в Трис-ЭДТА буфере (рН 9,0) и тепловой энергии в скороварке до 125 ° C в течение 30 секунд, затем 90 ° С в течение 10 сек.
  2. Пусть слайды остыть в течение 60 мин.
  3. Погрузитесь слайды в TBST в течение 5 мин; рэпев два раза.

3. Окрашивание

  1. Протрите решений по всему ткани на слайдах. Отметить круг вокруг ткани с гидрофобным перо.
  2. Поместите слайды в камере влажности и избежать высыхания тканей на слайде на протяжении всего процесса окрашивания. Место одной капле (около 200 мкл или больше, чтобы покрыть тканью области полностью) пероксидазы блока в гидрофобной круг на слайде и инкубировать слайды в блоке пероксидазы в течение 5 мин.
  3. Промыть слайдов с TBST, то место в TBST в течение 5 мин.
  4. Место одна капля BLOCK ACE блокирующего буфера на каждом слайде и инкубировать в течение 15 мин.
  5. Промыть слайдов с TBST, то место в TBST в течение 5 мин.
  6. Место одна капля Авидин решение на каждом слайде и инкубировать в течение 15 мин.
  7. Промыть слайдов с TBST, то место в TBST в течение 5 мин.
  8. Место одна капля Биотин решение на каждом слайде и инкубировать в течение 15 мин.
  9. Промыть SLIде с TBST, то место в TBST в течение 5 мин.
  10. Инкубируйте слайды с 1:1000 разведения мышей анти-B7-H1 моноклональных антител (клон 5Н1) или мышь IgG1 κ контроля изотипа в 200 мкл TBST при 4 ° С в течение ночи на 22 часов + / - 1 час. Конечная концентрация антител в TBST составляет 2,57 мкг / мл.
  11. Промыть слайдов с TBST, то место в TBST в течение 5 мин. Повторите два раза.
  12. Инкубируйте слайды с биотином сопряженных антимышиным IgG1 вторичные антитела в концентрации 1:500 (в 200 мкл 2% козьей сыворотки, раствора) в течение 30 мин.
  13. Промыть слайдов с TBST, то место в TBST в течение 5 мин. Повторите два раза.
  14. Место одна капля стрептавидин-биотин комплекса (должна быть подготовлена ​​в течение 30 мин до использования) на каждом слайде и инкубировать в течение 15 мин.
  15. Промыть слайдов с TBST, то место в TBST в течение 5 мин. Повторите два раза.
  16. Место одну каплю реагента усиления (разбавленный 2:1 с TBST) на каждом слайде и инкубировать в течение 4 мин.
  17. Промыть слайдов с TBST, то место в TBST в течение 5 мин. Повторите два раза.
  18. Место одна капля стрептавидин-HRP на каждом слайде и инкубировать в течение 15 мин.
  19. Промыть слайдов с TBST, то место в TBST в течение 5 мин. Повторите два раза.
  20. Поместите одну каплю 3,3-диаминобензидина (DAB) субстрат и хромоген на каждом слайде и развитие цвета в течение 2 мин.
  21. Сразу же после окрашивания, мыть стекла с DDH 2 O в течение 1-2 мин.
  22. Инкубируйте слайды с одной каплей гематоксилином в течение 90 сек.
  23. Промыть DDH 2 O в течение 1-2 мин.
  24. Промыть мыльной водой из-под крана в течение 1-2 мин.
  25. Промыть DDH 2 O в течение 1-2 мин.

4. Обезвоживание и монтаж

  1. Погрузитесь слайды в 80% этаноле в течение 3 мин.
  2. Погрузитесь слайды в 95% этаноле в течение 3 мин.
  3. Погрузитесь слайды в 100% этанола в течение 5 мин. Повторить.
  4. Погрузитесь слайды в ксилоле в течение 5 мин. Повторить.
  5. Добавьте одну каплюCytoseal 60 до слайды и место покровное.

В таблице 1 перечислены реагенты, используемые в описанных выше процедур.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Успешное иммуногистохимического окрашивания B7-H1 будет демонстрировать гетерогенных выражение B7-H1 (коричневый цвет сигналы DAB развития) в поджелудочной аденокарциномы. Некоторые клетки поджелудочной железы аденокарциномы имеют преимущественно мембранных выражение B7-H1 (рис. 1А), тогда как другие имеют либо преимущественно цитоплазматическая экспрессия B7-H1 или мало выражение B7-H1 (рис. 2 и 3). Нормальный поджелудочной железы эпителия выражает мало B7-H1 (рис. 4)....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Иммуногистохимического окрашивания B7-H1 на cryosections сообщалось в предыдущих исследованиях для различных видов рака 3,4. Однако, клинические образцы опухоли обычно доступны только в виде парафин блоков. 5H1 моноклональные антитела, совсем недавно успешно применяется для окрашивания парафин опухоль тканей, включая рак почки, рак шейки матки, рак мочевого пузыря и меланома 13-18. B7-H1 пятна на парафин или 9,19 криостат 20 секций поджелудочной железы аденокарцинома тканей с ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

EB, КМБ, и HX в равной мере. Это исследование было поддержано SPORE NCI в желудочно-кишечного P50 CA062924, NIH K23 CA148964, Lustgarten фонд, Фонд Viragh, ASCO премия для молодых следователь, NIH 5T32 CA0090701-28 Обучение Грант, Sol Goldman рака поджелудочной железы центр и Национальный фонд поджелудочной железы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге Комментарии
Система CSA Dako K1500 Включает в себя следующие реагенты, упомянутые в протоколе: пероксидаза блок, стрептавидин-биотин комплекса, усиление реагента, стрептавидин-HRP, и DAB субстрат и хромоген
Авидин / биотин блокировка Kit Вектор SP-2001
Блок ACE Serotec BUF029
Биотин анти-мышиных IgG1 BD 553441
Мышь IgG1 K Изотип управления eBioscience 14-4714-85
TBS (трис-буферный раствор), 10X Cellgro 46-012-CM 10xTBS содержит 80 г / л NaCl и 24,2 г / л Тирс;
Разбавленный до 1X с ddH2O для мытья;
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379 1 мл добавляют к 1 л 1X TBS, чтобы TBST
Целевая поиска, 20x Celerus волна 014-3000-000 Разбавленный до 1x с DDH 2 O
190 Доказательство этилового спирта Pharmco-Aaper 111000190
200 Доказательство этилового спирта Pharmo-Aaper 111000200
Ксилол VWR 95057-827
Гематоксилин Ричард Аллан Научно- 72804
Cytoseal 60 Ричард Аллан Научно- 8310-4
Покровные Гранулирование 2940-245
Влажность камеры Сигма H6644
Таблица 1. Реактивов и оборудования.

Ссылки

  1. Flies, D. B., Chen, L. The new B7s: playing a pivotal role in tumor immunity. J. Immunother. 30, 251-260 (2007).
  2. Dong, H., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion. Nat. Med. 5, 1365-1369 (1999).
  3. Curiel, T. J., Wei, S., Dong, H., Alvarez, X., Cheng, P., Mottram, P., Krzysiek, R., Knutson, K. L., et al. Blockade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated antitumor immunity. Nat. Med. 9, 562-567 (2003).
  4. Dong, H., Strome, S. E., Salomao, D. R., Tamura, H., Hirano, F., Flies, D. B., Roche, P. C., Lu, J., Zhu, G. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nat. Med. 8, 793-800 (2002).
  5. Dong, H., Chen, L. B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity. J. Mol. Med. (Berl). 81, 281-287 (2003).
  6. Strome, S. E., Dong, H., Tamura, H., Voss, S. G., Flies, D. B., Tamada, K., Salomao, D., Cheville, J., Hirano, F., Lin, W., Kasperbauer, J. L., Ballman, K. V., Chen, L. B7-H1 blockade augments adoptive T-cell immunotherapy for squamous cell carcinoma. Cancer Res. 63, 6501-6505 (2003).
  7. Hirano, F., Kaneko, K., Tamura, H., Dong, H., Wang, S., Ichikawa, M., Rietz, C., Flies, D. B., Lau, J. S., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity. Cancer Res. 65, 1089-1096 (2005).
  8. Thompson, R. H., Gillett, M. D., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Webster, W. S., Krejci, K. G., Lobo, J. R., Sengupta, S., Chen, L., Zincke, H., Blute, M. L., Strome, S. E., Leibovich, B. C., Kwon, E. D. Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients: Indicator of tumor aggressiveness and potential therapeutic target. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17174-17179 (2004).
  9. Geng, L., Huang, D., Liu, J., Qian, Y., Deng, J., Li, D., Hu, Z., Zhang, J., Jiang, G., Zheng, S. B7-H1 up-regulated expression in human pancreatic carcinoma tissue associates with tumor progression. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 134, 1021-1027 (2008).
  10. Loos, M., Giese, N. A., Kleeff, J., Giese, T., Gaida, M. M., Bergmann, F., Laschinger, M., WB, M., Friess, H. Clinical significance and regulation of the costimulatory molecule B7-H1 in pancreatic cancer. Cancer Lett. 268, 98-109 (2008).
  11. Okudaira, K., Hokari, R., Tsuzuki, Y., Okada, Y., Komoto, S., Watanabe, C., Kurihara, C., Kawaguchi, A., Nagao, S., Azuma, M., Yagita, H., Miura, S. Blockade of B7-H1 or B7-DC induces an anti-tumor effect in a mouse pancreatic cancer model. Int. J. Oncol. 35, 741-749 (2009).
  12. Wang, S., Chen, L. Immunobiology of cancer therapies targeting CD137 and B7-H1/PD-1 cosignal pathways. Curr. Top Microbiol. Immunol. 344, 245-267 (2011).
  13. Thompson, R. H., Webster, W. S., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Leibovich, B. C., Kuntz, S. M., Sengupta, S., Kwon, E. D., Blute, M. L. B7-H1 glycoprotein blockade: a novel strategy to enhance immunotherapy in patients with renal cell carcinoma. Urology. 66, 10-14 (2005).
  14. Thompson, R. H., Kuntz, S. M., Leibovich, B. C., Dong, H., Lohse, C. M., Webster, W. S., Sengupta, S., Frank, I., Parker, A. S., Zincke, H., Blute, M. L., Sebo, T. J., Cheville, J. C., Kwon, E. D. Tumor B7-H1 is associated with poor prognosis in renal cell carcinoma patients with long-term follow-up. Cancer Res. 66, 3381-3385 (2006).
  15. Thompson, R. H., Dong, H., Kwon, E. D. Implications of B7-H1 expression in clear cell carcinoma of the kidney for prognostication and therapy. Clin. Cancer Res. 13, 709s-715s (2007).
  16. Karim, R., Jordanova, E. S., Piersma, S. J., Kenter, G. G., Chen, L., Boer, J. M., Melief, C. J., vander Burg, S. H. Tumor-expressed B7-H1 and B7-DC in relation to PD-1+ T-cell infiltration and survival of patients with cervical carcinoma. Clin. Cancer Res. 15, 6341-6347 (2009).
  17. Inman, B. A., Sebo, T. J., Frigola, X., Dong, H., Bergstralh, E. J., Frank, I., Fradet, Y., Lacombe, L., Kwon, E. D. PD-L1 (B7-H1) expression by urothelial carcinoma of the bladder and BCG-induced granulomata: associations with localized stage progression. Cancer. 109, 1499-1505 (2007).
  18. Brahmer, J. R., Drake, C. G., Wollner, I., Powderly, J. D., Picus, J., Sharfman, W. H., Stankevich, E., Pons, A., Salay, T. M., McMiller, T. L., Gilson, M. M., Wang, C., Selby, M., Taube, J. M., Anders, R., Chen, L., Korman, A. J., Pardoll, D. M., Lowy, I., Topalian, S. L. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. J. Clin. Oncol. 28, 3167-3175 (2010).
  19. Wang, L., Ma, Q., Chen, X., Guo, K., Li, J., Zhang, M. Clinical significance of B7-H1 and B7-1 expressions in pancreatic carcinoma. World J. Surg. 34, 1059-1065 (2010).
  20. Nomi, T., Sho, M., Akahori, T., Hamada, K., Kubo, A., Kanehiro, H., Nakamura, S., Enomoto, K., Yagita, H., Azuma, M., Nakajima, Y. Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death-1 ligand/programmed death-1 pathway in human pancreatic cancer. Clin. Cancer Res. 13, 2151-2157 (2007).
  21. Taube, J. M., Anders, R. A., Young, G. D., Xu, H., Sharma, R., McMiller, T. L., Chen, S., Klein, A. P., Pardoll, D. M., Topalian, S. L., Chen, L. Colocalization of inflammatory response with B7-h1 expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune escape. Sci. Transl. Med. 4, 127ra37(2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

DAB
Иммуногистохимического окрашивания B7-H1 (PD-L1) на Парафиновые Слайды из ткани поджелудочной железы аденокарцинома
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.